Name: preparing irradiated and marked male aedes aegypti mosquitoes for release in an operational sterile insect technique program
Uploaded: 2021-03-12T14:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program at JoVE.com

Agradecemos a los Drs. R.-D. Xue, C. Bibbs, W. Qualls y V. Aryaprema del Distrito de Control de Mosquitos de Anastasia, St. Augustine, Florida, por su asociación en el desarrollo del programa SIT y la visión experta sobre la liberación operativa efectiva del macho estéril Aedes aegypti. Esta investigación fue apoyada por el USDA-ARS y el Departamento de Agricultura y Servicios al Consumidor de Florida (FDACS). La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del USDA o FDACS.

<ol>
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Todos los autores no han declarado ningún conflicto de intereses.

El inicio de un programa de control con TIE que utiliza radiación requiere el establecimiento de una cepa local de Aedes aegypti. Este paso es crítico y puede permitir que SIT se distinga realmente de tecnologías de control similares. Al desarrollar el proyecto a partir de una cepa local de mosquitos, los machos generados probablemente tendrán comportamientos que les permitan adaptarse a los cambios y señales ambientales y localizar y aparearse con hembras silvestres en las cercanías. Además, la liberación de machos locales irradiados puede no generar una opinión pública negativa en comparación con, por ejemplo, la liberación de una cepa no local de mosquitos modificados genéticamente que podría, por ejemplo, introducir nuevos alelos en la población local de mosquitos.
Gastar recursos sustanciales para criar grandes cantidades de mosquitos solo para poder usar aproximadamente la mitad de ellos con fines de control es una limitación del programa Aedes aegypti SIT. Se deben hacer refinamientos al protocolo de cría para condensar la maduración de las larvas en plazos más definidos cuando las pupas estén listas. Esto permitiría recolectar más pupas en el momento óptimo de separación. Sin embargo, las pupas adicionales para procesar aumentan el riesgo de que más hembras pupan cuando se recolectan las pupas y, por lo tanto, aumentan la probabilidad de que las hembras terminen en placas de Petri con machos y posiblemente sean liberadas. Aunque la esperanza de vida, el comportamiento de alimentación sanguínea y el comportamiento de oviposición en pupas hembras irradiadas de Aedes aegypti se reducen en adultos, no es una buena estrategia liberar hembras incidentalmente junto con machos irradiados22. Por lo tanto, debe seguir siendo una prioridad minimizar el número de hembras separadas, irradiadas, marcadas y liberadas inadvertidamente con machos.
El éxito de un programa SIT depende en última instancia de la competencia exitosa de pareja por machos irradiados criados en colonias. La preservación de la competitividad masculina se basa en la selección exhaustiva de la dosis derivada experimentalmente y en la maximización de la proporción estimada de machos estériles:salvajes en la población. La selección de la dosis está determinada por varios factores clave que incluyen la longevidad, la fertilidad, la fecundidad y la mortalidad de las pupas. Se ha observado que los mosquitos machos exhibirán una curva de fertilidad asintótica que se acerca a cero a medida que aumenta la radiación (datos no publicados de KJL, RLA, SCB). Simultáneamente, la longevidad y los niveles de actividad del mosquito macho disminuyen exponencialmente a medida que aumenta la dosis de radiación (datos no publicados de KJL, RLA, SCB). Por lo tanto, en lugar de identificar una dosis que produzca una esterilidad del 99,9% en los hombres, es preferible centrarse en un porcentaje de esterilidad más bajo mientras se apoya la supervivencia. Una vez que se identifica un rango de dosis que no diferencia la longevidad o la mortalidad pupal de los machos irradiados de la de los machos no irradiados, se deben realizar evaluaciones adicionales sobre la fertilidad para identificar una dosis que haga que los machos sean abrumadoramente estériles, pero competitivos.
