Name: preparing irradiated and marked male aedes aegypti mosquitoes for release in an operational sterile insect technique program
Uploaded: 2021-03-12T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program at JoVE.com

我们感谢R.-D.博士。佛罗里达州圣奥古斯丁阿纳斯塔西娅蚊子控制区的Xue，C. Bibbs，W. Qualls和V. Aryaprema合作开发SIT计划和专家对不育雄性 埃及伊蚊的有效操作释放。这项研究得到了USDA-ARS和佛罗里达州农业和消费者服务部（FDACS）的支持。本出版物中提及的商品名称或商业产品仅用于提供特定信息，并不意味着美国农业部或FDACS的推荐或认可。

<ol>
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所有作者均声明不存在利益冲突。

启动以使用辐射的昆虫不育技术为特征的控制计划需要建立当地的 埃及伊蚊菌株。这一步至关重要，可以让SIT真正与类似的控制技术区分开来。通过从当地的蚊子菌株开发该项目，产生的雄性可能会具有使它们能够适应环境变化和线索的行为，并与附近的野生雌性定位和交配。此外，与释放非本地转基因蚊子相比，释放受辐照的当地雄性蚊子可能不会产生负面舆论，例如，释放一种非本地转基因蚊子，例如，可以将新的等位基因引入当地蚊子种群。
花费大量资源饲养大量蚊子，却只能将其中约一半用于控制目的，这是 埃及伊蚊 昆虫不育技术计划的局限性。应改进饲养方案，将幼虫的成熟压缩到更明确的时间范围内，届时蛹将准备就绪。这将允许在最佳分离时间收集更多的蛹。然而，额外的蛹需要处理会增加收集蛹时更多雌性化蛹的风险，因此增加了雌性最终与雄性一起进入培养皿并可能被释放的可能性。尽管受辐照的雌 性埃及伊蚊 的寿命、摄血行为和产卵行为在成虫中有所减少，但偶然释放雌性与受辐照的雄性一起释放并不是一个好的策略22.因此，应继续优先考虑尽量减少无意中与雄性分开、照射、标记和释放的雌性数量。
昆虫不育技术计划的成功最终取决于蜂群饲养的辐射雄性的成功配偶竞争。保持雄性竞争力依赖于详尽的实验衍生剂量选择，并最大限度地提高种群中不育：野生雄性的估计比例。剂量选择由几个关键因素决定，包括寿命、生育能力、繁殖力和蛹死亡率。据观察，雄性蚊子将表现出随着辐射增加而接近零的渐近生育曲线（KJL，RLA，SCB未发表的数据）。同时，雄性蚊子的寿命和活动水平随着辐射剂量的增加呈指数级下降（KJL，RLA，SCB未发表的数据）。因此，与其确定男性产生 99.9% 不育率的剂量，不如在支持生存的同时关注较低的不育百分比。一旦确定的剂量范围不能区分受辐照雄鱼与未受辐照雄鱼的寿命或蛹死亡率，就应对生育能力进行进一步评估，以确定使雄性绝大多数不育但具有竞争力的剂量。
同时，将种群中雄性蚊子的数量与释放的受辐射雄性蚊子的数量进行比较至关重要。这可以通过从同一位置以及SIT计划开始之前，期间和之后从目标释放区域内和周围的不同位置重复收集雄性来实现。应进行标记、释放、重新捕获研究，以评估野生雄性蚊子与释放蚊子的比例。标记、释放、重新捕获研究依赖于从特定点释放已知数量的标记蚊子，然后它们在初始释放点附近的点重新捕获。通过比较距离释放点的重新捕获的雄性和野生雄性的数量，可以估计该地区雄性的一般野生种群，以便释放不育雄性的竞争比例23。通过释放更多的不育雄性和/或通过经典控制手段（如源头减少、未成熟对照或杀成虫处理）减少野生种群，可以实现不育：野生雄性比例的最大化。
为了衡量不育雄性释放的有效性，可以按时间顺序将成人收集与非干预区域进行比较。随着不育雄性被释放，并且与可比较的非干预区域相比，一个地区收集的雄性和雌性数量减少，那么可以假设这是由于释放的不育雄性成功地胜过当地可育雄性。在干预和非干预部位部署的产卵捕集杯中也可以观察到这种效果。卵仍然可以在干预部位产生，但如果孵化次数少于非干预部位的孵化次数，则可以假设它们没有受精，因为雌性与不育的雄配。越来越多的未受精卵产卵最终可能导致产卵减少，因为干预部位没有更换雌性8，24。
昆虫不育技术技术和计划的未来方向自然会扩展到其他医学上重要的蚊子种类。例如，鉴于埃及伊蚊和白纹伊蚊的生物组学非常相似，这项技术可能很容易适应控制白纹伊蚊。其他感兴趣的病媒蚊种包括五筋膜库蚊、跗骨库蚊和各种按蚊属。提高这项技术的功效取决于增加在特定时间产生的雄蛹的能力，这可以通过遗传操作或人工选择来实现，并提高雄性竞争力，这可以通过增加阳刚之气、生育能力或寿命来实现。
归根结底，昆虫不育技术计划并不是控制蚊子的灵丹妙药。相反，它们是一套其他控制技术（如IVM程序）中的工具，可以交叉补偿技术之间的弱点。例如，虽然化学控制提供了快速和廉价的控制，但它也助长了耐药性和非目标死亡率的发展;虽然昆虫不育技术具有物种特异性，不太可能产生抗药性，但必须永久生产和释放昆虫不育技术雄性昆虫不育技术，以控制来自病媒控制区以外的移民种群。

