Name: preparing irradiated and marked male aedes aegypti mosquitoes for release in an operational sterile insect technique program
Uploaded: 2021-03-12T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program at JoVE.com

Agradecemos aos Drs. R.-D. Xue, C. Bibbs, W. Qualls e V. Aryaprema do Distrito de Controle de Mosquitos Anastasia, St. Augustine, Flórida, pela parceria no desenvolvimento do programa SIT e visão especializada sobre a liberação operacional efetiva de Aedes aegypti macho estéril. Esta pesquisa foi apoiada pelo USDA-ARS e pelo Departamento de Agricultura e Serviços ao Consumidor da Flórida (FDACS). A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é exclusivamente para fins de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo USDA ou FDACS.

<ol>
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Todos os autores declararam não haver conflitos de interesse.

O início de um programa de controle com SIT que utiliza radiação requer o estabelecimento de uma cepa local de Aedes aegypti. Esta etapa é crítica e pode permitir que o SIT realmente se distinga de tecnologias de controle semelhantes. Ao desenvolver o projeto a partir de uma cepa local de mosquito, os machos gerados provavelmente terão comportamentos que lhes permitirão se adaptar às mudanças e pistas ambientais e localizar e acasalar com fêmeas selvagens nas proximidades. Além disso, a liberação de machos locais irradiados pode não gerar opinião pública negativa em comparação com, digamos, a liberação de uma cepa não local de mosquitos geneticamente modificados que poderia, por exemplo, introduzir novos alelos na população local de mosquitos.
Gastar recursos substanciais para criar grandes quantidades de mosquitos apenas para poder usar cerca de metade deles para fins de controle é uma limitação do programa SIT do Aedes aegypti . Refinamentos devem ser feitos no protocolo de criação para condensar a maturação das larvas em prazos mais definidos quando as pupas estiverem prontas. Isso permitiria que mais pupas fossem coletadas no momento ideal de separação. No entanto, pupas adicionais para processar aumenta o risco de mais fêmeas pupando quando as pupas são coletadas e, portanto, aumentando a probabilidade de as fêmeas acabarem em placas de Petri com machos e possivelmente serem liberadas. Embora a expectativa de vida, o comportamento de alimentação sanguínea e o comportamento de oviposição em pupas de Aedes aegypti irradiadas sejam reduzidos em adultos, não é uma boa estratégia liberar fêmeas incidentalmente ao lado de machos irradiados22. Portanto, deve continuar sendo uma prioridade minimizar o número de fêmeas inadvertidamente separadas, irradiadas, marcadas e liberadas com machos.
O sucesso de um programa SIT depende, em última análise, da competição bem-sucedida de parceiros por machos irradiados criados em colônias. A preservação da competitividade masculina depende da seleção exaustiva da dose derivada experimentalmente e da maximização da proporção estimada de machos estéreis: selvagens na população. A seleção da dose é determinada por vários fatores-chave que incluem longevidade, fertilidade, fecundidade e mortalidade por pupas. Observou-se que os mosquitos machos exibirão uma curva de fertilidade assintótica que se aproxima de zero à medida que a radiação aumenta (dados não publicados de KJL, RLA, SCB). Simultaneamente, a longevidade e os níveis de atividade do mosquito macho diminuem exponencialmente à medida que a dose de radiação aumenta (dados não publicados de KJL, RLA, SCB). Portanto, em vez de identificar uma dose que produza 99,9% de esterilidade em homens, é preferível concentrar-se em uma porcentagem de esterilidade mais baixa enquanto apoia a sobrevivência. Uma vez identificado um intervalo de dose que não diferencia a longevidade ou a mortalidade por pupas de machos irradiados da de machos não irradiados, avaliações adicionais sobre fertilidade devem ser realizadas para identificar uma dose que torne os machos esmagadoramente estéreis, mas competitivos.
