Name: preparing irradiated and marked male aedes aegypti mosquitoes for release in an operational sterile insect technique program
Uploaded: 2021-03-12T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program at JoVE.com

R.-D博士に感謝します。フロリダ州セントオーガスティンのアナスタシア蚊駆除地区のXue、C.Bibbs、W.Qualls、およびV.Aryapremaは、SITプログラムの開発におけるパートナーシップと、不妊オスの ネッタイシマカの効果的な運用放出に関する専門家の洞察を提供します。この研究は、USDA-ARSとフロリダ州農業消費者サービス省(FDACS)の支援を受けました。この出版物での商号または商用製品の言及は、特定の情報を提供することのみを目的としており、USDAまたはFDACSによる推奨または承認を意味するものではありません。

<ol>
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すべての著者は利益相反を宣言していません。

放射線を利用したSITを用いた制御プログラムを開始するには、 ネッタイシマカの局所株の樹立が必要である。このステップは重要であり、SITが同様の制御技術と真に区別することができます。地元の蚊の系統からプロジェクトを開発することにより、生成されたオスは、環境の変化や手がかりに適応し、近くの野生のメスを見つけて交尾することを可能にする行動をとる可能性があります。さらに、照射された局所的な雄の放出は、例えば、例えば、局所的な蚊集団に新規対立遺伝子を導入する可能性のある遺伝子組み換え蚊の非局所株の放出と比較して、否定的な世論を生じさせないかもしれない。
大量の蚊を飼育するためにかなりの資源を費やし、その約半分を制御目的で使用できることは、 ネッタイシマカ SITプログラムの制限です。幼虫の成熟を、蛹の準備が整うより明確な時間枠に凝縮するために、飼育プロトコルを改良する必要があります。これにより、分離の最適な時期により多くの蛹を集めることができます。ただし、処理する蛹を追加すると、蛹が収集されたときにより多くの雌が蛹化するリスクが高まり、したがって、雌が雄と一緒にペトリ皿に行き着き、おそらく解放される可能性が高くなります。照射された雌の ネッタイシマカ の寿命、採血行動、産卵行動は成体では減少しますが、照射された雄と一緒に偶発的に雌を放出することは良い戦略ではありません22。したがって、男性と不注意に分離、照射、マーク、および放出される女性の数を最小限に抑えることが優先事項であり続ける必要があります。
SITプログラムの成功は、最終的にはコロニー飼育され、照射されたオスによる配偶者競争の成功にかかっています。男性の競争力を維持することは、実験的に導き出された用量の徹底的な選択と、集団における不妊:野生の男性の推定比率の最大化に依存しています。用量の選択は、寿命、生殖能力、繁殖力、および蛹の死亡率を含むいくつかの重要な要素によって決定されます。オスの蚊は、放射線が増加するにつれてゼロに近づく漸近生殖能力曲線を示すことが観察されています(KJL、RLA、SCB未発表データ)。同時に、雄の蚊の寿命と活動レベルは、放射線量が増加するにつれて指数関数的に減少します(KJL、RLA、SCBの未発表データ)。したがって、男性で99.9%の不妊をもたらす用量を特定するのではなく、生存を支持しながら、より低い不妊率に焦点を当てることが好ましい。放射線照射された男性の寿命または蛹死亡率を非放射線照射男性のそれと区別しない線量範囲が特定されたら、生殖能力に関する追加の評価を実施して、男性を圧倒的に不妊でありながら競争力のある線量を特定する必要があります。
同時に、集団内のオスの蚊の数を、放出された照射されたオスの数と比較することが重要です。これは、ターゲットリリースエリア内およびその周辺のさまざまな場所から、同じ場所から、およびSITプログラムの開始前、開始中、および開始後に繰り返しオスを収集することによって達成できます。野生のオスの蚊と放出された蚊の比率を評価するために、マーク、放出、再捕獲の研究を実施する必要があります。マーク、リリース、再捕獲の研究は、特定のポイントからの既知の数のマークされた蚊の放出と、最初の放出ポイントの周囲の近接ポイントでのその後の再捕獲に依存しています。放流地点から離れた場所で再捕獲された雄と野生雄の数を比較することにより、不妊雄の競合比率を放流できるように、その地域の雄の一般的な野生個体数を推定することができます23。不妊:野生の雄の比率を最大化することは、より多くの不妊の雄を解放することによって、および/または発生源の減少、未熟な防除、または殺虫処理などの古典的な制御手段によって野生の個体数を減らすことによって達成することができる。
無菌の男性の放出の有効性を測定するために、成人のコレクションを非介入領域と時系列で比較することができます。不妊のオスが解放され、エリア内で収集されたオスとメスの数が同等の非介入エリアと比較して減少するにつれて、それは解放された不妊のオスが地元の肥沃なオスをうまく凌駕したことによるものであると仮定できます。この効果は、介入部位と非介入部位の両方に配備された産卵トラップカップでも観察できます。介入部位ではまだ卵が産生される可能性がありますが、非介入部位の卵よりも孵化が少ない場合は、雌が不妊の雄と交尾するため、受精していないと仮定できます。未受精卵の産卵がますます増えると、介入部位の雌が交代しないため、最終的には産卵が減少する可能性があります8,24。
SIT技術とプログラムの将来の方向性は、自然に医学的に重要な蚊の種にも拡大します。例えば、この技術は、ネッタイシマカとネッタイシマカの非常によく似たバイオノミクスを考えると、ネッタイシマカを制御するために容易に適応できる可能性があります。関心のある他の疾患ベクター蚊種には、アカイエカ、アカイエカ、および様々な ハマダラカ種が含まれる。この技術の有効性を向上させるには、遺伝子操作や人工淘汰によって達成できる特定の時間に生産される雄の蛹の能力を高め、雄の競争力を向上させることに依存しています。
結局のところ、SITプログラムは蚊を制御するための特効薬ではありません。代わりに、IVMプログラムなどの他の一連の制御技術のツールであり、技術間の弱点を相互補償します。たとえば、化学的制御は迅速かつ安価な制御を提供しますが、耐性と非標的死亡率の発達も促進します。SITは種特異的であり、耐性を生み出す可能性は低いですが、SITのオスは、ベクターコントロール地区外からの移民個体群を制御するために永続的に生産および放出されなければなりません。