Al mismo tiempo, es fundamental comparar el número de mosquitos machos en la población con el de machos irradiados liberados. Esto se puede lograr recolectando machos de varios lugares dentro y alrededor del área de liberación objetivo repetidamente desde el mismo lugar y antes, durante y después del inicio del programa SIT. Se debe realizar un estudio de marca, liberación y recaptura para evaluar la proporción de mosquitos machos salvajes a mosquitos liberados. Un estudio de marca, liberación y recaptura se basa en la liberación de un número conocido de mosquitos marcados desde un punto específico y su posterior recaptura en puntos cercanos que rodean el punto de liberación inicial. Al comparar el número de machos recapturados y machos silvestres a distancias desde el punto de liberación, es posible estimar la población silvestre general de machos en el área de modo que se puedan liberar proporciones competitivas de machos estériles23. La maximización de la proporción de machos estériles: salvajes se puede lograr liberando machos más estériles y / o reduciendo la población silvestre por medios de control clásicos como la reducción de la fuente, el control inmaduro o los tratamientos adulticidas.
Para medir la efectividad de las liberaciones masculinas estériles, las colecciones de adultos se pueden comparar cronológicamente con un área de no intervención. A medida que se liberan machos estériles y el número de machos y hembras recolectados en un área disminuye en relación con un área comparable de no intervención, entonces se puede plantear la hipótesis de que se debe a que los machos estériles liberados superan con éxito a los machos fértiles locales. Este efecto también se puede observar en las copas trampa de oviposición desplegadas tanto en los sitios de intervención como en los de no intervención. Los huevos aún pueden producirse en el sitio de intervención, pero si eclosionan menos que los del sitio de no intervención, se puede plantear la hipótesis de que no están fertilizados debido a que las hembras se aparean con machos estériles. Más y más oviposición de huevos no fertilizados podrían eventualmente conducir a una reducción de la oviposición debido a la no sustitución de hembras en el sitio de intervención 8,24.
Las direcciones futuras de la tecnología y los programas de TIE se expanden naturalmente a otras especies de mosquitos médicamente importantes. Por ejemplo, esta tecnología puede adaptarse fácilmente para controlar Aedes albopictus, dada la bionomía muy similar de Aedes aegypti y Aedes albopictus. Otras especies de mosquitos vectores de enfermedades de interés incluyen Culex quinquefasciatus, Culex tarsalis y varias especies de Anopheles. Mejorar la eficacia de esta tecnología depende de aumentar la capacidad de las pupas macho producidas en un momento dado, lo que podría lograrse mediante manipulación genética o selección artificial, y mejorar la competitividad masculina, que podría lograrse aumentando la virilidad, la fertilidad o la longevidad.
En última instancia, los programas SIT no son una bala de plata para controlar los mosquitos. En cambio, son una herramienta en un conjunto de otras técnicas de control, como los programas de IVM, que compensan las debilidades entre las técnicas. Por ejemplo, mientras que el control químico ofrece un control rápido y barato, también fomenta el desarrollo de resistencia y mortalidad no objetivo; y mientras que la TIE es específica de cada especie y no es probable que genere resistencia, los machos TIE deben producirse y liberarse a perpetuidad para controlar las poblaciones migratorias de fuera del distrito de control de vectores.