Simultaneamente, é fundamental comparar o número de mosquitos machos na população com o de machos irradiados liberados. Isso pode ser feito coletando machos de vários locais dentro e ao redor da área de liberação alvo repetidamente do mesmo local e antes, durante e após o início do programa SIT. Um estudo de marcação, liberação e recaptura deve ser realizado para avaliar a proporção de mosquitos machos selvagens para mosquitos liberados. Um estudo de marcação, liberação e recaptura baseia-se na liberação de um número conhecido de mosquitos marcados de um ponto específico e sua posterior recaptura em pontos próximos ao redor do ponto de liberação inicial. Comparando-se o número de machos recapturados e machos silvestres a distâncias do ponto de soltura, é possível estimar a população selvagem geral de machos na área para que proporções competitivas de machos estéreis possam ser liberadas23. A maximização da proporção de machos estéreis:selvagens pode ser alcançada liberando machos mais estéreis e/ou reduzindo a população selvagem por meios clássicos de controle, como redução de fontes, controle imaturo ou tratamentos adulticidas.
Para avaliar a eficácia de liberações masculinas estéreis, as coleções adultas podem ser comparadas cronologicamente com uma área sem intervenção. À medida que machos estéreis são liberados e o número de machos e fêmeas coletados em uma área diminui em relação a uma área de não-intervenção comparável, pode-se hipotetizar que é devido aos machos estéreis liberados superarem com sucesso os machos férteis locais. Este efeito também pode ser observado em copos de armadilha de oviposição implantados nos locais de intervenção e não intervenção. Os ovos ainda podem ser produzidos no local de intervenção, mas se menos eclodem do que os do local de não intervenção, pode-se hipotetizar que eles não são fertilizados por causa do acasalamento de fêmeas com machos estéreis. Cada vez mais a oviposição de ovos não fertilizados pode, eventualmente, levar à redução da oviposição devido à não substituição de fêmeas no local de intervenção 8,24.
As direções futuras da tecnologia e dos programas SIT expandem-se naturalmente para espécies adicionais de mosquitos medicamente importantes. Por exemplo, esta tecnologia pode ser prontamente adaptada para controlar o Aedes albopictus, dada a bionomia muito semelhante do Aedes aegypti e do Aedes albopictus. Outras espécies de mosquitos vetores de doenças de interesse incluem Culex quinquefasciatus, Culex tarsalis e várias espécies de Anopheles. Melhorar a eficácia desta tecnologia depende do aumento da capacidade das pupas machos produzidas em um determinado momento, o que poderia ser alcançado através de manipulação genética ou seleção artificial, e melhorar a competitividade masculina, o que poderia ser alcançado aumentando a virilidade, fertilidade ou longevidade.
Em última análise, os programas SIT não são uma bala de prata para controlar os mosquitos. Em vez disso, eles são uma ferramenta em um conjunto de outras técnicas de controle, como programas IVM, que compensam as fraquezas entre as técnicas. Por exemplo, considerando que o controlo químico oferece um controlo rápido e barato, promove também o desenvolvimento de resistência e de mortalidade não visada; e enquanto o SIT é específico da espécie e não é susceptível de gerar resistência, os machos SIT devem ser produzidos e libertados perpetuamente para controlar as populações imigradas de fora do distrito de controlo do vector.

