Name: cryo-em and single-particle analysis with scipion
Uploaded: 2021-05-29T13:00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

يود المؤلفون أن يعترفوا بالدعم الاقتصادي من: وزارة العلوم والابتكار الإسبانية من خلال المنح: PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033، "Comunidad Autónoma de Madrid" من خلال المنحة: S2017/BMD-3817، Instituto de Salud Carlos III, PT17/0009/0010 (ISCIII-SGEFI/ERDF)، الاتحاد الأوروبي (الاتحاد الأوروبي) والأفق 2020 من خلال المنحة: INSTRUCT - ULTRA (INFRADEV-03-2016-2017، اقتراح: 731005)، الحياة EOSC (INFRAEOSC-04-2018، اقتراح: 824087) و iNEXT - Discovery (اقتراح: 871037) و HighResCells (ERC - 2018 - SyG ، الاقتراح: 810057). وقد حظي المشروع الذي أدى إلى هذه النتائج بدعم من مؤسسة "لا كايكا" (ID 100010434). رمز الزمالة هو LCF/BQ/DI18/11660021. وقد حصل هذا المشروع على تمويل من برنامج أفق 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاق منحة ماري سكلودوسكا كوري رقم 713673. يقر المؤلفون بدعم واستخدام موارد مشروع "أوتات"، وهو مشروع لاندمارك إسفري.

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Resolution+Revolution.">The Resolution Revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>. 1.15 A structure of human apoferritin obtained from Titan Mono- BCOR microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/7A6A">https://www.rcsb.org/structure/7A6A</a> (2021)</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturizing+EM+Sample+Preparation:+Opportunities,+Challenges,+and+"Visual+Proteomics".">Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics".</a> PROTEOMICS. 18 (5-6), 1700176 (2018).</li><li>Faruqi, A. R., McMullan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+detectors+for+electron+microscopy.">Direct imaging detectors for electron microscopy.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 878, 180-190 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+image+processing+for+single-particle+analysis+by+electron+cryomicroscopy+and+challenges+ahead.">Advances in image processing for single-particle analysis by electron cryomicroscopy and challenges ahead.</a> Current Opinion in Structural Biology. 52, 127-145 (2018).</li><li>Martinez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Cryo-EM+Model+Building+Software+in+Scipion.">Integration of Cryo-EM Model Building Software in Scipion.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 60, 2533-2540 (2020).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195, 93-99 (2016).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xmipp+3.0:+an+improved+software+suite+for+image+processing+in+electron+microscopy.">Xmipp 3.0: an improved software suite for image processing in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 184, 321-328 (2013).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. The Resolution Revolution: Recent Advances In cryoEM. , 125-157 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14, 290-296 (2017).</li><li>Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+structures+of+macromolecules+using+single-particle+analysis+in+EMAN.">3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN.</a> Methods in Molecular Biology. 673, 157-173 (2010).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3, 1941-1974 (2008).</li><li>Wagner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPHIRE-crYOLO+is+a+fast+and+accurate+fully+automated+particle+picker+for+cryo-EM.">SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM.</a> Communications Biology. 2, (2019).</li><li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy.">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 142, 334-347 (2003).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 67, 235-242 (2011).</li><li>Liebschner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+structure+determination+using+X-rays,+neutrons+and+electrons:+recent+developments+in+Phenix.">Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix.</a> Acta Crystallographica Section D. 75, 861-887 (2019).</li><li>Wong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+Plasmodium+falciparum+80S+ribosome+bound+to+the+anti-protozoan+drug+emetine.">Cryo-EM structure of the Plasmodium falciparum 80S ribosome bound to the anti-protozoan drug emetine.</a> eLife. 3, 03080 (2014).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+direct+detection+device+micrographs+using+a+robust+Optical+Flow+approach.">Alignment of direct detection device micrographs using a robust Optical Flow approach.</a> Journal of Structural Biology. 189, 163-176 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., Jonic, S., Nunez Ramirez, R., Boisset, N., Carazo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+robust+and+accurate+determination+of+transmission+electron+microscopy+contrast+transfer+function.">Fast, robust and accurate determination of transmission electron microscopy contrast transfer function.