Name: preparing irradiated and marked male aedes aegypti mosquitoes for release in an operational sterile insect technique program
Uploaded: 2021-03-12T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program at JoVE.com

Ringraziamo i dottori R.-D. Xue, C. Bibbs, W. Qualls e V. Aryaprema dell'Anastasia Mosquito Control District, St. Augustine, Florida, per la collaborazione nello sviluppo del programma SIT e la visione esperta sull'efficace rilascio operativo di maschi sterili Aedes aegypti. Questa ricerca è stata sostenuta dall'USDA-ARS e dal Dipartimento dell'agricoltura e dei servizi ai consumatori della Florida (FDACS). La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione ha il solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte dell'USDA o della FDACS.

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Tutti gli autori non hanno dichiarato conflitti di interesse.

L'avvio di un programma di controllo con SIT che utilizza radiazioni richiede la creazione di un ceppo locale di Aedes aegypti. Questo passaggio è fondamentale e può consentire a SIT di distinguersi veramente da tecnologie di controllo simili. Sviluppando il progetto da un ceppo locale di zanzara, i maschi generati avranno probabilmente comportamenti che permetteranno loro di adattarsi ai cambiamenti e ai segnali ambientali e di localizzare e accoppiarsi con le femmine selvatiche nelle vicinanze. Inoltre, il rilascio di maschi locali irradiati potrebbe non generare un'opinione pubblica negativa rispetto, ad esempio, al rilascio di un ceppo non locale di zanzare geneticamente modificate che potrebbe, ad esempio, introdurre nuovi alleli nella popolazione locale di zanzare.
Spendere risorse sostanziali per allevare grandi quantità di zanzare solo per essere in grado di utilizzarne circa la metà per scopi di controllo è una limitazione del programma SIT Aedes aegypti . Dovrebbero essere apportati perfezionamenti al protocollo di allevamento per condensare la maturazione delle larve in tempi più definiti quando le pupe saranno pronte. Ciò consentirebbe di raccogliere più pupe nel momento ottimale della separazione. Tuttavia, ulteriori pupe da elaborare aumentano il rischio che più femmine si impupino quando le pupe vengono raccolte e quindi aumentano la probabilità che le femmine finiscano in piastre di Petri con i maschi e possibilmente vengano rilasciate. Sebbene la durata della vita, il comportamento di alimentazione del sangue e il comportamento di ovideposizione nelle femmine irradiate di Aedes aegypti siano ridotti negli adulti, non è una buona strategia rilasciare le femmine incidentalmente accanto ai maschi irradiati22. Pertanto, dovrebbe rimanere una priorità ridurre al minimo il numero di femmine inavvertitamente separate, irradiate, marcate e rilasciate con i maschi.
Il successo di un programma SIT si basa in ultima analisi sul successo della competizione del compagno da parte di maschi irradiati allevati in colonia. Il mantenimento della competitività maschile si basa su una selezione esaustiva della dose derivata sperimentalmente e sulla massimizzazione del rapporto stimato tra maschi sterili e selvatici nella popolazione. La selezione della dose è determinata da diversi fattori chiave che includono longevità, fertilità, fecondità e mortalità pupale. È stato osservato che le zanzare maschi mostreranno una curva di fertilità asintotica che si avvicina allo zero all'aumentare delle radiazioni (dati non pubblicati KJL, RLA, SCB). Allo stesso tempo, la longevità delle zanzare maschi e i livelli di attività diminuiscono esponenzialmente all'aumentare della dose di radiazioni (dati non pubblicati KJL, RLA, SCB). Pertanto, piuttosto che identificare una dose che produce il 99,9% di sterilità nei maschi, è preferibile concentrarsi su una percentuale di sterilità inferiore sostenendo la sopravvivenza. Una volta identificato un intervallo di dosaggio che non differenzi la longevità o la mortalità pupale dei maschi irradiati da quella dei maschi non irradiati, dovrebbero essere condotte ulteriori valutazioni sulla fertilità per identificare una dose che renda i maschi prevalentemente sterili, ma competitivi.