A transmissão de patógenos transmitidos por mosquitos para os seres humanos causa milhões de casos de doenças e mortes a cada ano em todo o mundo. Na ausência de vacinas eficazes e aprovadas para doenças transmitidas por mosquitos, como zika ou dengue, uma das maneiras mais eficazes de reduzir a transmissão é reduzir as populações de mosquitos vetores de doenças. De forma geral, um número crescente de espécies de mosquitos, tradicionalmente alvo de pesticidas, está exibindo níveis crescentes de resistência a pesticidas1. Simultaneamente, as agências governamentais têm agressivamente cancelado ou banido pesticidas previamente aprovados, e poucas medidas novas e eficazes de controle químico estão sendo desenvolvidas 2,3. Essa constelação de obstáculos ao controle de mosquitos motivou a exploração de técnicas alternativas não químicas para reduzir as populações de mosquitos.
Certas espécies de mosquitos apresentam desafios para controlar questões de resistência e registro de pesticidas. O Aedes aegypti (L.) é um proeminente mosquito vetor de doenças extremamente difícil de controlar por meio do manejo tradicional integrado de vetores devido ao habitat peridoméstico críptico explorado por esta espécie para o desenvolvimento imaturo e repouso adulto 4,5. Os desafios relacionados à exploração do habitat críptico em torno das residências incluem a dificuldade de chegar a esses locais com técnicas de pulverização de pesticidas, bem como a potencial falta de aceitação pelo público para o acesso repetido à propriedade privada para que as agências de controle de vetores de saúde pública realizem as atividades intensivas de vigilância e controle cruciais para o manejo integrado eficaz de vetores (IVM) para esta espécie.
Felizmente, o SIT, uma abordagem comprovadamente bem-sucedida para o controle duradouro de outras espécies de insetos altamente desafiadoras6, está sendo aplicada ao problema do Aedes aegypti em uma série inovadora de experimentos e ensaios operacionais baseados em St. Augustine, Flórida (dados não publicados da KJL, RLA, SCB). O SIT tem sido aplicado a uma variedade de espécies de insetos, incluindo mosquitos, e tem sido revisado em profundidade 7,8. O SIT aproveita a liberação em massa de machos criados em colônias esterilizados, por exemplo, por exposição a radiação ionizante ou produtos químicos para sobrecarregar a escolha de parceiros de populações naturais de fêmeas. Machos esterilizados que acasalam com fêmeas selvagens tornam os ovos inférteis devido aos danos sofridos pelos gametas masculinos e, se presentes em número suficiente, podem, teoricamente, colidir com a população natural de Aedes aegypti.
Um programa SIT foi iniciado para tentar reduzir as populações de Aedes aegypti em uma área urbana na costa atlântica da Flórida, onde esta espécie recentemente recolonizou e está se expandindo e apresentando um risco de saúde pública para a transmissão de vírus como Zika, dengue ou chikungunya. Para maximizar o potencial de compatibilidade com fêmeas silvestres, uma nova colônia foi estabelecida utilizando Aedes aegypti capturado na natureza da população-alvo para produzir machos para o programa9. Isso foi baseado na hipótese de que machos criados em colônias de origem local seriam mais propensos a serem competitivos com machos selvagens locais para acasalamento com fêmeas selvagens locais. Para que o SIT seja eficaz, não só um número esmagador de machos estéreis precisa estar presente na área-alvo, mas eles também têm que ser capazes de efetivamente cortejar e acasalar com mosquitos fêmeas selvagens locais.
Uma série de experimentos foi conduzida para determinar o número ideal de machos estéreis a serem liberados (dados não publicados de KJL, RLA, SCB), bem como doses ótimas de radiação que tornariam os machos inférteis sem interferir na sobrevivência, comportamento ou aceitação por fêmeas selvagens (dados não publicados de KJL, RLA, SCB). Esses dados estão disponíveis em publicações aliadas desse grupo, mas alguns desses achados também são capturados neste protocolo e podem ser usados como ponto de partida para novos programas de controle do SIT Aedes aegypti em outros lugares. Esta espécie está constantemente expandindo seu alcance, e os programas SIT mostram grande promessa de serem soluções econômicas e de longo prazo para controlar essa população. O objetivo deste protocolo é produzir mosquitos Aedes aegypti esterilizados, machos e criados em colônias para liberação sistemática em áreas externas para interromper os ciclos reprodutivos naturais das populações locais de Aedes aegypti em um programa operacional de controle de vetores de saúde pública.
Embora protocolos e fluxos de trabalho semelhantes tenham sido publicados para a produção de machos transgênicos do Aedes aegypti e fluxos de trabalho de produção para o Aedes SIT, ou programas de incompatibilidade baseados em Wolbachia, tenham sido publicados em outros lugares, este protocolo ilustra como os protocolos existentes foram adaptados para a produção, separação e irradiação de pupas masculinas do Aedes aegypti, marcação e embalagem de machos adultos e envio para o local de lançamento deste programa9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18. O componente de marcação deste protocolo pode não ser exigido em um programa SIT operacional maduro; no entanto, foi incluído aqui porque é uma maneira de monitorar a eficácia e controlar a qualidade de todo o processo nos primeiros anos de estabelecimento do programa SIT. Os programas de controle de mosquitos são normalmente executados por autoridades locais, de modo que podem variar amplamente em muitos aspectos de sua organização, desde o tamanho e a base de financiamento até o ajuste das táticas de controle para maximizar o sucesso local. Assim, o protocolo aqui descrito deve ser avaliado quanto à compatibilidade com os recursos disponíveis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-1/8&#34; wrench (1&#34; (1 inch) = 2.54 cm)</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>CMMT44707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL)</td>
			<td>Science Supplies WLE corp</td>
