Name: cryo-em and single-particle analysis with scipion
Uploaded: 2021-05-29T13:00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende økonomisk støtte fra: Det spanske ministerium for videnskab og innovation gennem tilskud: PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033, "Comunidad Autónoma de Madrid" gennem tilskud: S2017/BMD-3817, Instituto de Salud Carlos III, PT17/0009/0010 (ISCIII-SGEFI/EFRU), Den Europæiske Union (EU) og Horisont 2020 gennem tilskud: INSTRUCT - ULTRA (INFRADEV-03-2016-2017, Forslag: 731005), EOSC Life (INFRAEOSC-04-2018, Forslag: 731005), EOSC Life (INFRAEOSC-04-2018, Forslag: 731005), EOSC Life (INFRAEOSC-04-2018, Forslag: 824087), iNEXT - Discovery (Forslag: 871037) og HighResCells (ERC - 2018 - SyG, Forslag: 810057). Projektet, der gav anledning til disse resultater, modtog støtte fra et stipendium fra "la Caixa" Foundation (ID 100010434). Stipendiumkoden er LCF/BQ/DI18/11660021. Dette projekt har modtaget støtte fra EU's Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen nr. 713673. Forfatterne anerkender støtte og brug af ressourcer Instruct, en Landmark ESFRI projekt.

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Resolution+Revolution.">The Resolution Revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>. 1.15 A structure of human apoferritin obtained from Titan Mono- BCOR microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/7A6A">https://www.rcsb.org/structure/7A6A</a> (2021)</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturizing+EM+Sample+Preparation:+Opportunities,+Challenges,+and+"Visual+Proteomics".">Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics".</a> PROTEOMICS. 18 (5-6), 1700176 (2018).</li><li>Faruqi, A. R., McMullan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+detectors+for+electron+microscopy.">Direct imaging detectors for electron microscopy.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 878, 180-190 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+image+processing+for+single-particle+analysis+by+electron+cryomicroscopy+and+challenges+ahead.">Advances in image processing for single-particle analysis by electron cryomicroscopy and challenges ahead.</a> Current Opinion in Structural Biology. 52, 127-145 (2018).</li><li>Martinez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Cryo-EM+Model+Building+Software+in+Scipion.">Integration of Cryo-EM Model Building Software in Scipion.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 60, 2533-2540 (2020).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195, 93-99 (2016).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xmipp+3.0:+an+improved+software+suite+for+image+processing+in+electron+microscopy.">Xmipp 3.0: an improved software suite for image processing in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 184, 321-328 (2013).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. The Resolution Revolution: Recent Advances In cryoEM. , 125-157 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14, 290-296 (2017).</li><li>Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+structures+of+macromolecules+using+single-particle+analysis+in+EMAN.">3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN.</a> Methods in Molecular Biology. 673, 157-173 (2010).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3, 1941-1974 (2008).</li><li>Wagner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPHIRE-crYOLO+is+a+fast+and+accurate+fully+automated+particle+picker+for+cryo-EM.">SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM.</a> Communications Biology. 2, (2019).</li><li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy.">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 142, 334-347 (2003).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 67, 235-242 (2011).</li><li>Liebschner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+structure+determination+using+X-rays,+neutrons+and+electrons:+recent+developments+in+Phenix.">Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix.</a> Acta Crystallographica Section D. 75, 861-887 (2019).</li><li>Wong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+Plasmodium+falciparum+80S+ribosome+bound+to+the+anti-protozoan+drug+emetine.">Cryo-EM structure of the Plasmodium falciparum 80S ribosome bound to the anti-protozoan drug emetine.</a> eLife. 3, 03080 (2014).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+direct+detection+device+micrographs+using+a+robust+Optical+Flow+approach.">Alignment of direct detection device micrographs using a robust Optical Flow approach.</a> Journal of Structural Biology. 189, 163-176 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., Jonic, S., Nunez Ramirez, R., Boisset, N., Carazo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+robust+and+accurate+determination+of+transmission+electron+microscopy+contrast+transfer+function.">Fast, robust and accurate determination of transmission electron microscopy contrast transfer function.