蚊が媒介する病原体の人間への伝染は、世界中で毎年何百万もの病気と死亡を引き起こします。ジカ熱やデング熱などの蚊が媒介する病気に対する効果的で承認されたワクチンがない場合、感染を減らす最も効果的な方法の1つは、病気媒介蚊の個体数を減らすことです。厄介なことに、伝統的に農薬の標的となっていた蚊種の数が増えており、農薬耐性のレベルが高まっています1。同時に、政府機関は以前に承認された農薬を積極的に登録抹消または禁止しており、新しい効果的な化学物質管理対策はほとんど開発されていません2,3。蚊の駆除に対するこの一連の障害は、蚊の個体数を減らすための代替の非化学的技術の探求を動機付けています。
特定の蚊種は、耐性と農薬登録の問題を制御するための課題を提示します。ネッタイシマカ(L.)は、未熟な発達と成虫の休息のためにこの種によって利用された不可解な周生生息地のために、従来の統合されたベクター管理によって制御することが非常に難しい著名な病気ベクター蚊です4,5。住宅周辺の不可解な生息地の開発に関連する課題には、農薬散布技術でこれらの場所に到達することの難しさ、および公衆衛生ベクター制御機関がこの種の効果的な統合ベクター管理(IVM)に不可欠な集中的な監視および管理活動を実施するための私有地への繰り返しのアクセスに対する一般の人々の受け入れの欠如が含まれます。
幸いなことに、他の非常に困難な昆虫種6の永続的な防除に成功したことが証明されたアプローチであるSITは、フロリダ州セントオーガスティンを拠点とする画期的な一連の実験と運用試験でネッタイシマカ問題に適用されています(KJL、RLA、SCB未発表データ)。SITは、蚊を含むさまざまな昆虫種に適用されており、深さ7,8でレビューされています。SITは、例えば電離放射線や化学物質への曝露によって不妊化されたコロニー飼育の雄の大量放出を利用して、雌の自然集団の配偶者の選択を圧倒します。野生のメスと交尾する滅菌されたオスは、オスの配偶子が被った損傷のために卵を不妊にし、十分な数が存在する場合、理論的には自然のネッタイシマカの個体群をクラッシュさせる可能性があります。
SITプログラムは、ネッタイシマカが最近再植民地化し、拡大し、ジカ熱、デング熱、チクングニア熱などのウイルスの感染に対する公衆衛生上のリスクを示しているフロリダ大西洋沿岸の都市部でネッタイシマカの個体数を減らすために開始されました。野生の雌との相性の可能性を最大化するために、プログラム9のために雄を生産するために、対象集団から野生のネッタイシマカを使用して新しいコロニーが設立されました。これは、地元で派生したコロニー飼育のオスは、地元の野生のメスと交尾するために地元の野生のオスと競争する可能性が高いという仮説に基づいていました。SITが効果的であるためには、圧倒的な数の不妊のオスがターゲットエリアに存在する必要があるだけでなく、地元の野生のメスの蚊と効果的に求愛して交尾できる必要があります。
一連の実験は、放出する不妊の雄の最適数(KJL、RLA、SCB未発表データ)と、野生の雌による生存、行動、または受容を妨げることなく雄を不妊にする最適な放射線量を決定するために実施されました(KJL、RLA、SCB未発表データ)。これらのデータは、このグループの関連出版物で発表される予定ですが、これらの調査結果のいくつかはこのプロトコルにも含まれており、他の場所で新しいSITネッタイシマカ制御プログラムの出発点として使用できる可能性があります。この種は絶えずその範囲を拡大しており、SITプログラムは、この個体群を制御するための費用効果の高い長期的な解決策となることが大いに期待されています。このプロトコルの目的は、公衆衛生ベクター制御プログラムにおいて、地元のネッタイシマカ集団の自然な繁殖サイクルを混乱させるために、屋外エリアに体系的に放出するために、滅菌されたオスのコロニー飼育のネッタイシマカを生産することです。
トランスジェニックネッタイシマカオスの生産およびネッタイシマカSITの生産ワークフロー、またはボルバキアベースの非互換性プログラムについても同様のプロトコルおよびワークフローが公開されているが、このプロトコルは、既存のプロトコルがネッタイシマカの生産、雄の蛹の分離および照射、成人男性のマーキングおよび包装、およびこのプログラムのリリースサイトへの出荷にどのように適合したかを示しています9、 10,11,12,13,14,15,16,17,18。このプロトコルのマーキングコンポーネントは、成熟した運用SITプログラムでは必要ないかもしれません。ただし、SITプログラムを確立した初期の段階で有効性を監視し、プロセス全体の品質を制御する1つの方法であるため、ここに含まれています。蚊駆除プログラムは通常、地方自治体によって運営されているため、組織の規模や資金基盤から、地域の成功を最大化するための防除戦術の調整まで、組織の多くの面で大きく異なる可能性があります。したがって、本明細書に記載されるプロトコルは、利用可能なリソースとの互換性について評価されるべきである。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-1/8&#34; wrench (1&#34; (1 inch) = 2.54 cm)</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>CMMT44707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL)</td>
			<td>Science Supplies WLE corp</td>
			<td>1/2 pint</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; tubing - tygon</td>
			<td>Hudson Extrusions</td>
			<td>LLDPE1/8 X 1/4 BLK</td>
			<td>to attach to CO2 gas regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; brass barb w/ MIP connection</td>
			<td>B&#38;K</td>
			<td>BHB-85NLB</td>
			<td>to attach to CO2 gas regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL graduated plastic beakers with handle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1223-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3000 mL graduated plastic beakers with handle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1223-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult large cage</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1450D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator vials</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver powder</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>290039601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brewers yeast</td>
			<td>MP Biomericals</td>
			<td>02903312-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 regulator</td>
			<td>Randor</td>
			<td>64003038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank (20# canister)</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>CDBEVCARB20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection basin</td>
			<td>Treasure Gurus</td>
			<td>KI-ENAMELBOWL</td>
			<td>for separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls - large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-456-883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deli cups w/lids - 470 mL</td>
			<td>Pactiv DELItainer</td>
			<td>PCTYSD2516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deli cups w/lids - 1900 mL</td>
			<td>Berry Global</td>
			<td>T60764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DoseReader 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dosimetry film</td>