La transmisión de patógenos transmitidos por mosquitos a los seres humanos causa millones de casos de enfermedad y muertes cada año en todo el mundo. En ausencia de vacunas efectivas y aprobadas para enfermedades transmitidas por mosquitos, como el Zika o el dengue, una de las formas más efectivas de reducir la transmisión es reducir las poblaciones de mosquitos vectores de enfermedades. Es preocupante que un número creciente de especies de mosquitos, tradicionalmente blanco de pesticidas, muestren niveles crecientes de resistencia a los plaguicidas1. Al mismo tiempo, las agencias gubernamentales han dado de baja o prohibido agresivamente los plaguicidas previamente aprobados, y se están desarrollando pocas medidas nuevas y efectivas de control químico 2,3. Esta constelación de obstáculos para el control de mosquitos ha motivado la exploración de técnicas alternativas no químicas para reducir las poblaciones de mosquitos.
Ciertas especies de mosquitos presentan desafíos para controlar los problemas de resistencia y registro de plaguicidas. Aedes aegypti (L.) es un mosquito vector de enfermedad prominente que es extremadamente difícil de controlar a través del manejo tradicional integrado de vectores debido al hábitat peridoméstico críptico explotado por esta especie para el desarrollo inmaduro y el descanso adulto 4,5. Los desafíos relacionados con la explotación del hábitat críptico alrededor de las residencias incluyen la dificultad de llegar a estos lugares con técnicas de pulverización de pesticidas, así como la posible falta de aceptación por parte del público para el acceso repetido a la propiedad privada para que las agencias de control de vectores de salud pública realicen las actividades intensivas de vigilancia y control cruciales para el manejo integrado de vectores (GIV) efectivo para esta especie.
Afortunadamente, SIT, un enfoque que ha demostrado ser exitoso para el control duradero de otras especies de insectos altamente desafiantes6, se está aplicando al problema de Aedes aegypti en una serie innovadora de experimentos y ensayos operativos con sede en St. Augustine, Florida (datos no publicados de KJL, RLA, SCB). La TIE se ha aplicado a una variedad de especies de insectos, incluidos los mosquitos, y se ha revisado en profundidad 7,8. SIT aprovecha la liberación masiva de machos criados en colonias esterilizados, por ejemplo, por exposición a radiación ionizante o productos químicos para abrumar la elección de pareja de las poblaciones naturales de hembras. Los machos esterilizados que se aparean con hembras salvajes hacen que los huevos sean infértiles debido al daño sufrido por los gametos masculinos, y si están presentes en cantidades suficientes, teóricamente pueden colapsar la población natural de Aedes aegypti.
Se inició un programa SIT para intentar reducir las poblaciones de Aedes aegypti en un área urbana en la costa atlántica de Florida, donde esta especie se recolonizó recientemente y se está expandiendo y presenta un riesgo para la salud pública para la transmisión de virus como Zika, dengue o chikungunya. Para maximizar el potencial de compatibilidad con las hembras silvestres, se estableció una nueva colonia utilizando Aedes aegypti capturado en el medio silvestre de la población objetivo para producir machos para el programa9. Esto se basó en la hipótesis de que los machos criados en colonias derivados localmente tendrían más probabilidades de competir con los machos salvajes locales para aparearse con las hembras salvajes locales. Para que la TIE sea efectiva, no solo es necesario que un número abrumador de machos estériles estén presentes en el área objetivo, sino que también deben ser capaces de cortejar y aparearse eficazmente con mosquitos hembras silvestres locales.
Se realizó una serie de experimentos para determinar el número óptimo de machos estériles a liberar (datos no publicados de KJL, RLA, SCB), así como dosis óptimas de radiación que harían que los machos fueran infértiles sin interferir con la supervivencia, el comportamiento o la aceptación por parte de las hembras salvajes (datos no publicados de KJL, RLA, SCB). Estos datos se publican en publicaciones aliadas de este grupo, pero algunos de estos hallazgos también se capturan en este protocolo y podrían usarse como punto de partida para nuevos programas de control de Aedes aegypti de SIT en otros lugares. Esta especie está expandiendo constantemente su rango, y los programas SIT muestran una gran promesa de ser soluciones rentables a largo plazo para controlar esta población. El objetivo de este protocolo es producir mosquitos Aedes aegypti esterilizados, machos y criados en colonias para su liberación sistemática en áreas al aire libre para interrumpir los ciclos reproductivos naturales de las poblaciones locales de Aedes aegypti en un programa operativo de control de vectores de salud pública.
Si bien se han publicado protocolos y flujos de trabajo similares para la producción de machos transgénicos de Aedes aegypti y flujos de trabajo de producción para Aedes SIT, o programas de incompatibilidad basados en Wolbachia en otros lugares, este protocolo ilustra cómo se han adaptado los protocolos existentes para la producción, separación e irradiación de pupas macho de Aedes aegypti, marcado y envasado de machos adultos, y envío al sitio de liberación para este programa 9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Es posible que el componente de marcado de este protocolo no sea necesario en un programa SIT operativo maduro; sin embargo, se ha incluido aquí porque es una forma de monitorear la eficacia y controlar la calidad de todo el proceso en los primeros años de establecer el programa SIT. Los programas de control de mosquitos suelen ser administrados por las autoridades locales, por lo que pueden variar ampliamente en muchos aspectos de su organización, desde el tamaño y la base de financiación hasta el ajuste de las tácticas de control para maximizar el éxito local. Por lo tanto, el protocolo descrito en este documento debe evaluarse para determinar su compatibilidad con los recursos disponibles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-1/8&#34; wrench (1&#34; (1 inch) = 2.54 cm)</td>
			<td>Craftsman</td>
			<td>CMMT44707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL)</td>