Allo stesso tempo, è fondamentale confrontare il numero di zanzare maschi nella popolazione con quello dei maschi irradiati rilasciati. Ciò può essere ottenuto raccogliendo maschi da varie posizioni all'interno e intorno all'area di rilascio target ripetutamente dalla stessa posizione e prima, durante e dopo l'avvio del programma SIT. Uno studio di marcatura, rilascio, ricattura dovrebbe essere condotto per valutare il rapporto tra zanzare maschi selvatiche e zanzare rilasciate. Uno studio di marcatura, rilascio, ricattura si basa sul rilascio di un numero noto di zanzare marcate da un punto specifico e sulla loro successiva ricattura in punti in prossimità del punto di rilascio iniziale. Confrontando il numero di maschi ricatturati e maschi selvatici a distanze dal punto di rilascio, è possibile stimare la popolazione selvatica generale di maschi nell'area in modo che i rapporti competitivi dei maschi sterili possano essere rilasciati23. Massimizzare il rapporto tra maschi sterili e selvatici può essere ottenuto rilasciando più maschi sterili e / o riducendo la popolazione selvatica con mezzi di controllo classici come la riduzione della fonte, il controllo immaturo o i trattamenti adulticidi.
Per valutare l'efficacia dei rilasci maschili sterili, le collezioni di adulti possono essere confrontate cronologicamente con un'area di non intervento. Poiché i maschi sterili vengono rilasciati e il numero di maschi e femmine raccolti in un'area diminuisce in relazione a un'area di non intervento comparabile, allora si può ipotizzare che ciò sia dovuto al fatto che i maschi sterili rilasciati superano con successo i maschi fertili locali. Questo effetto può essere osservato anche nelle coppe trappola di ovideposizione dispiegate sia nei siti di intervento che in quelli di non intervento. Le uova possono ancora essere prodotte nel sito di intervento, ma se si schiudono meno di quelle provenienti dal sito di non intervento, si può ipotizzare che non vengano fecondate a causa dell'accoppiamento delle femmine con maschi sterili. Sempre più ovideposizioni di uova non fecondate potrebbero alla fine portare a una riduzione della deposizione delle uova a causa della mancata sostituzione delle femmine nel sito di intervento 8,24.
Le direzioni future della tecnologia e dei programmi SIT si espandono naturalmente in ulteriori specie di zanzare importanti dal punto di vista medico. Ad esempio, questa tecnologia può essere facilmente adattata per controllare Aedes albopictus, data la bionomia molto simile di Aedes aegypti e Aedes albopictus. Altre specie di zanzare vettore di malattie di interesse includono Culex quinquefasciatus, Culex tarsalis e varie specie di Anopheles. Il miglioramento dell'efficacia di questa tecnologia dipende dall'aumento della capacità delle pupe maschili prodotte in un dato momento, che potrebbe essere raggiunta attraverso la manipolazione genetica o la selezione artificiale, e dal miglioramento della competitività maschile, che potrebbe essere raggiunta aumentando la virilità, la fertilità o la longevità.
In definitiva, i programmi SIT non sono un proiettile d'argento per il controllo delle zanzare. Sono invece uno strumento in una suite di altre tecniche di controllo, come i programmi IVM, che compensano in modo incrociato le debolezze tra le tecniche. Ad esempio, mentre il controllo chimico offre un controllo rapido ed economico, favorisce anche lo sviluppo di resistenza e mortalità non bersaglio; e mentre il SIT è specie-specifico e non è probabile che generi resistenza, i maschi SIT devono essere prodotti e rilasciati in perpetuo per controllare le popolazioni immigrate al di fuori del distretto di controllo dei vettori.

La trasmissione di agenti patogeni trasmessi dalle zanzare all'uomo causa milioni di casi di malattie e decessi ogni anno in tutto il mondo. In assenza di vaccini efficaci e approvati per le malattie trasmesse dalle zanzare, come Zika o la febbre dengue, uno dei modi più efficaci per ridurre la trasmissione è ridurre le popolazioni di zanzare vettori di malattie. Esasperatamente, un numero crescente di specie di zanzare, tradizionalmente prese di mira dai pesticidi, mostrano livelli crescenti di resistenza ai pesticidi1. Allo stesso tempo, le agenzie governative hanno aggressivamente annullato o vietato pesticidi precedentemente approvati e poche nuove ed efficaci misure di controllo chimico sono state sviluppate 2,3. Questa costellazione di ostacoli al controllo delle zanzare ha motivato l'esplorazione di tecniche alternative non chimiche per ridurre le popolazioni di zanzare.