			<td colspan="2">Far West Technology, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flashlight aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - fine featherweight</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4748 or 4750</td>
			<td>featherweight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAFchromic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>radiochromic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammator M</td>
			<td>Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ</td>
			<td></td>
			<td>Cesium-137 irradiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held mechanical aspirator</td>
			<td>Clarke Mosquito</td>
			<td>13500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambskin condoms</td>
			<td>Trojan</td>
			<td>Naturalamb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large CO2 chamber</td>
			<td>Sterilite</td>
			<td colspan="2">Walmart #&#160;568789514</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval rearing pans</td>
			<td>Blue Ridge Thermoforming</td>
			<td>&#160;01-FG-400-3N-ABS</td>
			<td>Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnets - 20# pull</td>
			<td>Master magnetics</td>
			<td>MHHH20BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking dye</td>
			<td>Dayglo</td>
			<td>ECO-11</td>
			<td>Aurora Pink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking dye</td>
			<td>Dayglo</td>
			<td>ECO-17</td>
			<td>Saturn Yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Falk</td>
			<td></td>
			<td>T301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasture pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes - large</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-090 CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes - small (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupa separator</td>
			<td>J.W. Hock</td>
			<td>1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red rubber hose</td>
			<td>Welch</td>
			<td>331040-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release containers</td>
			<td>Science Supplies WLE corp</td>
			<td>1 gallon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands - cross #19</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>ALL37196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands - latitude #64</td>
			<td>Skillcraft</td>
			<td>NSN0589974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>H-4737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed germination paper - Heavy stock 76#</td>
			<td>Anchor Paper</td>
			<td>#76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5&#34;</td>
			<td>MrBoxonline.com</td>
			<td colspan="2">Husky Foam Cooler kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve #20</td>
			<td>Advantech</td>
			<td>20BS8F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve #30</td>
			<td>Advantech</td>
			<td>30BS8F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small cage - Bug Dorm</td>
			<td>MegaView</td>
			<td>Bug Dorm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small CO2 chamber</td>
			<td>Mainstays</td>
			<td colspan="2">Walmart #&#160;562922221</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souffle cup lid</td>
			<td>SOLO</td>
			<td>41165277456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL)</td>
			<td>SOLO</td>
			<td>41165024104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td>ocelo</td>
			<td>MMM7274FD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squeeze bottle</td>
			<td>Dynalon</td>
			<td>3UUP6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stockinette</td>
			<td>BSN Medical</td>
			<td>30-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>extruded polystyrene foam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropical fish flake food</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>4.52 pound</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum chamber - desiccator</td>
			<td>BelArt</td>
			<td>T9FB892757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Globe Scientific</td>
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preparing irradiated and marked male aedes aegypti mosquitoes for release in an operational sterile insect technique program