			<td>Science Supplies WLE corp</td>
			<td>1/2 pint</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; tubing - tygon</td>
			<td>Hudson Extrusions</td>
			<td>LLDPE1/8 X 1/4 BLK</td>
			<td>to attach to CO2 gas regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; brass barb w/ MIP connection</td>
			<td>B&#38;K</td>
			<td>BHB-85NLB</td>
			<td>to attach to CO2 gas regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL graduated plastic beakers with handle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1223-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3000 mL graduated plastic beakers with handle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1223-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult large cage</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1450D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator vials</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver powder</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>290039601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brewers yeast</td>
			<td>MP Biomericals</td>
			<td>02903312-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 regulator</td>
			<td>Randor</td>
			<td>64003038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank (20# canister)</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>CDBEVCARB20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection basin</td>
			<td>Treasure Gurus</td>
			<td>KI-ENAMELBOWL</td>
			<td>for separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton balls - large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-456-883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deli cups w/lids - 470 mL</td>
			<td>Pactiv DELItainer</td>
			<td>PCTYSD2516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deli cups w/lids - 1900 mL</td>
			<td>Berry Global</td>
			<td>T60764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DoseReader 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dosimetry film</td>
			<td colspan="2">Far West Technology, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AP10045S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flashlight aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - fine featherweight</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>4748 or 4750</td>
			<td>featherweight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAFchromic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>radiochromic film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammator M</td>
			<td>Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ</td>
			<td></td>
			<td>Cesium-137 irradiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held mechanical aspirator</td>
			<td>Clarke Mosquito</td>
			<td>13500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambskin condoms</td>
			<td>Trojan</td>
			<td>Naturalamb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large CO2 chamber</td>
			<td>Sterilite</td>
			<td colspan="2">Walmart #&#160;568789514</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval rearing pans</td>
			<td>Blue Ridge Thermoforming</td>
			<td>&#160;01-FG-400-3N-ABS</td>
			<td>Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnets - 20# pull</td>
			<td>Master magnetics</td>
			<td>MHHH20BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking dye</td>
			<td>Dayglo</td>
			<td>ECO-11</td>
			<td>Aurora Pink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking dye</td>
			<td>Dayglo</td>
			<td>ECO-17</td>
			<td>Saturn Yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Falk</td>
			<td></td>
			<td>T301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasture pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes - large</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-090 CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes - small (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupa separator</td>
			<td>J.W. Hock</td>
			<td>1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red rubber hose</td>
			<td>Welch</td>
			<td>331040-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release containers</td>
			<td>Science Supplies WLE corp</td>
			<td>1 gallon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands - cross #19</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>ALL37196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands - latitude #64</td>
			<td>Skillcraft</td>
			<td>NSN0589974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>H-4737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed germination paper - Heavy stock 76#</td>
			<td>Anchor Paper</td>
			<td>#76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5&#34;</td>
			<td>MrBoxonline.com</td>
			<td colspan="2">Husky Foam Cooler kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve #20</td>
			<td>Advantech</td>
			<td>20BS8F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve #30</td>
			<td>Advantech</td>
			<td>30BS8F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small cage - Bug Dorm</td>
			<td>MegaView</td>
			<td>Bug Dorm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small CO2 chamber</td>
			<td>Mainstays</td>
			<td colspan="2">Walmart #&#160;562922221</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souffle cup lid</td>
			<td>SOLO</td>
			<td>41165277456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL)</td>
			<td>SOLO</td>
			<td>41165024104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td>ocelo</td>
			<td>MMM7274FD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squeeze bottle</td>
			<td>Dynalon</td>
			<td>3UUP6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Meiji Techno</td>
			<td>EMZ-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stockinette</td>
			<td>BSN Medical</td>
			<td>30-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>extruded polystyrene foam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropical fish flake food</td>
			<td>Tetra</td>
			<td>4.52 pound</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum chamber - desiccator</td>
			<td>BelArt</td>
			<td>T9FB892757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing irradiated and marked male aedes aegypti mosquitoes for release in an operational sterile insect technique program