Alcune specie di zanzare presentano sfide per controllare i problemi di resistenza e registrazione dei pesticidi. Aedes aegypti (L.) è una zanzara vettore di malattie che è estremamente difficile da controllare attraverso la tradizionale gestione integrata dei vettori a causa dell'habitat peridomestico criptico sfruttato da questa specie per lo sviluppo immaturo e il riposo degli adulti 4,5. Le sfide legate allo sfruttamento dell'habitat criptico intorno alle residenze includono la difficoltà di raggiungere questi luoghi con tecniche di irrorazione dei pesticidi e la potenziale mancanza di accettazione da parte del pubblico per l'accesso ripetuto alla proprietà privata per le agenzie di controllo dei vettori di salute pubblica per condurre le intense attività di sorveglianza e controllo cruciali per un'efficace gestione integrata dei vettori (IVM) per questa specie.
Fortunatamente, SIT, un approccio che si è dimostrato efficace per il controllo duraturo di altre specie di insetti altamente impegnative6, viene applicato al problema Aedes aegypti in una serie innovativa di esperimenti e prove operative con sede a St. Augustine, in Florida (dati non pubblicati KJL, RLA, SCB). Il SIT è stato applicato a una serie di specie di insetti, comprese le zanzare, ed è stato esaminato in profondità 7,8. SIT sfrutta il rilascio di massa di maschi allevati in colonia sterilizzati, ad esempio, dall'esposizione a radiazioni ionizzanti o sostanze chimiche per sopraffare la scelta del compagno delle popolazioni naturali di femmine. I maschi sterilizzati che si accoppiano con femmine selvatiche rendono le uova sterili a causa dei danni subiti dai gameti maschili e, se presenti in numero sufficiente, possono teoricamente far crollare la popolazione naturale di Aedes aegypti.
Un programma SIT è stato avviato per tentare di ridurre le popolazioni di Aedes aegypti in un'area urbana nella Florida costiera atlantica dove questa specie è stata recentemente ricolonizzata e si sta espandendo e presentando un rischio per la salute pubblica per la trasmissione di virus come Zika, dengue o chikungunya. Per massimizzare il potenziale di compatibilità con le femmine selvatiche, è stata istituita una nuova colonia utilizzando Aedes aegypti catturato in natura dalla popolazione target per produrre maschi per il programma9. Ciò si basava sull'ipotesi che i maschi allevati localmente e allevati in colonia avrebbero maggiori probabilità di essere competitivi con i maschi selvatici locali per l'accoppiamento con le femmine selvatiche locali. Affinché il SIT sia efficace, non solo un numero schiacciante di maschi sterili deve essere presente nell'area bersaglio, ma devono anche essere in grado di corteggiare e accoppiarsi efficacemente con le zanzare femmine selvatiche locali.
È stata condotta una serie di esperimenti per determinare il numero ottimale di maschi sterili da rilasciare (dati non pubblicati KJL, RLA, SCB) e dosi ottimali di radiazioni che renderebbero i maschi sterili senza interferire con la sopravvivenza, il comportamento o l'accettazione da parte delle femmine selvatiche (dati non pubblicati KJL, RLA, SCB). Questi dati sono disponibili nelle pubblicazioni alleate di questo gruppo, ma alcuni di questi risultati sono catturati anche in questo protocollo e potrebbero essere utilizzati come punto di partenza per nuovi programmi di controllo SIT Aedes aegypti altrove. Questa specie sta espandendo costantemente il suo areale e i programmi SIT mostrano grandi promesse di essere soluzioni economiche e a lungo termine per controllare questa popolazione. L'obiettivo di questo protocollo è quello di produrre zanzare Aedes aegypti sterilizzate, maschi, allevate in colonia per il rilascio sistematico in aree esterne per interrompere i cicli riproduttivi naturali delle popolazioni locali di Aedes aegypti in un programma operativo di controllo del vettore di salute pubblica.