デング熱、ジカ熱、チクングニア熱などの人間の病気の制御は、予防がないため、それらのベクターである ネッタイシマカ の制御に依存しています。蚊媒介動物の防除は、未熟および成虫期に適用される化学物質に依存することができ、これは非標的の死亡率に寄与し、さらに重要なことに、媒介動物の殺虫剤耐性をもたらす可能性がある。無菌昆虫技術(SIT)は、野生の雌と交尾して生存不可能な子孫を産む滅菌された成体雄の放出を通じて害虫の個体群を制御する方法です。この論文では、 ネッタイシマカ を制御するための運用SITプログラムで使用するために、不妊のオスを生産するプロセスについて説明します。ここでは、コロニーの飼育と維持、オスとメスの蛹の分離、成体オスの照射とマーキング、ネ ッタイシマカ の放流場所への輸送など、プログラムで使用される手順を概説します。また、手順上の警告、プログラムの制限、および将来の目標についても説明します。

用心深く適切な蚊の飼育は、コロニーケージでのオスとメスのバランスのとれた可用性、新鮮なショ糖溶液と蜂蜜の維持、および一貫した高品質の血液供給で構成されています。これらの条件は、SIT幼虫飼育鍋での使用に最適な密集した卵シートを提供します。古いものから新しいものまで使用を容易にするための体系的なラベル付けなど、乾燥卵シートの適切な保管と使用は、すべての鍋で均一な孵化をサポートします。孵化前にすべての幼虫飼育鍋に水を入れると、卵シートが孵化容器に入っている時間を短縮し、健康な発育を促進することができます。孵化から蛹化までの幼虫の鍋のメンテナンスには、発達段階や環境変数に応じて多かれ少なかれ食物や追加の水が必要になる可能性があるため、コロニーの職員による慎重な関与が必要です。蛹の性別分離の予定日までに発達段階に問題がある場合は、孵化の早さや遅さ、餌の調整、インキュベーターの温度の変更など、プロセスの早い段階で調整を行う必要があります。
このプロトコルの飼育プロセスは、すべての卵が時間内に孵化し、照射して制御目的で使用できる蛹に成長するわけではありません。コロニーで飼育された蚊の20〜50%は、蛹を分離する必要がある時までにまだ幼虫です。しかし、これらの幼虫は浪費されませんが、24時間成熟させて、前日の分離から雌の蛹と組み合わせてコロニーケージに戻すことができる追加の蛹をレンダリングします。コロニーケージでは、蛹は成虫に成熟し、交尾し、採血し、SITプロジェクトを維持する卵を産むことができます。
蛹を分離し、蛹をペトリ皿に注ぎ、照射し、照射後に成虫の保持ケージに配置することは1日で行われなければなりません。したがって、すべてのステップを快適に処理するために十分な時間を割り当てる必要があります。リリースコンテナの組み立てと準備は、マーキングプロセスの前に行う必要があります。出荷箱がリリースサイトから返送された場合、リリースコンテナを検査し、次の使用に備える必要があります。濡れた綿球を廃棄し、湿式放出容器を空気で抜いて、ペトリ皿を洗浄し、メッシュを交換し、容器からゴムバンドを取り外すと、使用しないときに放出容器の寿命が大幅に延びます。
COVID-19ウイルスのパンデミックの世界的な現実を考えると、通常は複数人の操作であるこのプロトコルは、各ステップでラボで1人で作業する1人が扱いやすいように変更されました。1 人のシナリオによって最も妨げられるプロセスのステップは、性別、マーキング、計量、およびコロニー飼育の維持手順です。異なる部屋で同時に動作する複数のセパレーターがある場合は、1人で性別で蛹を分けるだけで十分です。職場で社会的距離が発生するパンデミックの状況では、性別から梱包までのステップを完了するために複数のステーションを装備する必要があります。オペレーターの速度にもよりますが、15,000匹の蚊をセックスするのに1人~4時間かかり、次にマーキング、計量、梱包にさらに1〜2時間かかります。2人のシナリオでは、マーキングのために蚊が麻酔される時間が短縮され、全体的な作業時間が短縮されます。しかし、2人のシナリオでも、蚊が鎮静されている間の作業時間が限られているため、リリースケージあたり2.0 gの蚊全体を割り当てることは困難な場合があります。仔魚や成虫の飼育資材の洗浄や準備は、非常に時間と労力がかかりますが、パンデミック時に個々のオペレーターが独立して安全に作業できるように分割することができます。
成人の、マークされた、照射された ネッタイシマカ の男性を解放することは、このプロトコルの範囲外ですが、ここでは簡単に説明します。表3に報告されているように、マークされ、照射されたオスの蚊を放出するプロセスは、 重量(したがって、推定された無菌オスの数)に基づいて放出容器の均一な放出分布を決定することから始まります。貨物がベクターコントロール地区に配達された後、箱が開かれ、リリースコンテナは、リリースコンテナの死亡率または状態に関する問題について評価されます。放出容器内の蚊は、治療領域に輸送される前に、周囲温度および湿度に1〜2時間順応させる。治療エリアの放出部位は、 ネッタイシマカの野生個体群のホットスポットを集中的に監視した後に特定されます。放出のタイミング、頻度、密度は、種の生物学、気象学、公的支援、および実験室飼育能力によってバランスが取れています。
特定の放出容器は特定の放出部位と一致するため、上部のメッシュを切断して放出容器を開く前にラベルをクロスチェックする必要があり、オペレーターがメッシュを変形させてオスの一部が逃げられるようにします。この部分放出方法は、自由に飛んでいるすべてのオスが解放されるまで、コンテナに割り当てられた各リリースポイントで繰り返されます。このプロセスは、すべてのコンテナが処理されるまで、割り当てられたリリース場所の各リリースコンテナに対して繰り返されます。任意選択で、蚊が解放された後、自由に去らなかった死んだまたは障害のある蚊をペトリ皿に集め、手で数えるようにラベルを付けるか、放出された推定数を修正するために計量することができる。SIT手術の有効性を評価するために、標的地域、およびおそらく非介入対照部位における野生ネ ッタイシマ カの成虫、卵、および未熟な段階の継続的かつ広範な監視が実施されます。