El control de enfermedades humanas como el dengue, el zika y el chikungunya depende del control de su vector, el mosquito Aedes aegypti , porque no hay prevención. El control de los mosquitos vectores puede basarse en productos químicos aplicados a las etapas inmadura y adulta, lo que puede contribuir a la mortalidad de los no objetivos y, lo que es más importante, conducir a la resistencia a los insecticidas en el vector. La técnica del insecto estéril (TIE) es un método para controlar las poblaciones de plagas a través de la liberación de machos adultos esterilizados que se aparean con hembras silvestres para producir descendencia no viable. Este documento describe el proceso de producción de machos estériles para su uso en un programa operativo de TIE para el control de mosquitos Aedes aegypti . Aquí se describen los pasos utilizados en el programa, incluida la cría y el mantenimiento de una colonia, la separación de pupas machos y hembras, la irradiación y el marcado de machos adultos y el envío de machos de Aedes aegypti al sitio de liberación. También se discuten las advertencias de procedimiento, las limitaciones del programa y los objetivos futuros.

La cría vigilante y adecuada de mosquitos consiste en una disponibilidad bien equilibrada de machos y hembras en jaulas de colonias, el mantenimiento de una solución fresca de sacarosa y miel, y una alimentación sanguínea constante de alta calidad. Estas condiciones proporcionarán hojas de huevos densamente empaquetadas óptimas para su uso en bandejas de cría larvaria SIT. El almacenamiento y uso adecuados de hojas de huevo secas, como el etiquetado sistemático para facilitar el uso de la más antigua a la más nueva, apoyará la eclosión uniforme en todas las sartenes. Llenar todas las sartenes de cría de larvas con agua antes de la eclosión puede disminuir el tiempo durante el cual las hojas de huevos están en los contenedores para incubar y promover un desarrollo saludable. El mantenimiento de las sartenes larvales desde la eclosión hasta la pupación requiere un compromiso cuidadoso por parte del personal de la colonia, ya que algunas sartenes pueden necesitar más o menos alimento o agua adicional dependiendo de las etapas de desarrollo y las variables ambientales. Si hay problemas con la etapa de desarrollo para el día programado de la separación del sexo de la pupa, los ajustes deben hacerse antes en el proceso, como eclosionar antes o después, ajustar los alimentos o cambiar la temperatura de la incubadora.
El proceso de cría en este protocolo no hace que todos los huevos eclosionados a tiempo se conviertan en pupas que puedan ser irradiadas y utilizadas con fines de control. Entre el 20 y el 50% de los mosquitos criados en colonias seguirán siendo larvas cuando las pupas necesiten ser separadas. Sin embargo, estas larvas no se desperdician, sino que se dejan madurar durante 24 h para producir pupas adicionales que pueden combinarse con pupas hembras de la separación del día anterior y reciclarse de nuevo en jaulas de colonias. En las jaulas de la colonia, se permitirá que las pupas maduren y se conviertan en adultos, se apareen, se alimenten de sangre y produzcan huevos que sostengan el proyecto SIT.
La separación de las pupas, el vertido de pupas en placas de Petri, la irradiación y la colocación en jaulas de retención de adultos después de la irradiación deben ocurrir en un día; Por lo tanto, se debe asignar el tiempo adecuado para procesar todos los pasos cómodamente. El montaje y la preparación de los contenedores de liberación deben realizarse antes del proceso de marcado. Cuando las cajas de envío se devuelven desde el sitio de liberación, los contenedores de liberación deben inspeccionarse y prepararse para su próximo uso. Desechar las bolas de algodón húmedas, ventilar los recipientes de liberación húmeda, limpiar las placas de Petri, reemplazar la malla y quitar las bandas elásticas del contenedor, mientras no estén en uso, prolongará en gran medida la vida útil de los contenedores de liberación.