蚊媒病原体传播给人类每年在全世界造成数百万例疾病和死亡。在没有针对寨卡或登革热等蚊媒疾病的有效、经批准的疫苗的情况下，减少传播的最有效方法之一是减少病媒蚊子数量。令人烦恼的是，越来越多的蚊子物种，传统上以杀虫剂为目标，显示出越来越高的杀虫剂抗性水平1。与此同时，政府机构积极取消注册或禁止以前批准的杀虫剂，并且很少有新的，有效的化学控制措施正在制定2，3。这一系列阻碍蚊子控制的障碍促使人们探索替代的非化学技术来减少蚊子数量。
某些蚊子种类对控制抗药性和农药登记问题提出了挑战。埃及伊蚊（L.）是一种突出的病媒蚊子，由于该物种利用未成熟发育和成虫休息的神秘周边栖息地，因此很难通过传统的综合病媒管理进行控制4，5。与开发住宅周围神秘生境有关的挑战包括难以用杀虫剂喷洒技术到达这些地点，以及公众可能不接受公共卫生病媒控制机构反复进入私人财产进行密集监测和控制活动，这些活动对于有效综合病媒管理至关重要。
幸运的是，昆虫不育技术，一种被证明可以持久控制其他极具挑战性的昆虫物种6的方法，正在佛罗里达州圣奥古斯丁的一系列开创性实验和操作试验中应用于埃及伊蚊问题（KJL，RLA，SCB 未发表的数据）。昆虫不育技术已被应用于包括蚊子在内的一系列昆虫物种，并已进行了深入的审查7，8。昆虫不育技术利用大量释放经过绝育的群体饲养的雄性，例如，通过暴露于电离辐射或化学物质来压倒雌性自然种群的配偶选择。与野生雌配的绝育雄性由于雄性配子遭受的损害而使卵不育，如果存在足够数量，理论上可以破坏埃及伊蚊的自然种群。
启动了一项昆虫不育技术计划，试图减少佛罗里达州大西洋沿岸城市地区的 埃及伊蚊 数量，该物种最近重新定居，并且正在扩大并给寨卡病毒、登革热或基孔肯雅热等病毒的传播带来公共卫生风险。为了最大限度地发挥与野生雌性相容的潜力，利用目标种群中野生捕获的 埃及伊蚊 建立了一个新的菌落，为计划9生产雄性。这是基于一个假设，即当地衍生的、殖民地饲养的雄性更有可能与当地的野生雄性竞争与当地的野生雌配。为了使昆虫不育技术有效，不仅目标区域需要有大量的不育雄性蚊子，而且还必须能够有效地与当地的野生雌性蚊子求偶和交配。
进行了一系列实验，以确定释放的最佳不育雄性数量（KJL，RLA，SCB 未发表的数据）以及使雄性不育而不干扰生存、行为或野生雌性接受的最佳辐射剂量（KJL、RLA、SCB 未发表的数据）。这些数据即将出现在该小组的联合出版物中，但其中一些发现也在本协议中捕获，并且可以用作其他地方新的昆虫不育技术埃及 伊蚊 控制计划的起点。该物种正在不断扩大其范围，昆虫不育技术计划显示出成为控制该种群的具有成本效益的长期解决方案的巨大希望。该协议的目的是在一项有效的公共卫生媒介控制计划中，生产经过绝育的雄性、群体饲养的埃及 伊 蚊，以便系统地释放到室外区域，以破坏当地 埃及伊蚊 种群的自然繁殖周期。
虽然已经发布了用于生产转基因埃及伊蚊雄性的类似协议和工作流程，并在其他地方发布了伊蚊 SIT 或基于沃尔巴克氏体的不相容程序的生产工作流程，但该协议说明了现有协议如何适用于埃及伊蚊的生产、雄性蛹的分离和辐照、标记和包装成年雄性，以及运送到该计划的发布地点9， 10，11，12，13，14，15，16，17，18.该协议的标记组件在成熟的操作SIT程序中可能不需要;但是，它已被包括在这里，因为它是在建立SIT计划的早期监测功效和控制整个过程质量的一种方法。蚊虫控制计划通常由地方当局运行，因此它们在其组织的许多方面可能会有很大差异，从规模和资金基础到调整控制策略以最大限度地提高当地成功率。因此，应评估此处描述的协议与可用资源的兼容性。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-1/8&#34; wrench (1&#34; (1 inch) = 2.54 cm)</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>CMMT44707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL)</td>
			<td>Science Supplies WLE corp</td>
			<td>1/2 pint</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; tubing - tygon</td>
			<td>Hudson Extrusions</td>
			<td>LLDPE1/8 X 1/4 BLK</td>
			<td>to attach to CO2 gas regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; brass barb w/ MIP connection</td>
			<td>B&#38;K</td>
			<td>BHB-85NLB</td>
			<td>to attach to CO2 gas regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL graduated plastic beakers with handle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1223-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3000 mL graduated plastic beakers with handle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1223-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult large cage</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1450D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator vials</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver powder</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>290039601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brewers yeast</td>
			<td>MP Biomericals</td>
			<td>02903312-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 regulator</td>
			<td>Randor</td>
			<td>64003038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank (20# canister)</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>CDBEVCARB20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection basin</td>
			<td>Treasure Gurus</td>
			<td>KI-ENAMELBOWL</td>
			<td>for separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls - large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-456-883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deli cups w/lids - 470 mL</td>
			<td>Pactiv DELItainer</td>
			<td>PCTYSD2516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deli cups w/lids - 1900 mL</td>
			<td>Berry Global</td>
			<td>T60764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DoseReader 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dosimetry film</td>
			<td colspan="2">Far West Technology, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flashlight aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - fine featherweight</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4748 or 4750</td>