</a> Journal of Structural Biology. 160, 249-262 (2007).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pattern+matching+approach+to+the+automatic+selection+of+particles+from+low-contrast+electron+micrographs.">A pattern matching approach to the automatic selection of particles from low-contrast electron micrographs.</a> Bioinformatics. 29, 2460-2468 (2013).</li><li>Sanchez-Garcia, R., Segura, J., Maluenda, D., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Consensus,+a+deep+learning-based+approach+for+particle+pruning+in+cryo-electron+microscopy.">Deep Consensus, a deep learning-based approach for particle pruning in cryo-electron microscopy.</a> IUCrJ. 5, 854-865 (2018).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171, 197-206 (2010).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+approach+to+the+initial+volume+problem+in+Single+Particle+Analysis+by+Electron+Microscopy.">A statistical approach to the initial volume problem in Single Particle Analysis by Electron Microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 189, 213-219 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarm+optimization+as+a+consensus+technique+for+Electron+Microscopy+Initial+Volume.">Swarm optimization as a consensus technique for Electron Microscopy Initial Volume.</a> Applied Analysis and Optimization. 2, 299-313 (2018).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204, 329-337 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+Accurate+Estimation+of+Local+Resolution+for+Electron+Microscopy+Maps.">MonoRes: Automatic and Accurate Estimation of Local Resolution for Electron Microscopy Maps.</a> Structure. 26, 337-344 (2018).</li><li>Ramirez-Aportela, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+local+resolution-based+sharpening+of+cryo-EM+maps.">Automatic local resolution-based sharpening of cryo-EM maps.</a> Bioinformatics. 36, 765-772 (2020).</li><li>Heymann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+3D+EM+Reconstructions:+The+Phantom+in+the+Noise.">Validation of 3D EM Reconstructions: The Phantom in the Noise.</a> AIMS Biophys. 2, 21-35 (2015).</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+An+integrated,+database-drive+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: An integrated, database-drive pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166, 95-102 (2009).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151, 41-60 (2005).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

I øjeblikket er cryo-EM et vigtigt værktøj til at afsløre 3D-strukturen af biologiske prøver. Når gode data indsamles med mikroskopet, giver de tilgængelige behandlingsværktøjer os mulighed for at opnå en 3D-rekonstruktion af det makromolekyle, der undersøges. Cryo-EM databehandling er i stand til at opnå nær-atomare opløsning, som er nøglen til at forstå den funktionelle adfærd af en makromolekyle og er også afgørende i opdagelse af lægemidler.
Scipion er en software, der gør det muligt at oprette hele arbejdsgangen, der kombinerer de mest relevante billedbehandlingspakker på en integrerende måde, hvilket hjælper sporbarheden og reproducerbarheden af hele billedbehandlingsarbejdsgangen. Scipion giver et meget komplet sæt værktøjer til at udføre behandlingen; Opnåelse af rekonstruktioner med høje opløsninger afhænger imidlertid helt af kvaliteten af de erhvervede data, og hvordan disse data behandles. 
For at få en 3D-rekonstruktion i høj opløsning er det første krav at få gode film fra mikroskopet, som bevarer strukturel information til høj opløsning. Hvis dette ikke er tilfældet, kan arbejdsprocessen ikke udtrække high definition-oplysninger fra dataene. Derefter bør en vellykket behandlingsarbejdsgang være i stand til at udtrække partikler, der virkelig svarer til strukturen og finde retningerne af disse partikler i 3D-rummet. Hvis et af trinnene i arbejdsprocessen mislykkes, forringes kvaliteten af den rekonstruerede diskenhed. Scipion giver mulighed for at bruge forskellige pakker i nogen af behandlingstrinnene, hvilket hjælper med at finde den mest hensigtsmæssige tilgang til at behandle dataene. Takket være mange pakker til rådighed kan der desuden anvendes konsensusværktøjer, der øger nøjagtigheden ved at finde en aftale i de anslåede output af forskellige metoder. Det er også blevet diskuteret i detaljer i sektionen Repræsentative resultater flere valideringsværktøjer, og hvordan man identificerer nøjagtige og unøjagtige resultater i hvert trin i arbejdsgangen, at opdage potentielle problemer, og hvordan man forsøger at løse dem. Der er flere kontrolpunkter langs protokollen, der kan hjælpe med at indse, om protokollen kører korrekt eller ej. Nogle af de mest relevante er: pluk, 2D-klassificering, indledende volumenestimering og 3D-justering. Kontrol af input, gentage trinnet med en anden metode, eller ved hjælp af konsensus, er muligheder tilgængelige i Scipion, at brugeren kan bruge til at finde løsninger, når problemer vises. 