Dada la realidad mundial de la pandemia viral de COVID-19, este protocolo, que suele ser una operación de varias personas, ha sido modificado para que sea manejable por una persona que trabaja sola en un laboratorio para cada paso. Los pasos en el proceso que se ven más obstaculizados por un escenario de una sola persona son los pasos de sexado, marcado, pesaje y mantenimiento de la cría de colonias. La separación de las pupas por sexo por una persona debería ser suficiente si hay múltiples separadores que operan simultáneamente en diferentes habitaciones. En una situación de pandemia en la que se produce el distanciamiento social en el lugar de trabajo, se requiere equipar varias estaciones para completar los pasos desde el sexado hasta el embalaje. Dependiendo de la velocidad del operador, se necesita una persona ~ 4 h para tener sexo con 15,000 mosquitos y luego otra 1-2 h para marcarlos, pesarlos y empaquetarlos. Un escenario de dos personas disminuye el tiempo durante el cual los mosquitos son anestesiados para marcar y reduce el tiempo total de trabajo. Sin embargo, incluso en un escenario de dos personas, asignar los 2.0 g completos de mosquitos por jaula de liberación puede ser un desafío debido al tiempo de trabajo limitado mientras los mosquitos están sedados. Aunque el proceso de limpieza y preparación de materiales de cría de larvas y adultos requiere mucho tiempo y mano de obra, se puede dividir de modo que los operadores individuales puedan trabajar de forma independiente y segura durante una pandemia.
La liberación de machos adultos, marcados e irradiados de Aedes aegypti está fuera del alcance de este protocolo, pero se presenta aquí en breve. El proceso de liberación de mosquitos machos marcados, irradiados comienza determinando una distribución uniforme de liberación de los contenedores de liberación basada en pesos (y, por lo tanto, números inferidos de machos estériles), como se informa en la Tabla 3. Después de que los envíos se entregan al distrito de control de vectores, se abren las cajas y se evalúan los contenedores de liberación para detectar cualquier problema con la mortalidad o la condición de los contenedores de liberación. A continuación, se permite que los mosquitos en los contenedores de liberación se aclimaten a la temperatura ambiente y la humedad durante 1-2 h antes del transporte al área de tratamiento. Los sitios de liberación en el área de tratamiento se identifican después de una vigilancia intensiva de puntos calientes de poblaciones silvestres de Aedes aegypti. El momento, la frecuencia y la densidad de las liberaciones se equilibran con la bionomía de la especie, así como con la meteorología, el apoyo público y las capacidades de cría en laboratorio.
Como los contenedores de liberación específicos se adaptan a sitios de liberación particulares, la etiqueta debe verificarse antes de abrir el contenedor de liberación cortando la malla en la parte superior, lo que permite al operador deformar la malla para que una parte de los machos pueda escapar. Este método de liberación fraccionada se repite en cada punto de liberación asignado para el contenedor hasta que todos los machos que vuelan libremente hayan sido liberados. Este proceso se repite para cada contenedor de liberación en su respectiva ubicación de liberación asignada hasta que se hayan procesado todos los contenedores. Opcionalmente, después de que los mosquitos hayan sido liberados, cualquier mosquito muerto o discapacitado que no se haya ido libremente puede recogerse en placas de Petri y etiquetarse para ser contado a mano o pesado para corregir el número estimado liberado. Se lleva a cabo una vigilancia continua y generalizada de las etapas adulta, de huevo e inmaduras de Aedes aegypti silvestre en el área objetivo, y posiblemente en sitios de control sin intervención, para evaluar la eficacia de la operación de TIE.