			<td>1/2 pint</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; tubing - tygon</td>
			<td>Hudson Extrusions</td>
			<td>LLDPE1/8 X 1/4 BLK</td>
			<td>to attach to CO2 gas regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; brass barb w/ MIP connection</td>
			<td>B&#38;K</td>
			<td>BHB-85NLB</td>
			<td>to attach to CO2 gas regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL graduated plastic beakers with handle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1223-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3000 mL graduated plastic beakers with handle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1223-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult large cage</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1450D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator vials</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver powder</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>290039601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brewers yeast</td>
			<td>MP Biomericals</td>
			<td>02903312-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 regulator</td>
			<td>Randor</td>
			<td>64003038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank (20# canister)</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>CDBEVCARB20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection basin</td>
			<td>Treasure Gurus</td>
			<td>KI-ENAMELBOWL</td>
			<td>for separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls - large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-456-883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deli cups w/lids - 470 mL</td>
			<td>Pactiv DELItainer</td>
			<td>PCTYSD2516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deli cups w/lids - 1900 mL</td>
			<td>Berry Global</td>
			<td>T60764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DoseReader 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dosimetry film</td>
			<td colspan="2">Far West Technology, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flashlight aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - fine featherweight</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4748 or 4750</td>
			<td>featherweight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAFchromic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>radiochromic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammator M</td>
			<td>Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ</td>
			<td></td>
			<td>Cesium-137 irradiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held mechanical aspirator</td>
			<td>Clarke Mosquito</td>
			<td>13500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambskin condoms</td>
			<td>Trojan</td>
			<td>Naturalamb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large CO2 chamber</td>
			<td>Sterilite</td>
			<td colspan="2">Walmart #&#160;568789514</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval rearing pans</td>
			<td>Blue Ridge Thermoforming</td>
			<td>&#160;01-FG-400-3N-ABS</td>
			<td>Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnets - 20# pull</td>
			<td>Master magnetics</td>
			<td>MHHH20BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking dye</td>
			<td>Dayglo</td>
			<td>ECO-11</td>
			<td>Aurora Pink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking dye</td>
			<td>Dayglo</td>
			<td>ECO-17</td>
			<td>Saturn Yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Falk</td>
			<td></td>
			<td>T301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasture pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes - large</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-090 CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes - small (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupa separator</td>
			<td>J.W. Hock</td>
			<td>1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red rubber hose</td>
			<td>Welch</td>
			<td>331040-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release containers</td>
			<td>Science Supplies WLE corp</td>
			<td>1 gallon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands - cross #19</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>ALL37196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands - latitude #64</td>
			<td>Skillcraft</td>
			<td>NSN0589974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>H-4737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed germination paper - Heavy stock 76#</td>
			<td>Anchor Paper</td>
			<td>#76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5&#34;</td>
			<td>MrBoxonline.com</td>
			<td colspan="2">Husky Foam Cooler kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve #20</td>
			<td>Advantech</td>
			<td>20BS8F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve #30</td>
			<td>Advantech</td>
			<td>30BS8F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small cage - Bug Dorm</td>
			<td>MegaView</td>
			<td>Bug Dorm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small CO2 chamber</td>
			<td>Mainstays</td>
			<td colspan="2">Walmart #&#160;562922221</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souffle cup lid</td>
			<td>SOLO</td>
			<td>41165277456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL)</td>
			<td>SOLO</td>
			<td>41165024104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td>ocelo</td>
			<td>MMM7274FD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squeeze bottle</td>
			<td>Dynalon</td>
			<td>3UUP6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stockinette</td>
			<td>BSN Medical</td>
			<td>30-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>extruded polystyrene foam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropical fish flake food</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>4.52 pound</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum chamber - desiccator</td>
			<td>BelArt</td>
			<td>T9FB892757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing irradiated and marked male aedes aegypti mosquitoes for release in an operational sterile insect technique program