			<td>featherweight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAFchromic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>radiochromic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammator M</td>
			<td>Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ</td>
			<td></td>
			<td>Cesium-137 irradiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held mechanical aspirator</td>
			<td>Clarke Mosquito</td>
			<td>13500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambskin condoms</td>
			<td>Trojan</td>
			<td>Naturalamb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large CO2 chamber</td>
			<td>Sterilite</td>
			<td colspan="2">Walmart #&#160;568789514</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval rearing pans</td>
			<td>Blue Ridge Thermoforming</td>
			<td>&#160;01-FG-400-3N-ABS</td>
			<td>Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnets - 20# pull</td>
			<td>Master magnetics</td>
			<td>MHHH20BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking dye</td>
			<td>Dayglo</td>
			<td>ECO-11</td>
			<td>Aurora Pink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking dye</td>
			<td>Dayglo</td>
			<td>ECO-17</td>
			<td>Saturn Yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Falk</td>
			<td></td>
			<td>T301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasture pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes - large</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-090 CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes - small (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupa separator</td>
			<td>J.W. Hock</td>
			<td>1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red rubber hose</td>
			<td>Welch</td>
			<td>331040-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release containers</td>
			<td>Science Supplies WLE corp</td>
			<td>1 gallon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands - cross #19</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>ALL37196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands - latitude #64</td>
			<td>Skillcraft</td>
			<td>NSN0589974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>H-4737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed germination paper - Heavy stock 76#</td>
			<td>Anchor Paper</td>
			<td>#76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5&#34;</td>
			<td>MrBoxonline.com</td>
			<td colspan="2">Husky Foam Cooler kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve #20</td>
			<td>Advantech</td>
			<td>20BS8F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve #30</td>
			<td>Advantech</td>
			<td>30BS8F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small cage - Bug Dorm</td>
			<td>MegaView</td>
			<td>Bug Dorm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small CO2 chamber</td>
			<td>Mainstays</td>
			<td colspan="2">Walmart #&#160;562922221</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souffle cup lid</td>
			<td>SOLO</td>
			<td>41165277456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL)</td>
			<td>SOLO</td>
			<td>41165024104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td>ocelo</td>
			<td>MMM7274FD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squeeze bottle</td>
			<td>Dynalon</td>
			<td>3UUP6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stockinette</td>
			<td>BSN Medical</td>
			<td>30-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>extruded polystyrene foam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropical fish flake food</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>4.52 pound</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum chamber - desiccator</td>
			<td>BelArt</td>
			<td>T9FB892757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing irradiated and marked male aedes aegypti mosquitoes for release in an operational sterile insect technique program