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Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

La técnica del insecto estéril (TIE) se utiliza para controlar poblaciones específicas de mosquitos médicamente importantes que pueden ser resistentes a los controles químicos. Aquí, describimos un método de cría masiva y preparación de mosquitos machos estériles para su liberación en un programa operativo de TIE dirigido al mosquito Aedes aegypti .

Preparación de mosquitos Aedes aegypti machos irradiados y marcados para su liberación en un programa operativo de técnica de insectos estériles

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...

El valor único de este protocolo es que dos miembros del personal que utilizan equipos fácilmente disponibles en pequeños espacios de laboratorio pueden producir suficientes mosquitos estériles para apoyar un programa SIT operativo de 50 acres. La eficiencia y el bajo costo de esta técnica la hacen accesible, intratable incluso para los pequeños distritos de control de mosquitos para aumentar su programa integrado de control de vectores. Demostraremos el procedimiento y yo y Barbara Bayer, técnicos de laboratorio de ciencias biológicas de la unidad de investigación.Para criar Aedes aegypti adulto de las pupas, prepare jaulas de crianza de aluminio plegables de 60 por 60 por 60 centímetros con malla de fibra de vidrio de 0.84 por 0.84 milímetros y una manga de calcetín en una pared vertical de cada jaula. Coloque un vaso de plástico de 1.900 mililitros con pupas de Aedes aegypti en una proporción de sexos de uno a uno en cada jaula de cría y cierre la manga, dejando las copas en jaulas para la eclosión durante unos cuatro días a 28 a 30 grados centígrados superiores al 50% de humedad relativa en un ciclo de luz:oscuridad a las 12:12 o 14:10 hasta que no surjan más adultos. 24 horas después de colocar las pupas en las jaulas de cría, coloque un recipiente de solución de sacarosa al 10% con una mecha de esponja en cada jaula y suspenda una esponja de 10 por 2 centímetros empapada en miel de un gancho de alambre para proporcionar hidratación y nutrición respectivamente a los mosquitos adultos.48 a 72 horas después de que la mayoría de los adultos hayan salido cada dos o tres días durante las próximas tres o cuatro semanas a partir de entonces, llene el condón de piel de cordero con 50 a 100 mililitros de sangre bovina desfibrinada por jaula, y caliente los condones a aproximadamente 37 grados centígrados en un baño de agua caliente. Después de palmear cuidadosamente los condones con la toalla, coloque los condones parcialmente secos en placas de Petri forradas de papel individuales dentro de las jaulas durante 30 a 60 minutos. De 48 a 72 horas después de cada alimentación de sangre, coloque una taza de oviposición de 1, 900 mililitros que contenga 800 mililitros de agua de pupa filtrada y provista de una hoja de 8 a 10 por 30 centímetros de papel de germinación de semillas colocada a ras a lo largo de la circunferencia interna de la taza en cada jaula.Para criar las larvas de Aedes aegypti de los huevos, use un papel de oviposición con 5, 000 a 10, 000 huevos presentes y corte una sección de tres a siete centímetros perpendicular a la línea de oviposición. Coloque la pieza en un nuevo recipiente de 460 mililitros medio lleno de agua del grifo y una pizca de copos de comida para peces pulverizados. Cubra y agite el recipiente vigorosamente durante al menos un minuto antes de verter todo el contenido en una sartén para criar larvas que contenga tres litros de agua del grifo y 50 mililitros de lechada marrón.Marque la sartén con la fecha de inicio, la información de la cepa y el horario de alimentación. Una vez que se haya alcanzado la proporción umbral aproximada de larvas en las sartenes para larvas, vierta el contenido de cada sartén a través de un tamiz de tamaño 20 a 40 y use una botella exprimida de agua del grifo para lavar las pupas y las larvas del tamiz en un vaso de precipitados de plástico graduado de tres litros. Para separar las pupas macho de las larvas y las pupas hembra, divida el contenido de cada vaso de precipitados entre múltiples recipientes de plástico de 1.9 litros y coloque un recipiente de recolección rígido y poco profundo de cuatro litros debajo de la esclusa en la base de un separador de pupa.Llene dos vasos de plástico graduado de tres litros aproximadamente tres cuartos llenos de agua del grifo y vierta el agua a través del espacio entre las placas de vidrio del separador mientras ajusta las perillas superior e inferior para permitir que el agua fluya continuamente a través del separador. Una vez que el agua estancada se haya acumulado uniformemente a una altura de aproximadamente 1,25 centímetros desde la base de las placas, marque las posiciones iniciales en las perillas inferiores del separador con cinta adhesiva y comience a verter los recipientes de pupas y larvas en el separador mientras gira continuamente las perillas inferiores en sentido contrario a las agujas del reloj de uno a dos centímetros de las posiciones iniciales. Cuando la mayoría o todas las larvas se hayan lavado a través de la esclusa en el recipiente de recolección, detenga el flujo de agua y use un tamiz número 30 para limpiar el recipiente de recolección de las larvas.Cuando se hayan eliminado todas las larvas, vierta el agua y ajuste las perillas nuevamente para permitir que las pupas macho se enjuaguen en el recipiente