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Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

無菌昆虫技術(SIT)は、化学的防除に耐性がある可能性のある特定の医学的に重要な蚊の個体数を制御するために使用されます。ここでは、 ネッタイシマカ を対象とした運用SITプログラムにおける不妊雄蚊の大量飼育と放出準備の方法について述べる。

照射され、マークされたオスの ネッタイシマカ を、操作可能な滅菌昆虫技術プログラムで放出するための準備

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...

このプロトコルのユニークな価値は、小さなラボスペースですぐに利用できる機器を使用する2人の担当者が、50エーカーの運用SITプログラムをサポートするのに十分な無菌の悪蚊を生産できることです。この技術の効率と低コストにより、小規模な蚊駆除地区でさえ、統合されたベクター制御プログラムを強化することがアクセス可能で扱いにくくなります。手順を実演するのは、私と研究ユニットの生物科学検査技師であるバーバラ・ベイヤーです。蛹から成虫のネッタイシマカを飼育するには、0.84 x 0.84ミリメートルの穴サイズのグラスファイバーメッシュスクリーニングを備えた60 x 60 x 60センチメートルの折りたたみ式アルミニウム飼育ケージと、各ケージの1つの垂直壁にリーチインストッキネットスリーブを準備します。ネッタイシマカが入った1, 900ミリリットルのプラスチックカップを各飼育ケージに1対1の性比で置き、スリーブを閉じて、カップをケージに入れて閉じます12:12または14:10の明暗サイクルで、相対湿度50%を超える摂氏28〜30度で約4日間、大人が出てこなくなるまで。飼育ケージに蛹を入れてから24時間後、スポンジ芯を入れた10%ショ糖溶液の容器を各ケージに入れ、蜂蜜に浸した10 x 2センチメートルのスポンジをワイヤーフックから吊るして、成虫の蚊にそれぞれ水分補給と栄養を与えます。その後3〜4週間、ほとんどの成人が2〜3日ごとに出現してから48〜72時間後、1つのラムスキンコンドームにケージあたり50〜100ミリリットルの除繊牛血液を入れ、温水浴でコンドームを摂氏約37度に温めます。タオルでコンドームを丁寧に叩いた後、部分的に乾燥させたコンドームをケージ内の紙で裏打ちされた個々のペトリ皿に30〜60分間入れます。各採血の48〜72時間後に、800ミリリットルの濾過された蛹水を含む1, 900ミリリットルの産卵カップを置き、カップの内周に沿って各ケージに平らに取り付けられた8〜10 x 30センチメートルの種子発芽紙シートを装着する。ネッタイシマカの幼虫を卵から育てるには、5, 000〜10, 000個の卵が存在する産卵紙を使用し、産卵線に垂直に3〜7センチメートルの断面を切り取ります。水道水と粉砕した魚の餌フレークを半分満たした新しい460ミリリットルの容器にピースを入れます。容器を覆い、少なくとも1分間激しく攪拌してから、内容物全体を3リットルの水道水と50ミリリットルの茶色のスラリーが入った幼虫飼育鍋に注ぎます。鍋に開始日、ひずみ情報、給餌スケジュールをマークします。幼虫の幼虫のおおよその閾値の割合に達したら、各鍋の内容物をサイズ20〜40のふるいに注ぎ、水道水の絞りボトルを使用して、ふるいから蛹と幼虫を3リットルの目盛り付きプラスチックビーカーに洗い流します。雄の蛹を幼虫と雌の蛹から分離するには、各ビーカーの内容物を複数の1.9リットルのプラスチック容器に分割し、蛹分離器の基部の水門の下に硬くて浅い4リットルの収集容器を置きます。