对登革热、寨卡和基孔肯雅热等人类疾病的控制依赖于对其媒介埃及 伊蚊 的控制，因为没有预防。蚊媒的控制可以依靠应用于未成熟和成虫阶段的化学品，这可能导致非目标的死亡率，更重要的是，导致病媒中的杀虫剂耐药性。昆虫不育技术（SIT）是一种通过释放与野生雌配以产生无法存活的后代的绝育成年雄性来控制害虫种群的方法。本文描述了生产不育雄性的过程，用于控制 埃及伊蚊 的操作昆虫不育技术计划。这里概述了该计划中使用的步骤，包括饲养和维护一个群体，分离雄性和雌性蛹，照射和标记成年雄性，以及将 埃及伊蚊 雄性运送到释放地点。还讨论了程序警告、计划限制和未来目标。

警惕和充分的蚊子饲养包括蜂群笼中雄性和雌性供应均衡，保持新鲜蔗糖溶液和蜂蜜，以及始终如一的高质量血液喂养。这些条件将提供最适合用于昆虫不育技术幼虫饲养盘的密集包装卵片。正确储存和使用干蛋片，例如系统贴标签以方便从最旧到最新的使用，将支持所有平底锅的均匀阴影。在孵化前将所有幼虫饲养盘装满水可以减少卵片在孵化容器中的时间并促进健康发育。从孵化到化蛹的幼虫盘的维护需要群体人员的仔细参与，因为根据发育阶段和环境变量，一些平底锅可能需要或多或少的食物或额外的水。如果在预定的蛹性别分离日之前发育阶段出现问题，则应在过程中更早地进行调整，例如更早或更晚地孵化，调整食物或改变孵化器温度。
该协议中的饲养过程不会使所有卵及时孵化成可以辐照并用于控制目的的蛹。当蛹需要分离时，20%至50%的蜂群饲养的蚊子仍将是幼虫。然而，这些幼虫并没有被浪费，而是让它们成熟24小时，以产生额外的蛹，这些蛹可以与前一天分离的雌蛹结合并回收回群落笼中。在群落笼中，蛹将被允许成熟为成虫，交配，血液喂养，并产生维持昆虫不育技术项目的卵。
分离蛹，将蛹倒入培养皿中，照射，照射后放入成人笼中必须在一天内完成;因此，应分配足够的时间来舒适地处理所有步骤。放行容器的组装和准备应在标记过程之前完成。当装运箱从放行地点退回时，应检查放行容器并为下次使用做好准备。丢弃湿棉球，晾晒湿释放容器，清洁培养皿，更换网眼，从容器中取出松紧带，在不使用时，将大大延长释放容器的使用寿命。
鉴于 COVID-19 病毒大流行的全球现实，这种通常是多人操作的协议已被修改为每个步骤都可以由一个人在实验室中单独工作。单人方案阻碍最大的步骤是性别、标记、称重和蜂群饲养维护步骤。如果在不同的房间中同时有多个分离器，则一个人按性别分离蛹就足够了。在工作场所发生社交距离的大流行情况下，需要配备多个站点才能完成从性行为到打包的步骤。根据操作员的速度，一个人~4小时对15，000只蚊子进行，然后再花1-2小时来标记，称重和包装它们。两人方案减少了蚊子被麻醉进行标记的时间，并减少了整体工作时间。然而，即使在两人的情况下，由于蚊子镇静期间工作时间有限，每个释放笼分配完整的 2.0 克蚊子也可能具有挑战性。尽管清洁和准备幼虫和成虫饲养材料的过程非常耗时和劳动密集型，但可以对其进行划分，以便各个操作员在大流行期间可以独立安全地工作。
释放成年、标记的、经过辐照的 埃及伊蚊 雄性不在本协议的范围之内，但在此简要介绍。如 表3所示，释放标记的、经过辐照的雄性蚊子的过程首先根据重量（从而推断出不育雄蚊的数量）确定释放容器的均匀释放分布。将货物运送到病媒控制区后，打开箱子，评估释放容器是否存在死亡率或释放容器状况的任何问题。然后让释放容器中的蚊子适应环境温度和湿度1-2小时，然后再运输到治疗区域。在对 埃及伊蚊野生种群的热点进行密集监测后，确定了治疗区的释放点。释放的时间、频率和密度与物种的生物组学以及气象、公众支持和实验室饲养能力相平衡。
由于特定的释放容器与特定的释放位点相匹配，因此在打开释放容器之前，必须通过切割顶部的网眼来交叉检查标签，允许操作员使网状物变形，以便一部分雄性可以逃脱。在容器的每个指定释放点重复这种部分释放方法，直到所有自由飞行的雄性都被释放。然后，在各自分配的发布位置对每个发布容器重复此过程，直到处理完所有容器。或者，在蚊子被释放后，任何没有自由离开的死亡或残疾蚊子都可以收集到培养皿中，并贴上标签，用手计数或称重以纠正估计的释放数量。对目标地区以及可能在非干预控制地点的野生 埃及伊蚊 成虫、卵和未成熟阶段进行持续和普遍的监测，以评估昆虫不育技术操作的有效性。