Mentre protocolli e flussi di lavoro simili sono stati pubblicati per la produzione di maschi transgenici di Aedes aegypti e flussi di lavoro di produzione per Aedes SIT, o programmi di incompatibilità basati su Wolbachia sono stati pubblicati altrove, questo protocollo illustra come i protocolli esistenti sono stati adattati per la produzione, la separazione e l'irradiazione di Aedes aegypti di pupe maschili, la marcatura e l'imballaggio di maschi adulti e la spedizione al sito di rilascio per questo programma 9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Il componente di marcatura di questo protocollo potrebbe non essere richiesto in un programma SIT operativo maturo; tuttavia, è stato incluso qui perché è un modo per monitorare l'efficacia e controllare la qualità dell'intero processo nei primi anni di istituzione del programma SIT. I programmi di controllo delle zanzare sono in genere gestiti dalle autorità locali, quindi possono variare ampiamente in molti aspetti della loro organizzazione, dalle dimensioni e dalla base di finanziamento alla messa a punto delle tattiche di controllo per massimizzare il successo locale. Pertanto, il protocollo qui descritto dovrebbe essere valutato per la compatibilità con le risorse disponibili.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-1/8&#34; wrench (1&#34; (1 inch) = 2.54 cm)</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>CMMT44707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL)</td>
			<td>Science Supplies WLE corp</td>
			<td>1/2 pint</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; tubing - tygon</td>
			<td>Hudson Extrusions</td>
			<td>LLDPE1/8 X 1/4 BLK</td>
			<td>to attach to CO2 gas regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; brass barb w/ MIP connection</td>
			<td>B&#38;K</td>
			<td>BHB-85NLB</td>
			<td>to attach to CO2 gas regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL graduated plastic beakers with handle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1223-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3000 mL graduated plastic beakers with handle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1223-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult large cage</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1450D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator vials</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver powder</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>290039601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brewers yeast</td>
			<td>MP Biomericals</td>
			<td>02903312-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 regulator</td>
			<td>Randor</td>
			<td>64003038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank (20# canister)</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>CDBEVCARB20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection basin</td>
			<td>Treasure Gurus</td>
			<td>KI-ENAMELBOWL</td>
			<td>for separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls - large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-456-883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deli cups w/lids - 470 mL</td>
			<td>Pactiv DELItainer</td>
			<td>PCTYSD2516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deli cups w/lids - 1900 mL</td>
			<td>Berry Global</td>
			<td>T60764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DoseReader 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dosimetry film</td>
			<td colspan="2">Far West Technology, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flashlight aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - fine featherweight</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4748 or 4750</td>
			<td>featherweight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAFchromic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>radiochromic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammator M</td>
			<td>Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ</td>
			<td></td>
			<td>Cesium-137 irradiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held mechanical aspirator</td>
			<td>Clarke Mosquito</td>
			<td>13500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambskin condoms</td>
			<td>Trojan</td>
			<td>Naturalamb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large CO2 chamber</td>
			<td>Sterilite</td>
			<td colspan="2">Walmart #&#160;568789514</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval rearing pans</td>
			<td>Blue Ridge Thermoforming</td>
			<td>&#160;01-FG-400-3N-ABS</td>
			<td>Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnets - 20# pull</td>
			<td>Master magnetics</td>
			<td>MHHH20BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking dye</td>
			<td>Dayglo</td>
			<td>ECO-11</td>
			<td>Aurora Pink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking dye</td>
			<td>Dayglo</td>
			<td>ECO-17</td>
			<td>Saturn Yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Falk</td>
			<td></td>
			<td>T301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasture pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes - large</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-090 CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes - small (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupa separator</td>
			<td>J.W. Hock</td>
			<td>1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red rubber hose</td>
			<td>Welch</td>
			<td>331040-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release containers</td>
			<td>Science Supplies WLE corp</td>
			<td>1 gallon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands - cross #19</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>ALL37196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands - latitude #64</td>
			<td>Skillcraft</td>
			<td>NSN0589974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>H-4737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed germination paper - Heavy stock 76#</td>
			<td>Anchor Paper</td>
			<td>#76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5&#34;</td>