</a> Journal of Structural Biology. 160, 249-262 (2007).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pattern+matching+approach+to+the+automatic+selection+of+particles+from+low-contrast+electron+micrographs.">A pattern matching approach to the automatic selection of particles from low-contrast electron micrographs.</a> Bioinformatics. 29, 2460-2468 (2013).</li><li>Sanchez-Garcia, R., Segura, J., Maluenda, D., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Consensus,+a+deep+learning-based+approach+for+particle+pruning+in+cryo-electron+microscopy.">Deep Consensus, a deep learning-based approach for particle pruning in cryo-electron microscopy.</a> IUCrJ. 5, 854-865 (2018).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171, 197-206 (2010).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+approach+to+the+initial+volume+problem+in+Single+Particle+Analysis+by+Electron+Microscopy.">A statistical approach to the initial volume problem in Single Particle Analysis by Electron Microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 189, 213-219 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarm+optimization+as+a+consensus+technique+for+Electron+Microscopy+Initial+Volume.">Swarm optimization as a consensus technique for Electron Microscopy Initial Volume.</a> Applied Analysis and Optimization. 2, 299-313 (2018).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204, 329-337 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+Accurate+Estimation+of+Local+Resolution+for+Electron+Microscopy+Maps.">MonoRes: Automatic and Accurate Estimation of Local Resolution for Electron Microscopy Maps.</a> Structure. 26, 337-344 (2018).</li><li>Ramirez-Aportela, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+local+resolution-based+sharpening+of+cryo-EM+maps.">Automatic local resolution-based sharpening of cryo-EM maps.</a> Bioinformatics. 36, 765-772 (2020).</li><li>Heymann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+3D+EM+Reconstructions:+The+Phantom+in+the+Noise.">Validation of 3D EM Reconstructions: The Phantom in the Noise.</a> AIMS Biophys. 2, 21-35 (2015).</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+An+integrated,+database-drive+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: An integrated, database-drive pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166, 95-102 (2009).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151, 41-60 (2005).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

حاليا، التبريد-EM هو أداة رئيسية للكشف عن هيكل 3D من العينات البيولوجية. عندما يتم جمع بيانات جيدة مع المجهر، وأدوات المعالجة المتاحة تسمح لنا للحصول على إعادة بناء 3D من الجزيئات الكلية قيد الدراسة. معالجة البيانات Cryo-EM قادرة على تحقيق دقة شبه ذرية، وهو أمر أساسي لفهم السلوك الوظيفي للجزيء الكلي، وهو أيضا أمر بالغ الأهمية في اكتشاف المخدرات.
Scipion هو برنامج يسمح بإنشاء سير العمل بأكمله يجمع بين حزم معالجة الصور الأكثر ملاءمة بطريقة تكاملية ، مما يساعد على تتبع وإعادة إنتاج سير عمل معالجة الصور بأكمله. Scipion يوفر مجموعة كاملة جدا من الأدوات لتنفيذ المعالجة؛ ومع ذلك، يعتمد الحصول على عمليات إعادة بناء عالية الدقة بشكل كامل على جودة البيانات المكتسبة وكيفية معالجة هذه البيانات. 
للحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة ، فإن المطلب الأول هو الحصول على أفلام جيدة من المجهر ، والتي تحافظ على المعلومات الهيكلية بدقة عالية. إذا لم يكن هذا هو الحال، سير العمل لن تكون قادرة على استخراج معلومات عالية الوضوح من البيانات. ثم، يجب أن يكون سير عمل المعالجة الناجح قادرا على استخراج الجسيمات التي تتوافق حقا مع البنية والعثور على اتجاهات هذه الجسيمات في الفضاء ثلاثي الأبعاد. إذا فشلت أي من الخطوات في سير العمل، سيتم تخفيض جودة وحدة التخزين المعاد بناؤها. يسمح Scipion باستخدام حزم مختلفة في أي من خطوات المعالجة ، مما يساعد على العثور على النهج الأكثر ملاءمة لمعالجة البيانات. وعلاوة على ذلك، وبفضل توفر العديد من الحزم، يمكن استخدام أدوات توافق الآراء، التي تعزز الدقة من خلال التوصل إلى اتفاق في النواتج المقدرة لمختلف الأساليب. كما تمت مناقشته بالتفصيل في قسم النتائج التمثيلية العديد من أدوات التحقق من الصحة وكيفية تحديد النتائج الدقيقة وغير الدقيقة في كل خطوة من سير العمل، للكشف عن المشاكل المحتملة، وكيفية محاولة حلها. هناك عدة نقاط تفتيش على طول البروتوكول التي يمكن أن تساعد على تحقيق ما إذا كان البروتوكول قيد التشغيل بشكل صحيح أم لا. بعض من أهمها: الانتقاء، التصنيف 2D، تقدير الحجم الأولي، والمحاذاة ثلاثية الأبعاد. التحقق من المدخلات، وتكرار الخطوة بطريقة مختلفة، أو باستخدام توافق الآراء، هي الخيارات المتاحة في Scipion التي يمكن للمستخدم استخدامها لإيجاد حلول عندما تظهر القضايا. 