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Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

昆虫不育技术（SIT）用于控制可能对化学控制具有抗性的特定的、医学上重要的蚊子种群。在这里，我们描述了一种大规模饲养和制备不育雄性蚊子的方法，以便在针对 埃及伊蚊 的操作昆虫不育技术计划中释放。

准备辐照和标记的雄性 埃及伊蚊 ，以便在操作性昆虫技术计划中释放

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...

该协议的独特价值在于，两名人员在小型实验室空间中使用现成的设备可以产生足够的无菌蚊子来支持50英亩的运行SIT计划。这种技术的效率和低成本使得即使是小型蚊虫控制区也能获得，难以增强其综合病媒控制计划。演示该程序的将是我和研究部门的生物科学实验室技术人员芭芭拉·拜耳。要从蛹中饲养成年埃及伊蚊，请准备 60 x 60 x 60 厘米的可折叠铝制养殖笼，带有 0.84 x 0.84 毫米孔大小的玻璃纤维网筛，并在每个笼子的一个垂直壁上放置一个伸手可及的丝袜套筒。在每个饲养笼中以一比一的性别比例放置一个装有埃及伊蚊的 1， 900 毫升塑料杯，并将袖子系好，将杯子放在笼子中，在 28 至 30 摄氏度高于 50% 相对湿度的 12：12 或 14：10 的明暗循环中封闭约 4 天，直到没有更多的成虫出现。将蛹放入饲养笼中24小时后，将装有海绵芯的10%蔗糖溶液容器放入每个笼子中，并从铁丝钩上悬挂浸泡在蜂蜜中的10×2厘米海绵，以分别为成年蚊子提供水分和营养。在大多数成虫每两到三天出现48至72小时后，在接下来的三到四周内，每个笼子在一个小羊皮避孕套中填充50至100毫升去纤维化的牛血，并在热水浴中将避孕套加热至约37摄氏度。用毛巾小心地拍下避孕套后，将部分干燥的避孕套放在笼子内的单个纸衬里的培养皿中 30 到 60 分钟。每次喂血后 48 至 72 小时，将一个 1， 900 毫升的产卵杯，内装有 800 毫升过滤的蛹水，并配有一张 8 至 10 x 30 厘米的种子发芽纸，沿杯子的内周齐平安装到每个笼子中。要从卵中饲养埃及伊蚊幼虫，请使用含有 5， 000 至 10， 000 个卵的产卵纸，并垂直于产卵线切割 3 到 7 厘米的部分。将一块放入一个新的 460 毫升容器中，一半装满自来水和一小撮粉碎的鱼食片。盖上盖子并剧烈搅拌容器至少一分钟，然后将所有内容物倒入装有三升自来水和 50 毫升棕色浆液的幼虫饲养盘中。用开始日期、菌株信息和喂料时间表标记平底锅。一旦达到幼虫盘中幼虫的近似阈值比例，将每个锅的内容物倒入 20 至 40 号筛子中，并使用挤压瓶自来水将蛹和幼虫从筛子中洗出到三升刻度塑料烧杯中。为了将雄蛹与幼虫和雌蛹分开，将每个烧杯的内容物分成多个 1.9 升塑料容器，并在蛹分离器底部的水闸下方放置一个刚性的浅四升收集容器。将两个三升刻度塑料烧杯装满约四分之三的自来水，并将水倒入分离器玻璃板之间的空间，同时调整顶部和底部旋钮，让水连续流过分离器。