Med hensyn til de tidligere tilgange til pakkeintegration på Cryo-EM-området er Appion31 den eneste, der giver mulighed for reel integration af forskellige softwarepakker. Appion er dog tæt forbundet med Leginon32, et system til automatiseret indsamling af billeder fra elektronmikroskoper. Den største forskel med Scipion er, at datamodel og lagring er mindre koblet. På en sådan måde, for at skabe en ny protokol i Scipion, skal der kun udvikles et Python-script. I Appion skal udvikleren dog skrive scriptet og ændre den underliggende database. Sammenfattende blev Scipion udviklet for at forenkle vedligeholdelse og udvidelsesmuligheder.
Vi har i dette manuskript præsenteret en komplet arbejdsgang for Cryo-EM-behandling ved hjælp af det virkelige tilfælde datasæt af Plasmodium falciparum 80S Ribosome (EMPIAR post: 10028, EMDB post: 2660). De trin, der er omfattet og diskuteret her, kan opsummeres som filmjustering, CTF-estimering, partikelplukning, 2D-klassificering, indledende kortberegning, 3D-klassificering, 3D-raffinement, evaluering og efterbehandling. Der er anvendt forskellige pakker, og der blev anvendt konsensusværktøjer i flere af disse trin. Det endelige 3D-rekonstruerede volumen opnåede en opløsning på 3 Å, og i det postbehandlede volumen kan nogle sekundære strukturer skelnes, som alfa-helices, hvilket hjælper med at beskrive, hvordan atomer er arrangeret i rummet.
Arbejdsgangen i dette manuskript viser, hvordan Scipion kan bruges til at kombinere forskellige Cryo-EM-pakker på en enkel og integrerende måde for at forenkle behandlingen og samtidig opnå et mere pålideligt resultat.
I fremtiden vil udviklingen af nye metoder og pakker fortsætte med at vokse, og software som Scipion til nemt at integrere dem alle vil være endnu vigtigere for forskerne. Konsensustilgange vil være mere relevante, selv da der vil være masser af metoder med forskelligt grundlag til rådighed, hvilket vil bidrage til at opnå mere nøjagtige skøn over alle de parametre, der er involveret i genopbygningsprocessen i Cryo-EM. Sporing og reproducerbarhed er nøglen i forskningsprocessen og lettere at opnå med Scipion takket være at have en fælles ramme for udførelse af komplette arbejdsgange.

I kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) er enkeltpartikelanalyse (SPA) af vitrified frosne hydrerede prøver en af de mest anvendte og succesfulde varianter af billeddannelse til biologiske makromolekyler, da det gør det muligt at forstå molekylære interaktioner og funktionen af biologiske ensembler1. Dette er takket være de seneste fremskridt i denne billeddannelse teknik, der gav anledning til "opløsning revolution"2 og har tilladt en vellykket bestemmelse af biologiske 3D-strukturer med næsten atomare opløsning. I øjeblikket var den højeste opløsning opnået i SPA cryo-EM 1,15 Å for apoferritin3 (EMDB post: 11668). Disse teknologiske fremskridt omfatter forbedringer i prøveforberedelsen4, billedopsamlingen5 og billedbehandlingsmetoderne6. Denne artikel er fokuseret på dette sidste punkt.
Kort sagt er målet med billedbehandlingsmetoderne at identificere alle erhvervelsesparametrene for at vende mikroskopets billeddannelsesproces og genvinde 3D-strukturen af den biologiske prøve, der er under undersøgelse. Disse parametre er gevinsten af kameraet, stråle-induceret bevægelse, afvigelser af mikroskop (primært defokusere), 3D kantede orientering og oversættelse af hver partikel, og den kropslige tilstand i tilfælde af at have en prøve med kropslige ændringer. Antallet af parametre er dog meget højt, og cryo-EM kræver brug af lavdosisbilleder for at undgå strålingsskader, hvilket reducerer signal-til-støj-forholdet (SNR) (SNR) for de erhvervede billeder betydeligt. Problemet kan således ikke løses entydigt, og alle de parametre, der kun skal beregnes, kan være skøn. Langs arbejdsgangen for billedbehandling skal de korrekte parametre identificeres, så de resterende endelig kan få en 3D-rekonstruktion i høj opløsning.