水道水で約4分の3の3リットルの目盛り付きプラスチックビーカー2つを満たし、上部と下部のノブを調整しながら、セパレーターのガラス板の間のスペースに水を注ぎ、水がセパレーターを連続的に流れるようにします。プレートの根元から約1.25センチメートルの高さで水が均等に溜まったら、セパレーターの下部ノブの開始位置にテープで印を付け、開始位置から1〜2センチメートル反時計回りに下部ノブを連続的に回転させながら、蛹と幼虫の容器をセパレーターに注ぎ始めます。幼虫のほとんどまたはすべてが水門を通って収集容器に洗い流されたら、水流を一時停止し、30番のふるいを使用して幼虫の収集容器を取り除きます。すべての幼虫が取り除かれたら、水を注ぎ、ノブを再度調整して、オスの蛹が収集容器に洗い流されるようにします。次に、容器からオスの蛹を20番のふるいに注ぎ、水道水の1リットルのスクイーズボトルを使用して、ふるいから別の1.9リットルの容器に蛹を洗います。すべてのオスの蛹が集められたら、水を注ぎ、メスの蛹が収集されるようにノブを調整します。20番のふるいを使用して、今示したように、雌の蛹を新しい1.9リットルの容器に移します。次に、水を注ぎ、未熟な蚊がすべてセパレーターから洗い流されるまで、ノブを再度調整します。集めたオスの蛹をふるいで濾し、できるだけ少ない水で1リットルの目盛り付きビーカーにうんちを洗います。湿ったろ紙で裏打ちされたペトリ皿に蛹を単層で慎重に注ぎます。作業中の蛹の動きを防ぐために、新鮮な3ミリリットルの牧草地ピペットを使用してペトリ皿の底から立っている水を取り除きます。ペトリ皿とスタックを束ねてから、照射チャンバーに収まるようにラベルの付いた3.8リットルの再封可能なバッグの中に密封します。照射された成体の雄の蚊の定量化されたバッチをマークするには、飼育ケージから栄養源をすべて取り除き、1つのケージを大きな二酸化炭素チャンバーに5〜7分間置き、コンテナの側面をノックして壁にしがみついている蚊を取り除きます。暴露期間の終わりに、蚊を吸引器バイアルに移し、蚊を再び麻酔してから、蚊を白い紙で覆われた作業面に振とうします。作業面からすべてのオスを新しいバイアルに慎重に吸引し、すべての成人オスがすべての飼育ケージから収集されるまで、露出と収集を繰り返します。性別選別プロセス中のある時点で、25匹の成体雄蚊のみを含むバイアルを生成する。すべてのオスが集められたら、風袋を塗った計量ボートで蚊の各卑劣な体重を量り、計量した蚊を50ミリグラムのマーキング染料を含む240ミリリットルのカードストック容器にすばやく注ぎます。すべての蚊が軽くコーティングされるまで、容器を時計回りと反時計回りに1回転させて回転させ、蚊を新しい計量ボートに注ぎ、次に計量ボートを半分に折りたたんで、蚊をストッキネットスリーブからリリースコンテナに流します。約2グラムのオスの蚊が放出容器に追加されたら、ストッキネットスリーブを閉じ、放出容器のベゼルのラベルテープに染料の色、容器番号、および蚊の総重量をマークします。この代表的なオスの成体ネッタイシマカの飼育、照射、およびマーケティング実験では、3つの飼育ケージから2グラムのオスの成虫蚊を採取し、2つのケージから25匹のオスのバイアルとともに、蚊あたりの平均体重を計算することができました。2つのバッチから合計25匹の雌が廃棄された。幼虫の飼育週のタイムリーで観察的な給餌は、分離のためのよく発達した蛹を生成するために重要です。これにより、男性と女性が明確に区別され、マーキングステップでの女性の発生が少なくなります。これらの不妊オスは、運用SITプログラムで使用するだけでなく、野生の非照射オスと比較して、交配競争、生存、および照射されたオスの分散を調査する実験にも広く使用できます。雌の蚊を含むように技術を変更することで、照射された雌の意図しない放出が繁殖力とベクター能力に与える影響を調査することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