فيما يتعلق بالنهج السابقة لدمج الحزمة في مجال Cryo-EM ، Appion31 هو الوحيد الذي يسمح بالتكامل الحقيقي لحزم البرامج المختلفة. ومع ذلك ، يرتبط Appion بإحكام مع Leginon32 ، وهو نظام لجمع الصور الآلي من المجاهر الإلكترونية. الفرق الرئيسي مع Scipion هو أن نموذج البيانات والتخزين أقل اقترانا. في مثل هذه الطريقة ، لإنشاء بروتوكول جديد في Scipion ، يحتاج فقط إلى تطوير سيناريو Python. ومع ذلك، في Appion، يجب على المطور كتابة البرنامج النصي وتغيير قاعدة البيانات الأساسية. وباختصار، تم تطوير Scipion لتبسيط الصيانة والتمدد.
قدمنا في هذه المخطوطة سير عمل كامل لمعالجة Cryo-EM ، باستخدام مجموعة بيانات الحالة الحقيقية ل Plasmodium falciparum 80S Ribosome (إدخال EMPIAR: 10028 ، إدخال EMDB: 2660). يمكن تلخيص الخطوات التي تمت تغطيتها ومناقشتها هنا على أنها محاذاة الأفلام وتقدير CTF واختيار الجسيمات والتصنيف 2D وتقدير الخريطة الأولي والتصنيف ثلاثي الأبعاد والصقل ثلاثي الأبعاد والتقييم والمعالجة اللاحقة. واستخدمت مجموعات مختلفة من المقترحات، وطبقت أدوات توافق الآراء في العديد من هذه الخطوات. حقق المجلد النهائي المعاد بناؤه ثلاثي الأبعاد قرارا قدره 3 Å ، وفي حجم ما بعد المعالجة ، يمكن تمييز بعض الهياكل الثانوية ، مثل ألفا - helices ، مما يساعد على وصف كيفية ترتيب الذرات في الفضاء.
يوضح سير العمل المعروض في هذه المخطوطة كيف يمكن استخدام Scipion للجمع بين حزم Cryo-EM المختلفة بطريقة مباشرة ومتكاملة لتبسيط المعالجة ، والحصول على نتيجة أكثر موثوقية في نفس الوقت.
في المستقبل ، فإن تطوير أساليب وحزم جديدة سوف تستمر في النمو والبرمجيات مثل Scipion لدمج بسهولة كل منهم سيكون أكثر أهمية للباحثين. وستكون نهج توافق الآراء أكثر أهمية حتى في هذه الحالات، عندما تتوفر الكثير من الأساليب ذات الأساس المختلف، مما يساعد على الحصول على تقديرات أكثر دقة لجميع البارامترات التي تنطوي عليها عملية إعادة الإعمار في كريو -م. تتبع وإعادة إنتاجها هي المفتاح في عملية البحث وأسهل لتحقيق مع Scipion بفضل وجود إطار مشترك لتنفيذ مهام سير العمل كاملة.

في المجهر الإلكترون المبرد (cryo-EM) ، يعد تحليل الجسيمات المفردة (SPA) للعينات المجمدة المائية الزخوبة أحد أكثر المتغيرات استخداما ونجاحا للتصوير للجزيئات الجزيئية البيولوجية ، لأنه يسمح بفهم التفاعلات الجزيئية ووظيفة الفرق البيولوجية1. ويرجع الفضل في ذلك إلى التقدم الأخير في تقنية التصوير هذه التي أدت إلى "ثورة القرار" 2 وسمحت بالتصميم الناجح للهياكل البيولوجية ثلاثية الأبعاد ذات الدقة شبه الذرية. حاليا، كان أعلى قرار المحرز في SPA cryo-EM 1.15 Å ل apoferritin3 (EMDB الدخول: 11668). وتشمل هذه التطورات التكنولوجية تحسينات في إعداد العينة4، واكتساب الصورة5، وطرق معالجة الصور6. تركز هذه المقالة على هذه النقطة الأخيرة.