De data, der genereres af mikroskopet, indsamles i rammer. Forenkling, en ramme indeholder antallet af elektroner, der er ankommet til en bestemt position (pixel) i billedet, når elektron-tælle detektorer anvendes. I et bestemt synsfelt indsamles flere rammer, og dette kaldes en film. Da lave elektrondoser bruges til at undgå strålingsskader, der kan ødelægge prøven, er SNR meget lav, og de rammer, der svarer til den samme film, skal beregnes i gennemsnit for at få et billede, der afslører strukturelle oplysninger om prøven. Men ikke kun et simpelt gennemsnit anvendes, prøven kan lide skift og andre former for bevægelser i billeddannelsestiden på grund af stråle-induceret bevægelse, der skal kompenseres. De skiftkompensere og i gennemsnitsrammer stammer fra en mikrograf.
Når mikrograferne er opnået, er vi nødt til at estimere de afvigelser, der er indført af mikroskopet for hver af dem, kaldet Contrast Transfer Function (CTF), som repræsenterer ændringerne i kontrasten af mikrografen som en funktion af frekvensen. Derefter kan partiklerne vælges og ekstraheres, som kaldes partikelplukning. Hver partikel skal være et lille billede, der kun indeholder en kopi af den undersøgte prøve. Der er tre familier af algoritmer til partikelplukning: 1) dem, der kun bruger nogle grundlæggende parameterisering af udseendet af partiklen til at finde dem i hele sættet af mikrografer (f.eks partikelstørrelse), 2) dem, der lærer, hvordan partiklerne ser ud fra brugeren eller et forudbestemt sæt, og 3) dem, der bruger billedskabeloner. Hver familie har forskellige egenskaber, der vil blive vist senere.
Det ekstraherede sæt partikler, der findes i mikrograferne, vil blive brugt i en 2D-klassificeringsproces, der har to mål: 1) rengøring af sæt partikler ved at kassere delsættet, der indeholder rene støjbilleder, overlappende partikler eller andre artefakter, og 2) de gennemsnitlige partikler, der repræsenterer hver klasse, kan bruges som indledende oplysninger til at beregne et 3D-oprindeligt volumen. 
3D-beregningen af den oprindelige diskenhed er det næste afgørende skridt. Problemet med at opnå 3D-strukturen kan ses som et optimeringsproblem i et flerdimensionalt løsningslandskab, hvor det globale minimum er det bedste 3D-volumen, der repræsenterer den oprindelige struktur, men flere lokale minima, der repræsenterer suboptimale løsninger, kan findes, og hvor det er meget nemt at blive fanget. Den oprindelige diskenhed repræsenterer udgangspunktet for søgeprocessen, så dårlig indledende volumenestimering kan forhindre os i at finde det globale minimum. Fra det første volumen vil et 3D-klassificeringstrin hjælpe med at opdage forskellige kropsbygningstilstande og igen rense sæt partikler; målet er at opnå en strukturelt homogen population af partikler. Derefter vil et 3D-raffinementstrin være ansvarlig for at forfine kantede og oversættelsesparametre for hver partikel for at få det bedst mulige 3D-volumen. 
Endelig kan den opnåede 3D-rekonstruktion i de sidste trin skærpes og poleres. Skarphed er en proces med at øge de høje frekvenser af den rekonstruerede volumen, og polering er et skridt til yderligere at forfine nogle parametre, som CTF eller stråle-induceret bevægelse kompensation, på niveau med partikler. Nogle valideringsprocedurer kan også bruges til bedre at forstå den opnåede opløsning i slutningen af arbejdsprocessen. 
Efter alle disse trin vil sporings- og dockingprocesserne7 bidrage til at give den opnåede 3D-rekonstruktion en biologisk betydning ved at bygge atommodeller de novo eller montere eksisterende modeller. Hvis der opnås høj opløsning, vil disse processer fortælle os placeringen af de biologiske strukturer, selv af de forskellige atomer, i vores struktur.
Scipion8 gør det muligt at oprette hele arbejdsgangen, der kombinerer de mest relevante billedbehandlingspakker på en integrerende måde. Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, Eman12, Spider13, Cryolo14, Ctffind15, CCP416, Phenix17 og mange flere pakker kan indgå i Scipion. Den indeholder også alle de nødvendige værktøjer til gavn for integration, interoperabilitet, sporbarhed og reproducerbarhed for at foretage en fuld sporing af hele billedbehandlingsarbejdsgangen8.