O controle de doenças humanas como dengue, zika e chikungunya depende do controle de seu vetor, o mosquito Aedes aegypti , pois não há prevenção. O controle de mosquitos vetores pode contar com produtos químicos aplicados nos estágios imaturo e adulto, o que pode contribuir para a mortalidade de não-alvos e, mais importante, levar à resistência a inseticidas no vetor. A técnica de insetos estéreis (SIT) é um método de controle de populações de pragas através da liberação de machos adultos esterilizados que acasalam com fêmeas selvagens para produzir descendentes inviáveis. Este trabalho descreve o processo de produção de machos estéreis para uso em um programa operacional de SIT para o controle de mosquitos Aedes aegypti . Aqui estão descritas as etapas usadas no programa, incluindo a criação e manutenção de uma colônia, a separação de pupas masculinas e femininas, a irradiação e marcação de machos adultos e o envio de machos Aedes aegypti para o local de soltura. Também são discutidas ressalvas processuais, limitações do programa e objetivos futuros.

A criação vigilante e adequada de mosquitos consiste na disponibilidade bem equilibrada de machos e fêmeas em gaiolas de colônia, manutenção de solução de sacarose fresca e mel e alimentação sanguínea consistente de alta qualidade. Essas condições fornecerão folhas de ovos densamente embaladas, ideais para uso em panelas de criação de larvas SIT. O armazenamento e o uso adequados de folhas de ovos secos, como a rotulagem sistemática para facilitar o uso do mais antigo para o mais novo, apoiarão a eclosão uniforme em todas as panelas. Encher todas as panelas de criação de larvas com água antes da eclosão pode diminuir o tempo durante o qual as folhas de ovos estão em recipientes de eclosão e promover o desenvolvimento saudável. A manutenção das larvas desde a eclosão até a pupação requer um envolvimento cuidadoso do pessoal da colônia, pois algumas panelas podem precisar de mais ou menos comida ou água adicional, dependendo dos estágios de desenvolvimento e das variáveis ambientais. Se houver problemas com o estágio de desenvolvimento até o dia programado de separação sexual da pupa, ajustes devem ser feitos mais cedo no processo, como eclodir mais cedo ou mais tarde, ajustar os alimentos ou alterar a temperatura da incubadora.
O processo de criação neste protocolo não torna todos os ovos eclodidos a tempo de se desenvolverem em pupas que possam ser irradiadas e usadas para fins de controle. Entre 20 e 50% dos mosquitos criados em colônias ainda serão larvas no momento em que as pupas precisarem ser separadas. No entanto, essas larvas não são desperdiçadas, mas deixadas amadurecer por 24 horas para renderizar pupas adicionais que podem ser combinadas com pupas fêmeas da separação do dia anterior e recicladas de volta para gaiolas de colônia. Nas gaiolas da colônia, as pupas poderão amadurecer em adultos, acasalar, alimentar o sangue e produzir ovos que sustentem o projeto SIT.
A separação de pupas, o derramamento de pupas em placas de Petri, a irradiação e a colocação em gaiolas de retenção de adultos após a irradiação devem acontecer em um dia; portanto, deve-se reservar tempo suficiente para processar todas as etapas confortavelmente. A montagem e a preparação dos recipientes de liberação devem ser feitas antes do processo de marcação. Quando as caixas de transporte são devolvidas do local de liberação, os contêineres de liberação devem ser inspecionados e preparados para seu próximo uso. Descartar bolas de algodão molhadas, arejar recipientes de liberação úmida, limpar placas de Petri, substituir malhas e remover faixas elásticas do recipiente, enquanto não estiver em uso, prolongará muito a vida útil dos recipientes de liberação.