باختصار ، فإن الهدف من أساليب معالجة الصور هو تحديد جميع معلمات الاستحواذ لعكس عملية تصوير المجهر واستعادة البنية ثلاثية الأبعاد للعينة البيولوجية قيد الدراسة. هذه المعلمات هي كسب الكاميرا ، والحركة الناجمة عن شعاع ، وانحرافات المجهر (أساسا defocus) ، والتوجه الزاوي 3D وترجمة كل جسيم ، والحالة تشكيلية في حالة وجود عينة مع التغيرات تشكيلية. ومع ذلك ، فإن عدد المعلمات مرتفع جدا ويتطلب cryo-EM استخدام صور منخفضة الجرعة لتجنب تلف الإشعاع ، مما يقلل بشكل كبير من نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) للصور المكتسبة. وبالتالي، لا يمكن حل المشكلة بشكل قاطع، وجميع البارامترات التي يجب حسابها يمكن أن تكون تقديرات فقط. على طول سير عمل معالجة الصور ، يجب تحديد المعلمات الصحيحة ، مع تجاهل المعلمات المتبقية للحصول في النهاية على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة.
يتم جمع البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة المجهر في إطارات. تبسيط، إطار يحتوي على عدد من الإلكترونات التي وصلت إلى موقف معين (بكسل) في الصورة، كلما يتم استخدام أجهزة الكشف عن عد الإلكترونات. في مجال معين من العرض، يتم تجميع عدة إطارات وهذا ما يسمى فيلم. كما يتم استخدام جرعات الإلكترون منخفضة لتجنب الأضرار الإشعاعية التي يمكن أن تدمر العينة، وSNR منخفضة جدا والأطر المقابلة لنفس الفيلم تحتاج إلى أن يكون متوسط للحصول على صورة تكشف عن معلومات هيكلية حول العينة. ومع ذلك ، لا يتم تطبيق متوسط بسيط فحسب ، بل يمكن أن تعاني العينة من نوبات وأنواع أخرى من الحركات خلال وقت التصوير بسبب الحركة الناجمة عن الحزمة التي تحتاج إلى تعويض. تنشأ الإطارات التي يتم تعويضها ومتوسطها في التحول صورة مصغرة.
بمجرد الحصول على الصور الدقيقة ، نحتاج إلى تقدير الانحرافات التي أدخلها المجهر لكل منها ، والتي تسمى وظيفة نقل التباين (CTF) ، والتي تمثل التغيرات في تباين المجهر كدالة للتردد. ثم، يمكن اختيار الجسيمات واستخراجها، وهو ما يسمى التقاط الجسيمات. يجب أن يكون كل جسيم صورة صغيرة تحتوي على نسخة واحدة فقط من العينة قيد الدراسة. هناك ثلاث عائلات من الخوارزميات لاختيار الجسيمات: 1) تلك التي تستخدم فقط بعض المعلمات الأساسية لظهور الجسيمات للعثور عليها في مجموعة كاملة من micrographs (على سبيل المثال، حجم الجسيمات)، 2) تلك التي تعلم كيف تبدو الجسيمات من المستخدم أو مجموعة مدربة مسبقا، و 3) تلك التي تستخدم قوالب الصور. كل عائلة لها خصائص مختلفة سيتم عرضها لاحقا.
سيتم استخدام المجموعة المستخرجة من الجسيمات الموجودة في الصور الدقيقة في عملية تصنيف ثنائية الأبعاد لها هدفان: 1) تنظيف مجموعة الجسيمات عن طريق التخلص من المجموعة الفرعية التي تحتوي على صور الضوضاء النقية أو الجسيمات المتداخلة أو القطع الأثرية الأخرى ، و 2) يمكن استخدام الجسيمات المتوسطة التي تمثل كل فئة كمعلومات أولية لحساب حجم أولي ثلاثي الأبعاد. 