Et af de mest kraftfulde værktøjer, som Scipion giver os mulighed for at bruge, er konsensus, hvilket betyder at sammenligne de opnåede resultater med flere metoder i et trin af behandlingen, hvilket gør en kombination af de oplysninger, der formidles af forskellige metoder til at generere et mere præcist output. Dette kan bidrage til at øge ydeevnen og forbedre den opnåede kvalitet i de anslåede parametre. Bemærk, at en enklere arbejdsgang kan opbygges uden brug af konsensusmetoder. Vi har dog set kraften i dette værktøj22,25, og arbejdsgangen, der præsenteres i dette manuskript, vil bruge det i flere trin.
Alle de trin, der er opsummeret i de foregående afsnit, forklares i detaljer i det følgende afsnit og kombineres i en komplet arbejdsproces ved hjælp af Scipion. Også, hvordan man bruger konsensus værktøjer til at opnå en højere aftale i de genererede output vil blive vist. Med henblik herpå er der valgt eksempeldatasæt for Plasmodium falciparum 80S Ribosome (EMPIAR-indgang: 10028, EMDB-indgang: 2660). Datasættet er dannet af 600 film af 16 billeder af størrelse 4096x4096 pixels på en pixel størrelse på 1.34Å taget på en FEI POLARA 300 med en FEI FALCON II kamera, med en rapporteret opløsning på EMDB er 3.2Å18 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>no material is used in this article</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-em and single-particle analysis with scipion

Kryo-elektronmikroskopi er blevet et af de vigtigste værktøjer i biologisk forskning til at afsløre de strukturelle oplysninger om makromolekyler ved næsten atomare opløsning. I enkeltpartikelanalyse afbildes den vitrified prøve af en elektronstråle, og detektorerne for enden af mikroskopkolonnen producerer film af denne prøve. Disse film indeholder tusindvis af billeder af identiske partikler i tilfældige retninger. Dataene skal gennemgå en arbejdsproces for billedbehandling med flere trin for at få den endelige 3D-rekonstruerede diskenhed. Målet med arbejdsprocessen for billedbehandling er at identificere anskaffelsesparametrene for at kunne rekonstruere den undersøgte prøve. Scipion indeholder alle værktøjerne til at oprette denne arbejdsproces ved hjælp af flere billedbehandlingspakker i en integrerende ramme, hvilket også gør det muligt at spore resultaterne. I denne artikel præsenteres og diskuteres hele billedbehandlingsarbejdsgangen i Scipion med data, der kommer fra en rigtig testsag, der giver alle de detaljer, der er nødvendige for at gå fra de film, der er opnået af mikroskopet, til en 3D-rekonstruktion i høj opløsning. Også styrken ved at bruge konsensusværktøjer, der tillader at kombinere metoder og bekræfte resultater langs hvert trin i arbejdsgangen, forbedre nøjagtigheden af de opnåede resultater, diskuteres.

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Enkelt-partikel analyse i kryo-elektron mikroskopi er en af de vigtigste teknikker, der anvendes til at bestemme strukturen af biologiske ensembler ved høj opløsning. Scipion giver værktøjerne til at skabe hele rørledningen til at behandle de oplysninger, der er erhvervet af mikroskopet og opnå en 3D-rekonstruktion af den biologiske prøve.