Dada a realidade mundial da pandemia viral de COVID-19, este protocolo que é tipicamente uma operação de várias pessoas foi modificado para ser tratável por uma pessoa que trabalha sozinha em um laboratório para cada etapa. As etapas do processo que são mais prejudicadas por um cenário de uma pessoa são as etapas de sexagem, marcação, pesagem e manutenção da criação de colônias. Separar as pupas por sexo por uma pessoa deve ser suficiente se houver vários separadores operando simultaneamente em diferentes salas. Em uma situação de pandemia em que o distanciamento social ocorre no local de trabalho, equipar várias estações é necessário para concluir as etapas desde a sexagem até a embalagem. Dependendo da velocidade do operador, leva uma pessoa ~ 4 h para o sexo 15.000 mosquitos e, em seguida, outro 1-2 h para marcá-los, pesar e embalá-los. Um cenário de duas pessoas diminui o tempo durante o qual os mosquitos são anestesiados para marcação e reduz o tempo total de trabalho. No entanto, mesmo em um cenário de duas pessoas, alocar os 2,0 g completos de mosquitos por gaiola de liberação pode ser um desafio devido ao tempo de trabalho limitado enquanto os mosquitos são sedados. Embora o processo de limpeza e preparação de materiais de criação de larvas e adultos seja extremamente demorado e trabalhoso, ele pode ser particionado de modo que os operadores individuais possam trabalhar de forma independente e segura durante uma pandemia.
A liberação de machos adultos, marcados e irradiados do Aedes aegypti está fora do escopo deste protocolo, mas é apresentada aqui em resumo. O processo de liberação de mosquitos machos marcados, irradiados inicia-se pela determinação de uma distribuição uniforme de liberação dos recipientes de liberação com base nos pesos (e, portanto, no número inferido de machos estéreis), conforme relatado na Tabela 3. Depois que as remessas são entregues ao distrito de controle vetorial, as caixas são abertas e os contêineres de liberação avaliados para quaisquer problemas com mortalidade ou condição dos contêineres de liberação. Os mosquitos nos recipientes de liberação são então autorizados a se aclimatar à temperatura e umidade ambiente por 1-2 h antes do transporte para a área de tratamento. Os locais de soltura na área de tratamento são identificados após vigilância intensiva de focos de calor de populações silvestres de Aedes aegypti. O tempo, a frequência e a densidade das liberações são equilibrados pela bionomia da espécie, bem como pela meteorologia, apoio público e capacidades de criação em laboratório.
Uma vez que os recipientes de libertação específicos são combinados com locais de libertação específicos, o rótulo deve ser cruzado antes de o recipiente de libertação ser aberto, cortando a malha no topo, permitindo ao operador deformar a malha de modo a que uma parte dos machos possa escapar. Este método de liberação fracionada é repetido em cada ponto de liberação designado para o recipiente até que todos os machos que voam livremente tenham sido liberados. Esse processo é então repetido para cada contêiner de liberação em seu respectivo local de liberação atribuído até que todos os contêineres tenham sido processados. Opcionalmente, após a liberação dos mosquitos, quaisquer mosquitos mortos ou deficientes que não saíram livremente podem ser coletados em placas de Petri e rotulados para serem contados à mão ou pesados para corrigir o número estimado liberado. A vigilância contínua e generalizada dos estágios adulto, de ovos e imaturos do Aedes aegypti selvagem na área-alvo e, possivelmente, em locais de controle sem intervenção, é conduzida para avaliar a eficácia da operação do SIT.