			<td>MrBoxonline.com</td>
			<td colspan="2">Husky Foam Cooler kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve #20</td>
			<td>Advantech</td>
			<td>20BS8F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve #30</td>
			<td>Advantech</td>
			<td>30BS8F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small cage - Bug Dorm</td>
			<td>MegaView</td>
			<td>Bug Dorm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small CO2 chamber</td>
			<td>Mainstays</td>
			<td colspan="2">Walmart #&#160;562922221</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souffle cup lid</td>
			<td>SOLO</td>
			<td>41165277456</td>
			<td></td>
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			<td>Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL)</td>
			<td>SOLO</td>
			<td>41165024104</td>
			<td></td>
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		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td>ocelo</td>
			<td>MMM7274FD</td>
			<td></td>
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		<tr>
			<td>Squeeze bottle</td>
			<td>Dynalon</td>
			<td>3UUP6</td>
			<td></td>
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		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5</td>
			<td></td>
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		<tr>
			<td>Stockinette</td>
			<td>BSN Medical</td>
			<td>30-1006</td>
			<td></td>
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		<tr>
			<td>Styrofoam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>extruded polystyrene foam</td>
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		<tr>
			<td>Tropical fish flake food</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>4.52 pound</td>
			<td></td>
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		<tr>
			<td>Vaccum chamber - desiccator</td>
			<td>BelArt</td>
			<td>T9FB892757</td>
			<td></td>
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		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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preparing irradiated and marked male aedes aegypti mosquitoes for release in an operational sterile insect technique program

Il controllo di malattie umane come dengue, Zika e chikungunya si basa sul controllo del loro vettore, la zanzara Aedes aegypti , perché non c'è prevenzione. Il controllo dei vettori di zanzare può fare affidamento su sostanze chimiche applicate agli stadi immaturi e adulti, che possono contribuire alla mortalità dei non bersagli e, soprattutto, portare alla resistenza agli insetticidi nel vettore. La tecnica degli insetti sterili (SIT) è un metodo per controllare le popolazioni di parassiti attraverso il rilascio di maschi adulti sterilizzati che si accoppiano con femmine selvatiche per produrre prole non vitale. Questo articolo descrive il processo di produzione di maschi sterili da utilizzare in un programma SIT operativo per il controllo delle zanzare Aedes aegypti . Descritti qui sono i passaggi utilizzati nel programma, tra cui l'allevamento e il mantenimento di una colonia, la separazione delle pupe maschili e femminili, l'irradiazione e la marcatura dei maschi adulti e la spedizione dei maschi di Aedes aegypti al sito di rilascio. Vengono inoltre discussi avvertimenti procedurali, limitazioni del programma e obiettivi futuri.

Un allevamento vigile e adeguato delle zanzare consiste in una disponibilità equilibrata di maschi e femmine in gabbie di colonia, nel mantenimento di soluzione fresca di saccarosio e miele e in un'alimentazione costante di sangue di alta qualità. Queste condizioni forniranno fogli di uova densamente imballati ottimali per l'uso nelle vaschette di allevamento larvale SIT. La corretta conservazione e l'uso di fogli di uova essiccati, come l'etichettatura sistematica per facilitare l'uso dal più vecchio al più recente, supporteranno una schiusa uniforme su tutte le pentole. Riempire tutte le vaschette di allevamento larvale con acqua prima della schiusa può ridurre il tempo per il quale i fogli di uova sono in contenitori di schiusa e promuovere uno sviluppo sano. La manutenzione delle vasche larvali dalla schiusa alla pupa richiede un attento impegno da parte del personale della colonia poiché alcune pentole potrebbero aver bisogno di più o meno cibo o acqua aggiuntiva a seconda delle fasi di sviluppo e delle variabili ambientali. Se ci sono problemi con lo stadio di sviluppo entro il giorno programmato della separazione del sesso pupale, le regolazioni dovrebbero essere apportate prima nel processo, come la schiusa prima o dopo, la regolazione del cibo o la modifica della temperatura dell'incubatrice.
Il processo di allevamento in questo protocollo non fa sì che tutte le uova si schiudano in tempo per svilupparsi in pupe che possono essere irradiate e utilizzate a fini di controllo. Tra il 20 e il 50% delle zanzare allevate in colonia saranno ancora larve nel momento in cui le pupe dovranno essere separate. Tuttavia, queste larve non vengono sprecate, ma lasciate maturare per 24 ore per rendere ulteriori pupe che possono essere combinate con pupe femmine dalla separazione del giorno precedente e riciclate di nuovo nelle gabbie delle colonie. Nelle gabbie delle colonie, le pupe potranno maturare in adulti, accoppiarsi, nutrirsi con il sangue e produrre uova che sostengono il progetto SIT.
La separazione delle pupe, il versamento delle pupe nelle piastre di Petri, l'irradiazione e il posizionamento in gabbie per adulti dopo l'irradiazione devono avvenire in un giorno; Pertanto, è necessario assegnare un tempo adeguato per elaborare comodamente tutte le fasi. L'assemblaggio e la preparazione dei contenitori di rilascio devono essere effettuati prima del processo di marcatura. Quando le scatole di spedizione vengono restituite dal sito di rilascio, i contenitori di rilascio devono essere ispezionati e preparati per il loro prossimo utilizzo. Scartare batuffoli di cotone bagnati, arieggiare i contenitori a rilascio umido, pulire le piastre di Petri, sostituire la rete e rimuovere gli elastici dal contenitore, mentre non in uso, prolungherà notevolmente la vita dei contenitori di rilascio.