حساب حجم 3D الأولي هو الخطوة الحاسمة التالية. يمكن النظر إلى مشكلة الحصول على البنية ثلاثية الأبعاد على أنها مشكلة تحسين في مشهد حل متعدد الأبعاد ، حيث الحد الأدنى العالمي هو أفضل وحدة تخزين ثلاثية الأبعاد تمثل الهيكل الأصلي ، ولكن يمكن العثور على العديد من الحلول المحلية الصغيرة التي تمثل حلول دون المستوى الأمثل ، وحيث يكون من السهل جدا الوقوع في الفخ. يمثل الحجم الأولي نقطة البداية لعملية البحث ، لذلك يمكن أن يمنعنا تقدير الحجم الأولي السيئ من العثور على الحد الأدنى العالمي. من الحجم الأولي، ستساعد خطوة التصنيف ثلاثي الأبعاد على اكتشاف حالات تشكيلية مختلفة وتنظيف مجموعة الجسيمات مرة أخرى. والهدف من ذلك هو الحصول على مجموعة متجانسة هيكليا من الجسيمات. بعد ذلك، ستكون خطوة التحسين ثلاثية الأبعاد مسؤولة عن تحسين المعلمات الزاوي والترجمة لكل جسيم للحصول على أفضل حجم ثلاثي الأبعاد ممكن. 
وأخيرا، في الخطوات الأخيرة، يمكن شحذ وإعادة بناء 3D التي تم الحصول عليها ومصقول. الشحذ هو عملية لزيادة الترددات العالية للحجم المعاد بناؤه ، والتلميع هو خطوة لزيادة صقل بعض المعلمات ، مثل CTF أو تعويض الحركة الناجم عن الحزمة ، على مستوى الجسيمات. كما يمكن استخدام بعض إجراءات التحقق من الصحة لفهم الدقة المحققة بشكل أفضل في نهاية سير العمل. 
وبعد كل هذه الخطوات، ستساعد عمليات التتبع والالتحام7 على إعطاء معنى بيولوجي لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد التي تم الحصول عليها، من خلال بناء نماذج ذرية من طراز دي نوفو أو تركيب النماذج القائمة. وإذا تحقق قرار عال، فإن هذه العمليات ستخبرنا بمواقف الهياكل البيولوجية، حتى الذرات المختلفة، في هيكلنا.
Scipion8 يسمح بإنشاء سير العمل كله الجمع بين حزم معالجة الصور الأكثر صلة بطريقة تكاملية. Xmipp9، Relion10، CryoSPARC11، Eman12، Spider13، Cryolo14، Ctffind15، CCP416، Phenix17، ويمكن تضمين العديد من الحزم في Scipion. كما أنه يتضمن جميع الأدوات اللازمة للاستفادة من التكامل والتشغيل البيني والتتبع والقابلية لإعادة الإنتاج لجعل تتبع كامل لسير عمل معالجة الصور بالكامل8.
واحدة من أقوى الأدوات التي تسمح لنا Scipion باستخدامها هي توافق الآراء ، مما يعني مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها بعدة طرق في خطوة واحدة من المعالجة ، مما يجعل مزيجا من المعلومات التي تنقلها أساليب مختلفة لتوليد مخرجات أكثر دقة. وهذا يمكن أن يساعد على تعزيز الأداء وتحسين الجودة المحققة في المعلمات المقدرة. لاحظ أنه يمكن إنشاء سير عمل أبسط بدون استخدام أساليب توافق الآراء؛ ومع ذلك، فقد رأينا قوة هذه الأداة22,25 وسير العمل المعروض في هذه المخطوطة سيستخدمها في عدة خطوات.