トランスジェニック蚊を取得するA.ネッタイシマカの胚のマイクロインジェクション

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

デング熱蚊の感染症（A.ネッタイシマカ）と感染症の表現型決定のためのプロトコル

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

AEから中腸と唾液腺の解剖。ネッタイシマカ蚊

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

より良い蚊の構築：A. gambiaeとA.ネッタイシマカ蚊のマラリアとデング熱の抵抗を使用可能にする遺伝子を特定

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAiによる遺伝子ノックダウンと<emインビボで&gt;</em大人の女性の&gt;利尿アッセイ<em&gt;ネッタイシマカ</em&gt;蚊

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のRNA-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、<em&gt;ヒトスジシマカ</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

生理的録音と黄熱病の蚊の味覚付属器RNAの配列決定<em&gt;ネッタイシマカ</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

ネッタイシマカジカのベクトルで脂肪ボディ臓器培養システム

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

ネッタイシマカ蚊ボルバキアに感染維持

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2 +の効果の評価のためのスクリーニング アッセイ中スループット-シグナリングおよびひと精子先体反応

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

照射され、マークされたオスの ネッタイシマカ を、操作可能な滅菌昆虫技術プログラムで放出するための準備

照射され、マークされたオスのネッタイシマカを、操作可能な滅菌昆虫技術プログラムで放出するための準備