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Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

A técnica de insetos estéreis (SIT) é usada para controlar populações específicas de mosquitos clinicamente importantes que podem ser resistentes a controles químicos. Aqui, descrevemos um método de criação em massa e preparação de mosquitos machos estéreis para liberação em um programa operacional de SIT visando o mosquito Aedes aegypti .

Preparando mosquitos Aedes aegypti machos irradiados e marcados para liberação em um Programa Operacional de Técnica de Insetos Estéreis

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...

O valor único deste protocolo é que dois funcionários que usam equipamentos prontamente disponíveis em pequenos espaços de laboratório podem produzir mosquitos de mal estéreis suficientes para apoiar um programa operacional de SIT de 50 acres. A eficiência e o baixo custo dessa técnica a tornam acessível, intratável até mesmo para pequenos distritos de controle de mosquitos aumentarem seu programa integrado de controle de vetores. A demonstrar o procedimento estaremos eu e Barbara Bayer, técnicos de laboratório de ciências biológicas da unidade de investigação.Para criar Aedes aegypti adulto de pupas, prepare gaiolas de metal dobráveis de 60 por 60 por 60 centímetros com peneira de malha de fibra de vidro de 0,84 por 0,84 milímetro e uma manga de stockinette de alcance em uma parede vertical de cada gaiola. Coloque um copo de plástico de 1.900 mililitros com pupas de Aedes aegypti na proporção de um para um sexo em cada gaiola de criação e amarre a manga fechada, deixando os copos em gaiolas para eclosão por cerca de quatro dias a 28 a 30 graus Celsius maiores que 50% de umidade relativa em um ciclo claro:escuro de 12:12 ou 14:10 até que não surjam mais adultos. 24 horas depois de colocar as pupas nas gaiolas de criação, coloque um recipiente de solução de sacarose a 10% com um pavio de esponja em cada gaiola e suspenda uma esponja de 10 por 2 centímetros embebida em mel de um gancho de arame para fornecer hidratação e nutrição, respectivamente, aos mosquitos adultos.48 a 72 horas após a maioria dos adultos terem surgido a cada dois a três dias durante as próximas três a quatro semanas a partir de então, encha o preservativo de pele de cordeiro com 50 a 100 mililitros de sangue bovino desfibrinado por gaiola e aqueça os preservativos a aproximadamente 37 graus Celsius em um banho de água quente. Depois de acariciar cuidadosamente os preservativos com a toalha, coloque os preservativos parcialmente secos em placas de Petri forradas de papel individuais dentro das gaiolas por 30 a 60 minutos. 48 a 72 horas após cada alimentação de sangue, colocar um copo de oviposição de 1.900 mililitros contendo 800 mililitros de água de pupa filtrada e equipado com uma folha de 8 a 10 por 30 centímetros de papel germinativo de sementes encaixado ao longo da circunferência interna do copo em cada gaiola.Para retirar as larvas de Aedes aegypti dos ovos, use um papel de oviposição com 5.000 a 10.000 ovos presentes e corte uma seção de três a sete centímetros perpendicular à linha de oviposição. Coloque a peça em um novo recipiente de 460 mililitros meio cheio de água da torneira e uma pitada de flocos de comida de peixe pulverizados. Cubra e agite vigorosamente o recipiente durante pelo menos um minuto antes de despejar todo o conteúdo numa panela de criação larval contendo três litros de água da torneira e 50 mililitros de pasta castanha.Marque a panela com a data de início, as informações de tensão e o cronograma de alimentação. Uma vez que a proporção limiar aproximada de larvas nas panelas larvais tenha sido atingida, despeje o conteúdo de cada panela através de uma peneira de tamanho 20 a 40 e use uma garrafa de água da torneira para lavar as pupas e larvas da peneira em um copo de plástico graduado de três litros. Para separar as pupas machos das larvas e pupas fêmeas, divida o conteúdo de cada copo entre vários recipientes de plástico de 1,9 litro e coloque um recipiente de coleta rígido raso de quatro litros abaixo da eclusa na base de um separador de pupa.Encha dois copos de plástico graduados de três litros cerca de três quartos cheios de água da torneira e despeje a água através do espaço entre as placas de vidro do separador enquanto ajusta os botões superior e inferior para permitir que a água flua continuamente através do separador. Uma vez que a água parada tenha se acumulado uniformemente a uma altura de aproximadamente 1,25 centímetro da base das placas, marque as posições iniciais nos botões inferiores do separador com fita adesiva e comece a despejar os recipientes de pupas e larvas no separador enquanto gira continuamente os botões inferiores no sentido anti-horário, de um a dois centímetros das posições iniciais. Quando a maioria ou todas as larvas tiverem lavado a eclusa para o recipiente de coleta, pause o fluxo de água e use uma peneira número 30 para limpar o recipiente de coleta das larvas.Quando todas as larvas tiverem sido removidas, despeje a água e ajuste os botões novamente para permitir que as pupas