سيتم شرح جميع الخطوات التي تم تلخيصها في الفقرات السابقة بالتفصيل في القسم التالي ودمجها في سير عمل كامل باستخدام Scipion. كما سيتم عرض كيفية استخدام أدوات توافق الآراء لتحقيق اتفاق أعلى في النواتج الناتجة. وتحقيقا لتلكوم 80S، اختيرت مجموعة البيانات المثلية ل Plasmodium falciparum 80S Ribosome (إدخال EMPIAR: 10028، إدخال EMDB: 2660). يتم تشكيل مجموعة البيانات من قبل 600 فيلم من 16 إطارا من حجم 4096x4096 بكسل في حجم بكسل من 1.34Å التي اتخذت في بولارا FEI 300 مع كاميرا FEI فالكون الثاني، مع قرار ذكرت في EMDB هو 3.2Å18 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>no material is used in this article</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-em and single-particle analysis with scipion

أصبح المجهر الإلكتروني المبرد واحدة من أهم الأدوات في البحوث البيولوجية للكشف عن المعلومات الهيكلية للجزيئات الكبيرة بدقة شبه ذرية. في تحليل الجسيمات المفردة ، يتم تصوير العينة الهزازة بواسطة شعاع إلكترون وتنتج أجهزة الكشف في نهاية عمود المجهر أفلاما لتلك العينة. تحتوي هذه الأفلام على آلاف الصور لجسيمات متطابقة في اتجاهات عشوائية. تحتاج البيانات إلى المرور عبر سير عمل معالجة الصور مع خطوات متعددة للحصول على وحدة التخزين النهائية المعاد بناؤها ثلاثية الأبعاد. الهدف من سير عمل معالجة الصور هو تحديد معلمات الاستحواذ لتكون قادرة على إعادة بناء العينة قيد الدراسة. يوفر Scipion جميع الأدوات اللازمة لإنشاء سير العمل هذا باستخدام حزم معالجة الصور المتعددة في إطار تكاملي ، مما يسمح أيضا بتتبع النتائج. في هذه المقالة يتم تقديم سير عمل معالجة الصور بالكامل في Scipion ومناقشته مع البيانات القادمة من حالة اختبار حقيقية ، مما يعطي جميع التفاصيل اللازمة للانتقال من الأفلام التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر إلى إعادة بناء 3D نهائية عالية الدقة. كما تتم مناقشة قوة استخدام أدوات التوافق التي تسمح بالجمع بين الأساليب، وتأكيد النتائج على طول كل خطوة من سير العمل، وتحسين دقة النتائج التي تم الحصول عليها.

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

تحليل الجسيمات المفردة في المجهر الإلكترون المبرد هو واحد من التقنيات الرئيسية المستخدمة لتحديد بنية الفرق البيولوجية بدقة عالية. Scipion يوفر الأدوات اللازمة لإنشاء خط أنابيب كامل لمعالجة المعلومات التي تم الحصول عليها من المجهر وتحقيق إعادة بناء 3D من العينة البيولوجية.

Cryo-EM وتحليل الجسيمات المفردة مع Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

يوفر Scipion الأدوات اللازمة لإنشاء سير عمل المعالجة بالكامل بطريقة تكاملية لتحليل جسيم واحد في cryo-EM لتحقيق إعادة بناء عالية الدقة للعينة البيولوجية. هذا الإطار يجعل من الممكن إنشاء سير العمل معالجة باستخدام عدة حزم معالجة الصور ، ويفضل التشغيل البيني ، والتتبع ، والاستنساخ ، والجمع بين المعلومات التي تنقلها أساليب مختلفة لتوليد إخراج أكثر دقة. Scipion ينمو باستمرار ، بما في ذلك أساليب جديدة وحزم.وعلاوة على ذلك، فقد تم توسيع نطاقه ليشمل التصوير المقطعي بالإلكترونات المبردة والنمذجة الذرية، مما يسمح أيضا بإنشاء سير عمل لمعالجة هذه البيانات. لإنشاء مشروع في Scipion، انقر فوق إنشاء مشروع لإنشاء المشروع. لاستيراد أفلام المجهر، حدد استيراد الأفلام.