一旦积水均匀地聚集在距离板底部约 1.25 厘米的高度，用胶带标记分离器底部旋钮的起始位置，并开始将蛹和幼虫的容器倒入分离器中，同时以逆时针方式连续旋转底部旋钮从起始位置一到两厘米。当大部分或全部幼虫通过水闸冲入收集容器时，暂停水流并使用30号筛清除幼虫的收集容器。当所有的幼虫都被移除后，倒入水并再次调整旋钮，让雄蛹被冲入收集容器中。然后将容器中的雄蛹倒入 20 号筛子中，并使用一升挤压瓶自来水将筛子中的蛹洗入单独的 1.9 升容器中。收集完所有雄蛹后，倒入水并调整旋钮以收集雌蛹。使用数字 20 筛将雌蛹转移到新的 1.9 升容器中，如刚才所示。然后倒入水并再次调整旋钮，直到所有未成熟的蚊子都从分离器中冲洗出来。用筛子过滤收集的雄蛹，并将便便清洗到一升刻度烧杯中，用尽可能少的水。小心地将蛹倒入衬有湿滤纸的培养皿中。使用新鲜的三毫升牧场移液管从培养皿底部清除积水，以防止工作期间蛹移动。捆扎培养皿和堆叠，然后密封在贴有标签的 3.8 升可重复密封袋中以适合辐照室。为了标记定量批次的成年辐照雄性蚊子，从饲养笼中取出任何营养来源，并将一个笼子放入一个大的二氧化碳室中五到七分钟，敲击容器的侧面以驱逐任何附着在墙壁上的蚊子。在暴露期结束时，将蚊子转移到吸气器小瓶中并再次麻醉蚊子，然后将蚊子摇到白纸覆盖的工作台面上。小心地将所有雄性从工作台面吸入一个新的小瓶中，并重复曝光和收集，直到从所有饲养笼中收集所有成年雄性。在性别分类过程中的某个时刻，生成一个仅包含 25 只成年雄性蚊子的小瓶。收集完所有雄蚊后，在天平上的去皮称重船上称量每只邪恶的蚊子，然后迅速将称重的蚊子倒入装有 50 毫克标记染料的 240 毫升卡片纸容器中。顺时针和逆时针倾斜并旋转容器一整圈，直到所有蚊子都被轻轻涂上一层，然后将蚊子倒入新的称重船中，然后将称重船对折，让蚊子通过 stockinette 套筒引导到释放容器中。当大约两克雄性蚊子被添加到释放容器中时，将袜子套筒绑好，并在释放容器的边框上标记标签胶带，上面写上蚊子的染料颜色、容器编号和总重量。在这个具有代表性的雄性成年埃及伊蚊饲养、辐照和营销实验中，能够从三个饲养笼中收集两克雄性成年蚊子，并从两个笼子中收集两瓶25只雄蚊，以计算每只蚊子的平均重量。其中两批共丢弃了25只雌性。在幼虫饲养周内及时观察性喂养对于产生发育良好的蛹进行分离至关重要。这在男性和女性之间产生了明显的区别，导致标记步骤中女性的出现率较低。除了将它们用于操作的SIT计划外，这些不育雄性还可以广泛用于研究与野生非辐照雄性相比的交配竞争，存活和辐照雄性的传播的实验。修改技术以包括雌性蚊子使我们能够研究意外释放受辐射的雌性蚊子对繁殖力和媒介能力的影响。

Research

JoVE Journal

Biology

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准备辐照和标记的雄性 埃及伊蚊 ，以便在操作性昆虫技术计划中释放

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