Data la realtà mondiale della pandemia virale COVID-19, questo protocollo che è tipicamente un'operazione multi-persona è stato modificato per essere trattabile da una persona che lavora da sola in un laboratorio per ogni fase. Le fasi del processo che sono maggiormente ostacolate da uno scenario di una sola persona sono le fasi di mantenimento del sesso, della marcatura, della pesatura e dell'allevamento delle colonie. Separare le pupe per sesso da una persona dovrebbe essere sufficiente se ci sono più separatori che operano contemporaneamente in stanze diverse. In una situazione di pandemia in cui si verifica il distanziamento sociale sul posto di lavoro, è necessario dotare più stazioni per completare i passaggi dal sesso all'imballaggio. A seconda della velocità dell'operatore, ci vuole una persona ~ 4 h per sesso 15.000 zanzare e poi un'altra 1-2 h per contrassegnarle, pesarle e confezionarle. Uno scenario a due persone diminuisce il tempo durante il quale le zanzare vengono anestetizzate per la marcatura e riduce il tempo di lavoro complessivo. Tuttavia, anche in uno scenario di due persone, allocare l'intero 2,0 g di zanzare per gabbia di rilascio può essere difficile a causa del tempo di lavoro limitato mentre le zanzare sono sedate. Sebbene il processo di pulizia e preparazione dei materiali di allevamento larvali e adulti sia estremamente dispendioso in termini di tempo e manodopera, può essere suddiviso in modo tale che i singoli operatori possano lavorare in modo indipendente e sicuro durante una pandemia.
Il rilascio di maschi adulti, marcati e irradiati di Aedes aegypti esula dall'ambito di questo protocollo, ma è presentato qui in breve. Il processo di rilascio di zanzare maschi marcate e irradiate inizia determinando una distribuzione uniforme del rilascio dei contenitori di rilascio in base ai pesi (e quindi al numero dedotto di maschi sterili), come riportato nella Tabella 3. Dopo che le spedizioni sono state consegnate al distretto di controllo vettoriale, le scatole vengono aperte e i contenitori di rilascio valutati per eventuali problemi di mortalità o condizioni dei contenitori di rilascio. Le zanzare nei contenitori di rilascio sono quindi autorizzate ad acclimatarsi alla temperatura e all'umidità ambiente per 1-2 ore prima del trasporto nell'area di trattamento. I siti di rilascio nell'area di trattamento sono identificati dopo un'intensa sorveglianza per i punti caldi delle popolazioni selvatiche di Aedes aegypti. La tempistica, la frequenza e la densità dei rilasci sono bilanciate dalla bionomia della specie, nonché dalla meteorologia, dal sostegno pubblico e dalle capacità di allevamento in laboratorio.
Poiché i contenitori di rilascio specifici sono abbinati a particolari siti di rilascio, l'etichetta deve essere sottoposta a un controllo incrociato prima dell'apertura del contenitore di rilascio tagliando la rete sulla parte superiore, consentendo all'operatore di deformare la rete in modo che una parte dei maschi possa fuoriuscire. Questo metodo di rilascio frazionario viene ripetuto in ogni punto di rilascio assegnato per il contenitore fino a quando tutti i maschi che volano liberamente sono stati rilasciati. Questo processo viene quindi ripetuto per ogni contenitore di rilascio nella rispettiva posizione di rilascio assegnata fino a quando tutti i contenitori non sono stati elaborati. Facoltativamente, dopo che le zanzare sono state rilasciate, tutte le zanzare morte o disabili che non se ne sono andate liberamente possono essere raccolte in piastre di Petri ed etichettate per essere contate a mano o pesate per correggere il numero stimato rilasciato. La sorveglianza continua e pervasiva degli stadi adulti, delle uova e immaturi di Aedes aegypti selvatici nell'area bersaglio, e possibilmente nei siti di controllo non di intervento, è condotta per valutare l'efficacia dell'operazione SIT.

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Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

La tecnica degli insetti sterili (SIT) viene utilizzata per controllare specifiche popolazioni di zanzare importanti dal punto di vista medico che possono essere resistenti ai controlli chimici. Qui, descriviamo un metodo di allevamento di massa e preparazione di zanzare maschi sterili per il rilascio in un programma SIT operativo mirato alla zanzara Aedes aegypti .

Preparazione di zanzare Aedes aegypti maschi irradiate e marcate per il rilascio in un programma operativo di tecnica degli insetti sterili

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...