ستظهر نافذة جديدة. في هذه النافذة، أدخل المسار إلى البيانات وتعيين الجهد المجهر إلى 300 كيلوفولت، انحراف كروي إلى ملليمترين، والسعة على النقيض من 0.1، ومعدل التكبير إلى 50، 000، ووضع معدل أخذ العينات إلى من الصورة، وحجم بكسل إلى 1.34 angstroms. عند تعيين كافة المعلمات انقر فوق تنفيذ.عند انتهاء الأسلوب، افتح علامة التبويب ملخص انقر فوق تحليل النتائج. ستظهر نافذة جديدة مع قائمة المخرجات التي تم إنشاؤها بواسطة الأسلوب. لتشغيل طريقة التدفق البصري لمحاذاة الأفلام، افتح طريقة المحاذاة البصرية xmipp3، وحدد الأفلام المستوردة كالأفلام المدخلة، ثم قم بتعيين نطاق الإطارات إلى ALIGN من 2 إلى 13.ضمن معلمات إضافية، قم بتعيين استخدام محاذاة الفيلم السابق إلى SUM frames الخيار إلى No.Leave كافة الخيارات الأخرى تعيين إلى القيم الافتراضية الخاصة بهم وتنفيذ البرنامج. انقر على تحليل النتائج للتحقق من الصور الدقيقة التي تم الحصول عليها ومسار التحولات المقدرة. لكل ميكروجراف، من الممكن التحقق من كثافة الطيفية للطاقة، والمسارات التي تم الحصول عليها لمحاذاة الفيلم في كل من الإحداثيات الديكارتية والقطبية، واسم ملف المجهر الذي تم الحصول عليه.لاحظ أن جزيئات العينة أكثر وضوحا في المجهر بالمقارنة مع إطار واحد من الفيلم. بالنسبة لانتقاء الجسيمات، افتح طريقة الانتقاء اليدوي xmipp3 وحدد الميكروجرافات التي تم الحصول عليها مسبقا كميكروجرافات الإدخال. انقر فوق تنفيذ.ستظهر نافذة تفاعلية جديدة. في هذه النافذة، تغيير حجم البكسل إلى 150. ستظهر الصورة المصغرة المحددة في نافذة أكبر.اختر جميع الجسيمات المرئية داخل منطقة واحدة. عندما يتم اختيار جميع الجسيمات يدويا، انقر فوق تنشيط التدريب لبدء التعلم. سيتم اختيار المناطق المتبقية من المجهر تلقائيا.تحقق من الجسيمات الانتقاء. لتضمين جسيم إضافي، انقر على جسيم مهم. لإزالة أي جزيئات غير صحيحة، اضغط على Shift وانقر فوق الجسيمات حسب الضرورة.عندما يتم اختيار جميع الجسيمات تلقائيا، حدد الميكروجرافات الأربعة التالية واحدة في كل مرة لإنشاء مجموعة تدريب تمثيلية. سيتم اختيار الجسيمات في كل ميكروجراف مختار تلقائيا ، والتحقق من كل ميكروجراف لتضمين أو إزالة الجسيمات حسب الضرورة. عند الحصول على مجموعة تدريب، انقر فوق الإحداثيات لحفظ إحداثيات جميع الجسيمات التي تم انتقاؤها.بعد الحصول على مجموعة التدريب ، فتح xmipp3 لصناعة السيارات في اختيار للإشارة إلى قطف اليدوي السابق في Xmipp الجسيمات اختيار تشغيل وتعيين Micrographs لاختيار نفس تحت إشراف. انقر فوق تنفيذ لإنشاء مجموعة من حوالي 100, 000 إحداثيات. لتطبيق نهج توافق الآراء ، وفتح sphire cryolo قطف وتعيين micrographs معالجتها مسبقا كما micrographs المدخلات في نموذج الانتقاء إلى الافتراضي.تعيين عتبة الثقة إلى 0.3 وحجم مربع إلى 150، ثم انقر فوق تنفيذ. يجب أن تقوم الطريقة أيضا بإنشاء حوالي 100,000 إحداثيات. بعد ذلك، افتح اختيار توافق آراء عميق xmipp3 وتعيين إحداثيات الإدخال لتضمين إخراج cryolo sphire و xmipp3 التلقائي الانتقاء، نوع نموذج تحديد إلى مدربة مسبقا، والتدريب تخطي والنتيجة مباشرة مع نموذج مدربة مسبقا إلى نعم، ثم انقر فوق تنفيذ.في نهاية التنفيذ، انقر فوق تحليل النتائج. في النافذة الجديدة، انقر فوق أيقونة العين. ستفتح نافذة جديدة ثانية مع قائمة بجميع الجسيمات.سوف تعطي قيم نقاط Z في العمود نظرة ثاقبة على جودة كل جسيم ، حيث أن القيمة المنخفضة تدل على جودة رديئة. لطلب الجسيمات من أعلى إلى أدنى درجة Z، انقر فوق Xmipp Z-score التعلم العميق وحدد الجسيمات مع درجة Z أعلى من 0.75. ثم انقر فوق إحداثيات لإنشاء مجموعة فرعية جديدة مع إحداثيات 50,000 تقريبا.