de recolección. Luego vierta las pupas macho del recipiente en un tamiz número 20 y use una botella de un litro de agua del grifo para lavar las pupas del tamiz en un recipiente separado de 1.9 litros. Cuando se hayan recogido todas las pupas macho, vierta el agua y ajuste las perillas para permitir que se recojan las pupas hembras.Usando el tamiz número 20 para transferir las pupas hembras a un nuevo recipiente de 1,9 litros como se acaba de demostrar. Luego vierta el agua y ajuste las perillas nuevamente hasta que todos los mosquitos inmaduros hayan sido expulsados del separador. Cuele las pupas macho recolectadas con un colador y lave la caca en un vaso de precipitados graduado de un litro con la menor cantidad de agua posible.Vierta cuidadosamente las pupas en placas de Petri forradas con papel de filtro húmedo en una sola capa. Retire el agua estancada del fondo de la placa de Petri con una pipeta fresca de pasto de tres mililitros para evitar el movimiento de la pupa durante el trabajo. Agrupe las placas de Petri y las pilas antes de sellarlas dentro de una bolsa resellable de 3,8 litros etiquetada para que quepa en la cámara de irradiación.Para marcar lotes cuantificados de mosquitos machos adultos irradiados, retire cualquier fuente de nutrición de la jaula de cría y coloque una jaula en una cámara grande de dióxido de carbono durante cinco a siete minutos, golpeando los lados del recipiente para desalojar cualquier mosquito que se adhiera a las paredes. Al final del período de exposición, transfiera los mosquitos a un vial aspirador y anestesie a los mosquitos nuevamente antes de agitar los mosquitos en una superficie de trabajo cubierta de papel blanco. Aspirar cuidadosamente todos los machos de la superficie de trabajo en un nuevo vial y repetir las exposiciones y la recolección hasta que todos los machos adultos hayan sido recogidos de todas las jaulas de cría.En algún momento durante el proceso de clasificación por sexo, genere un vial que contenga solo 25 mosquitos machos adultos. Cuando todos los machos hayan sido recolectados, pese cada vil de mosquitos en un bote de pesaje con tara en una balanza, y vierta rápidamente los mosquitos pesados en un recipiente de cartulina de 240 mililitros que contenga 50 miligramos por tinte marcador. Incline y gire el recipiente una rotación completa en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj hasta que todos los mosquitos hayan sido ligeramente cubiertos y vierta los mosquitos en un nuevo bote de pesaje, luego doble el bote de pesaje por la mitad para permitir que los mosquitos se canalicen a través de la manga de la estona hacia el recipiente de liberación.Cuando se hayan agregado aproximadamente dos gramos de mosquitos machos al contenedor de liberación, ate la manga de la estona cerrada y marque la cinta de etiquetado en el bisel del recipiente de liberación con el color del tinte, el número del recipiente y el peso total de los mosquitos. En este experimento representativo de cría, irradiación y comercialización de mosquitos adultos Aedes aegypti, se pudieron recolectar dos gramos de mosquitos adultos machos de tres jaulas de cría y junto con dos viales de 25 machos de dos jaulas para permitir el cálculo del peso promedio por mosquito. 25 hembras fueron descartadas en total de dos de los lotes.La alimentación oportuna y observacional durante la semana de crianza de las larvas es fundamental para generar pupas bien desarrolladas para la separación. Esto genera una clara distinción entre machos y hembras que conduce a una baja incidencia de hembras en los pasos de marcado. Además de usarlos en programas operativos de TIE, estos machos estériles también se pueden usar ampliamente en experimentos que investigan la competencia de apareamiento, la supervivencia y la dispersión de machos irradiados en comparación con los machos salvajes no irradiados.La modificación de la técnica para incluir mosquitos hembra nos permite investigar el impacto de la liberación no intencional de hembras irradiadas con respecto a la fecundidad y la competencia vectorial.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Investigación

Biología

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (Aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

La disección de las glándulas salivales y del intestino medio de Ae. aegypti

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Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

La construcción de un mosquito mejor: La identificación de los genes que permiten resistencia a la malaria y el dengue en A. gambiae y A. aegypti

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

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RNAi mediada por Gene y Derribo<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo de diuresis en Mujeres Adultas<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Los mosquitos

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

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Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Sistema de cultivo de órganos de grasa corporal en Aedes Aegypti, Vector del Virus Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Mantener los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Rendimiento medio de selección de ensayos para la evaluación de efectos sobre la Ca2 +-señalización y reacción acrosómica en espermatozoides humanos

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...