Il valore unico di questo protocollo è che due persone che utilizzano attrezzature prontamente disponibili in piccoli spazi di laboratorio possono produrre abbastanza zanzare sterili per supportare un programma SIT operativo di 50 acri. L'efficienza e il basso costo di questa tecnica la rendono accessibile, intrattabile anche per i piccoli distretti di controllo delle zanzare per aumentare il loro programma di controllo vettoriale integrato. A dimostrare la procedura saremo io e Barbara Bayer, tecnici di laboratorio di scienze biologiche dell'unità di ricerca.Per allevare Aedes aegypti adulto dalle pupe, preparare gabbie di allevamento in alluminio pieghevoli da 60 per 60 per 60 centimetri con uno schermo in rete di fibra di vetro di dimensioni di 0,84 x 0,84 millimetri e un manicotto di calza a portata di mano su una parete verticale di ciascuna gabbia. Posizionare un bicchiere di plastica da 1.900 millilitri con pupe Aedes aegypti in un rapporto di uno a uno in ogni gabbia di allevamento e legare la manica chiusa, lasciando le tazze in gabbie per l'eclosione per circa quattro giorni a 28-30 gradi Celsius superiore al 50% di umidità relativa in un ciclo luce:buio 12:12 o 14:10 fino a quando non emergono più adulti. 24 ore dopo aver posizionato le pupe nelle gabbie di allevamento, posizionare un contenitore di soluzione di saccarosio al 10% con uno stoppino di spugna in ogni gabbia e sospendere una spugna di 10 per 2 centimetri imbevuta di miele da un gancio metallico per fornire rispettivamente idratazione e nutrimento alle zanzare adulte.Da 48 a 72 ore dopo che la maggior parte degli adulti è emersa ogni due o tre giorni per le successive tre o quattro settimane, riempire il preservativo di pelle di agnello con 50-100 millilitri di sangue bovino defibrinato per gabbia e riscaldare i preservativi a circa 37 gradi Celsius in un bagno di acqua calda. Dopo aver accuratamente tamponato i preservativi con l'asciugamano, posizionare i preservativi parzialmente asciutti in singole piastre di Petri rivestite di carta all'interno delle gabbie per 30-60 minuti. Da 48 a 72 ore dopo ogni poppata di sangue, posizionare una tazza di ovodeposizione da 1.900 millilitri contenente 800 millilitri di acqua di pupa filtrata e fornita con un foglio da 8 a 10 per 30 centimetri di carta per la germinazione dei semi montato a filo lungo la circonferenza interna della tazza in ciascuna gabbia.Per allevare le larve di Aedes aegypti dalle uova, utilizzare una carta di ovideposizione con 5.000 a 10.000 uova presenti e tagliare una sezione da tre a sette centimetri perpendicolare alla linea di ovideposizione. Mettere il pezzo in un nuovo contenitore da 460 millilitri riempito per metà con acqua di rubinetto e un pizzico di fiocchi di cibo per pesci polverizzati. Coprire e agitare vigorosamente il contenitore per almeno un minuto prima di versare l'intero contenuto in una padella larvale contenente tre litri di acqua di rubinetto e 50 millilitri di liquame marrone.Contrassegnare la padella con la data di inizio, le informazioni sulla deformazione e il programma di alimentazione. Una volta raggiunta la proporzione approssimativa di larve nelle vasche larvali, versare il contenuto di ciascuna padella attraverso un setaccio da 20 a 40 e utilizzare una bottiglia di acqua di rubinetto per lavare le pupe e le larve dal setaccio in un becher di plastica graduato da tre litri. Per separare le pupe maschili dalle larve e dalle pupe femminili, dividere il contenuto di ciascun becher tra più contenitori di plastica da 1,9 litri e posizionare un contenitore di raccolta rigido da quattro litri poco profondo sotto la chiusa alla base di un separatore di pupale.Riempire due bicchieri di plastica graduati da tre litri pieni di acqua di rubinetto per circa tre quarti e versare l'acqua attraverso lo spazio tra le lastre di vetro del separatore mentre si regolano le manopole superiore e inferiore per consentire all'acqua di fluire continuamente attraverso il separatore. Una volta che l'acqua stagnante si è raccolta uniformemente ad un'altezza di circa 1,25 centimetri dalla base delle piastre, contrassegnare con del nastro adesivo le posizioni di partenza alle manopole inferiori del separatore e iniziare a versare i contenitori di pupe e larve nel separatore ruotando continuamente le manopole inferiori in senso antiorario da uno a due centimetri dalle posizioni di partenza. Quando la maggior parte o tutte le larve hanno lavato attraverso la chiusa