machos sejam despejadas no recipiente de coleta. Em seguida, despeje as pupas machos do recipiente em uma peneira número 20 e use uma garrafa de um litro de água da torneira para lavar as pupas da peneira em um recipiente separado de 1,9 litro. Quando todas as pupas machos tiverem sido coletadas, despeje a água e ajuste os botões para permitir que as pupas fêmeas sejam coletadas.Usando a peneira número 20 para transferir as pupas fêmeas para um novo recipiente de 1,9 litro, como acabou de demonstrar. Em seguida, despeje a água e ajuste os botões novamente até que todos os mosquitos imaturos tenham sido lavados para fora do separador. Coe as pupas machos coletadas com uma peneira e lave o cocô em um copo graduado de um litro com o mínimo de água possível.Despeje cuidadosamente as pupas em placas de Petri forradas com papel de filtro úmido em uma única camada. Remova a água parada do fundo da placa de Petri usando uma pipeta de pastagem fresca de três mililitros para evitar o movimento da pupa durante o trabalho. Empacote as placas de Petri e as pilhas antes de selar dentro de um saco resealable de 3,8 litros rotulado para caber na câmara de irradiação.Para marcar lotes quantificados de mosquitos machos adultos irradiados, remova quaisquer fontes de nutrição da gaiola de criação e coloque uma gaiola em uma grande câmara de dióxido de carbono por cinco a sete minutos, batendo nas laterais do recipiente para desalojar quaisquer mosquitos agarrados às paredes. No final do período de exposição, transfira os mosquitos para um frasco de aspirador e anestesiar os mosquitos novamente antes de agitar os mosquitos em uma superfície de trabalho coberta de papel branco. Aspirar cuidadosamente todos os machos da superfície de trabalho para um novo frasco para injetáveis e repetir as exposições e a recolha até que todos os machos adultos tenham sido recolhidos de todas as gaiolas de criação.Em algum momento durante o processo de classificação sexual, gere um frasco contendo apenas 25 mosquitos machos adultos. Quando todos os machos tiverem sido coletados, pese cada vil de mosquitos em um barco de pesagem alcatroado em uma balança e despeje rapidamente os mosquitos pesados em um recipiente de cartolina de 240 mililitros contendo 50 miligramas de um corante de marcação. Incline e gire o recipiente uma rotação completa no sentido horário e anti-horário até que todos os mosquitos tenham sido levemente revestidos e despeje os mosquitos em um novo barco de pesagem, em seguida, dobre o barco de pesagem ao meio para permitir que os mosquitos sejam canalizados através da manga da stockinette para o recipiente de liberação.Quando aproximadamente dois gramas de mosquitos machos tiverem sido adicionados ao recipiente de liberação, amarre a manga da stockinette fechada e marque a fita de rotulagem no painel do recipiente de liberação com a cor do corante, o número do recipiente e o peso total dos mosquitos. Neste experimento representativo de criação, irradiação e comercialização de mosquitos adultos machos Aedes aegypti, dois gramas de mosquitos adultos machos puderam ser coletados de três gaiolas de criação e juntamente com dois frascos de 25 machos de duas gaiolas para permitir o cálculo do peso médio por mosquito. No total, 25 fêmeas foram descartadas de dois dos lotes.A alimentação oportuna e observacional durante a semana de criação larval é fundamental para a geração de pupas bem desenvolvidas para separação. Isso gera uma clara distinção entre machos e fêmeas, levando a uma baixa ocorrência de fêmeas nos passos de marcação. Além de usá-los em programas operacionais de SIT, esses machos estéreis também podem ser amplamente utilizados em experimentos que investigam a competição de acasalamento, sobrevivência e dispersão de machos irradiados em comparação com machos selvagens não irradiados.Modificar a técnica para incluir mosquitos fêmeas nos permite investigar o impacto da liberação não intencional de fêmeas irradiadas no que diz respeito à fecundidade e competência vetorial.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biologia

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Protocolo para infecções por dengue em mosquitos (A. aegypti) e Determinação Fenótipo Infecção

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Dissecção das glândulas salivares e intestino médio de Ae. aegypti mosquitos

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

Construção de uma melhor Mosquito: identificar os genes habilitação Malária e Dengue Febre Resistência em A. gambiae e A. aegypti mosquitos

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

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Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Sistema de cultura de órgão de gordura corporal em Aedes Aegypti, um vetor de vírus Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Manter o Aedes aegypti , mosquitos infectados com Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ensaios de triagem para avaliação dos efeitos de Ca2 +médio-produção-sinalização e reacção acrossómica no esperma humano

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...