لحساب الدقة محليا، افتح xmipp3 MonoRes المحلية وتعيين وحدة تخزين الإدخال إلى إخراج الخطوة التحسين الأخيرة، هل ترغب في استخدام half وحدات التخزين إلى نعم، ونطاق الدقة من 1 إلى 10 angstroms. عند تعيين المعلمات، انقر فوق تنفيذ. عند حساب الدقة، انقر فوق تحليل النتائج وحدد إظهار الرسم التكراري للدقة وعرض الشرائح الملونة.سيتم عرض الدقة في الأجزاء المختلفة من وحدة التخزين. وينبغي أن تمثل معظم ال voxels الأجزاء المركزية من الهياكل قرارات حول ثلاثة angstroms ، في حين سيتم رصد أسوأ القرارات في المناطق الخارجية من الهياكل. كما سيتم عرض رسم بياني للقرارات لكل voxel مع ذروة حول أو أقل من ثلاثة angstroms.لتطبيق شحذ، فتح xmipp3 localdeblur شحذ وتحديد الإخراج من الخطوة التحسين الأخير كما خريطة الإدخال، وتعيين خريطة القرار للحصول على خريطة مونوريس. بعد تنفيذ الأمر، انقر نقرا مزدوجا فوق مجموعة وحدات التخزين التي تم إنشاؤها كخرج في علامة التبويب ملخص. يمكن التحقق من وحدات التخزين التي تم إنشاؤها في كل تكرار.كما يوصى بفتح وحدة التخزين باستخدام أدوات أخرى، مثل UCSF Chimera، لمراقبة ميزات وحدة التخزين بشكل أفضل في الأبعاد ثلاثية الأبعاد. في هذا الرقم ، يمكن ملاحظة ارتباط قذيفة فورييه من ثلاثة angstroms ، وهو قريب جدا من حد Nyquist. كما هو موضح، شرائح حجم 3D أعيد بناؤها تظهر مستوى عال من التفاصيل والهياكل محددة جيدا.بعد التحليل المحلي ، فإن معظم voxels المركزية تحقيق قرار أقل من ثلاثة angstroms. غير أن المناطق الخارجية لشرائح الاستبانة المحلية تظهر دقة أقل تتسق مع الضبابية الملاحظة داخل تلك المناطق. بعد المعالجة اللاحقة، يمكن ملاحظة الترددات العالية لحجم الخريطة ثلاثية الأبعاد، مما يكشف عن مزيد من التفاصيل ويحسن التمثيل.عندما يكون القرار الذي تحقق عالية بما فيه الكفاية، حتى بعض الأجزاء الكيميائية الحيوية من الهيكل يمكن ملاحظتها. إذا كان الهيكل الذي تم الحصول عليه منخفض الدقة ، ولم يكن قادرا على التطور إلى هيكل أفضل ، يمكن ملاحظة حجم غير واضح مع ارتباط منخفض لقذيفة فورييه ، ومنحنى الدقة ، والمسكون التكراري للتقدير المحلي. بعد الانتقاء، يمكن فحص التصنيف 2D لتقييم جودة الجسيمات.على سبيل المثال، في هذا التصنيف، تكون الجسيمات صاخبة أو غير مركزة أو مقترنة، مما يشير إلى أن الانتقاء غير صحيح. يمكن إجراء نقطة تفتيش أخرى أثناء تقدير الحجم الأولي. في هذا المثال، تم إنشاء تقدير سيئ باستخدام إعداد غير صحيح للأسلوب.وبمجرد إنتاج خريطة ثلاثية الأبعاد بدقة كافية، فإن الخطوة التالية هي اقتراح نموذج ذري للخريطة. ويمكن القيام بذلك داخل Scipion باستخدام الإضافات النمذجة. ويمكن استخدام هذه التقنية لإعادة بناء الجزيئات البيولوجية بنجاح لتقييم تفاعلاتها الجزيئية ووظيفة الفرقة البيولوجية كأساس لتصميم الأدوية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

سير عمل قوي لمعالجة المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) باستخدام cryoSPARC و RELION و Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

الجمع الروتيني لمجموعات بيانات التبريد EM عالية الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل 200 كيلو فولت

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

تقنية التقشير واللطخة: طريقة تحضير عينة Cryo-EM لفصل الطبقات المفردة عن العينات البيولوجية متعددة الطبقات أو المركزة

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...