nel contenitore di raccolta, mettere in pausa il flusso d'acqua e utilizzare un setaccio numero 30 per liberare il contenitore di raccolta delle larve.Quando tutte le larve sono state rimosse, versare l'acqua e regolare nuovamente le manopole per consentire alle pupe maschili di essere lavate nel contenitore di raccolta. Quindi versare le pupe maschili dal contenitore in un setaccio numero 20 e utilizzare una bottiglia da un litro di acqua del rubinetto per lavare le pupe dal setaccio in un contenitore separato da 1,9 litri. Quando tutte le pupe maschili sono state raccolte, versare l'acqua e regolare le manopole per consentire la raccolta delle pupe femminili.Utilizzando il setaccio numero 20 per trasferire le pupe femmine in un nuovo contenitore da 1,9 litri come appena dimostrato. Quindi versare l'acqua e regolare nuovamente le manopole fino a quando tutte le zanzare immature sono state espulse dal separatore. Filtrare le pupe maschili raccolte con un setaccio e lavare la cacca in un becher graduato da un litro con meno acqua possibile.Versare con cura le pupe in piastre di Petri rivestite con carta da filtro umida in un unico strato. Rimuovere l'acqua stagnante dal fondo della piastra di Petri usando una pipetta da pascolo fresca da tre millilitri per evitare il movimento della pupa durante il lavoro. Impacchettare le piastre e le pile di Petri prima di sigillarle all'interno di un sacchetto richiudibile etichettato da 3,8 litri per adattarsi alla camera di irradiazione.Per contrassegnare lotti quantificati di zanzare maschi irradiate adulte, rimuovere qualsiasi fonte di nutrizione dalla gabbia di allevamento e posizionare una gabbia in una grande camera di anidride carbonica per cinque-sette minuti, battendo i lati del contenitore per rimuovere eventuali zanzare aggrappate alle pareti. Alla fine del periodo di esposizione, trasferire le zanzare in una fiala di aspiratore e anestetizzare nuovamente le zanzare prima di scuotere le zanzare in una superficie di lavoro coperta di carta bianca. Aspirare con cura tutti i maschi dal piano di lavoro in una nuova fiala e ripetere le esposizioni e la raccolta fino a quando tutti i maschi adulti sono stati raccolti da tutte le gabbie di allevamento.Ad un certo punto durante il processo di selezione del sesso, generare una fiala contenente solo 25 zanzare maschi adulti. Quando tutti i maschi sono stati raccolti, pesare ogni vile di zanzare in una barca di pesatura tarata su una bilancia e versare rapidamente le zanzare pesate in un contenitore di cartoncino da 240 millilitri contenente 50 milligrammi di colorante di marcatura. Inclinare e ruotare il contenitore di una rotazione completa in senso orario e antiorario fino a quando tutte le zanzare sono state leggermente rivestite e versare le zanzare in una nuova barca di pesatura, quindi piegare la barca di pesatura a metà per consentire alle zanzare di essere incanalate attraverso la custodia della calza nel contenitore di rilascio.Quando circa due grammi di zanzare maschi sono stati aggiunti al contenitore di rilascio, legare la manica della stockinette chiusa e contrassegnare il nastro adesivo sulla lunetta del contenitore di rilascio con il colore del colorante, il numero del contenitore e il peso totale delle zanzare. In questo esperimento rappresentativo di allevamento di zanzare Aedes aegypti adulto, irradiazione e marketing, due grammi di zanzare adulte maschi sono stati raccolti da tre gabbie di allevamento e insieme a due fiale di 25 maschi da due gabbie per consentire il calcolo del peso medio per zanzara. 25 femmine sono state scartate in totale da due dei lotti.L'alimentazione tempestiva e osservativa durante la settimana di allevamento larvale è fondamentale per generare pupe ben sviluppate per la separazione. Ciò genera una chiara distinzione tra maschi e femmine che porta a una bassa presenza di femmine nelle fasi di marcatura. Oltre ad usarli nei programmi SIT operativi, questi maschi sterili possono anche essere ampiamente utilizzati in esperimenti che studiano la competizione di accoppiamento, la sopravvivenza e la dispersione dei maschi irradiati rispetto ai maschi selvatici non irradiati.La modifica della tecnica per includere le zanzare femmine ci consente di studiare l'impatto del rilascio involontario di femmine irradiate per quanto riguarda la fecondità e la competenza del vettore.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

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