Cryo-EM og enkeltpartikelanalyse med Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Scipion giver værktøjerne til at skabe hele behandlingsarbejdsgangen på en integrativ måde for en enkelt partikelanalyse i kryo-EM for at opnå en højopløsningsrekonstruktion af den biologiske prøve. Denne ramme gør det muligt at oprette behandlingsarbejdsgangen ved hjælp af flere billedbehandlingspakker, der favoriserer interoperabilitet, sporbarhed, reproducerbarhed og kombinationen af oplysninger, der formidles af forskellige metoder for at generere et mere præcist output. Scipion vokser konstant, herunder nye metoder og pakker.Desuden er det blevet udvidet til kryo-elektrontomografi og atommodellering, hvilket også gør det muligt at skabe arbejdsgange til at behandle disse data. Hvis du vil oprette et projekt i Scipion, skal du klikke på Opret projekt for at oprette projektet. Hvis du vil importere mikroskopfilmene, skal du vælge Importer film.Der vises et nyt vindue. I dette vindue skal du indtaste stien til dataene og indstille mikroskopspændingen til 300 kilovolt, den sfæriske aberration til to millimeter, amplituden kontrast til 0,1, forstørrelseshastigheden til 50.000, samplinghastighedstilstanden til Fra billede og Pixelstørrelsen til 1,34 angstromer. Når alle parametrene er angivet, skal du klikke på Udfør.Når metoden er færdig, skal du åbne fanen Oversigt ved at klikke på Analyser resultater. Der vises et nyt vindue med en liste over de output, der genereres af metoden. Hvis du vil køre den optiske flowmetode til filmjustering, skal du åbne xmipp3-metoden for optisk justering og vælge de importerede film som inputfilm og indstille frames til ALIGN-området fra 2 til 13.Under Yderligere parametre skal du angive Brug forrige filmjustering til indstillingen SUM-rammer til No.Leave alle de andre indstillinger, der er angivet til standardværdierne, og udfør programmet. Klik på Analyser resultater for at kontrollere de opnåede mikrografer og forløbet af de anslåede skift. For hver mikrograf er det muligt at kontrollere effektspektral spektral tæthed, de baner, der opnås for at justere filmen i både kartesiske og polære koordinater og filnavnet på den opnåede mikrograf.Bemærk, at partiklerne i prøven er meget mere synlige i mikrografen sammenlignet med en enkelt ramme af filmen. Til partikelplukning skal du åbne xmipp3 manuel plukmetode og vælge de tidligere opnåede mikrografer som inputmikrografer. Klik på Udfør.Der vises et nyt interaktivt vindue. I dette vindue skal du ændre pixelstørrelsen til 150. Den valgte mikrograf vises i et større vindue.Vælg alle de synlige partikler inden for et område. Når alle partiklerne er plukket manuelt, skal du klikke på Aktivér træning for at starte læringen. De resterende områder af mikrografen plukkes automatisk.Tjek de plukkede partikler. For at inkludere en ekstra partikel skal du klikke på en partikel af interesse. Hvis du vil fjerne eventuelle forkerte partikler, skal du holde Skift nede og klikke på partiklerne efter behov.Når alle partiklerne automatisk er plukket, skal du vælge de næste fire mikrografer en ad gangen for at oprette et repræsentativt træningssæt. Partiklerne i hver udvalgt mikrograf vil automatisk blive plukket, kontrollere hver mikrograf til at omfatte eller fjerne partikler efter behov. Når et træningssæt er anskaffet, skal du klikke på Koordinater for at gemme koordinaterne for alle de plukkede partikler.Når du har erhvervet træningssættet, skal du åbne xmipp3 autoplukning for at angive den tidligere manuelle plukning i Xmipp partikelplukning og indstille mikrografer til at vælge til Samme som overvåget. Klik på Udfør for at generere et sæt på omkring 100.000 koordinater. Hvis du vil anvende konsensustilgang, skal du åbne sphire cryolo-plukning og indstille de forarbejdede mikrografer som inputmikrograferne i plukmodellen til standardmodellen.Angiv spærregrænsen for tillid til 0,3 og boksens størrelse til 150, og klik derefter på Udfør. Metoden skal også generere omkring 100.000 koordinater. Åbn derefter xmipp3 deep consensus picking og indstil inputkoordinaterne til at omfatte outputtet af sphire cryolo og xmipp3 auto-picking, vælg modeltype til pre-uddannet, og Spring træning og score direkte med præ-uddannet model til Ja, og klik derefter på Udfør.Klik på Analyser resultater i slutningen af udførelsen. Klik på øjeikonet i det nye vindue. Et andet nyt vindue åbnes med en liste over alle partiklerne.Z-score værdierne i kolonnen vil give indsigt i kvaliteten af hver partikel, da en lav værdi er tegn på en dårlig kvalitet. For at bestille partiklerne fra den højeste til laveste Z-score skal du klikke på Xmipp Z-score deep learning og vælge partiklerne med en Z-score højere end 0,75. Klik derefter på Koordinater for at oprette et nyt undersæt med ca. 50.000 koordinater.Hvis du vil beregne opløsningen lokalt, skal du åbne xmipp3 lokale MonoRes og indstille inputvolumen til outputtet for det sidste raffinement-trin, vil du bruge halve diskenheder til Ja og løsningsområdet fra 1 til 10 angstromer. Når parametrene er angivet, skal du klikke på Udfør. Når opløsningen er beregnet, skal du klikke på Analyser resultater og vælge Vis histogram for opløsning og Vis farvede udsnit.Opløsningen i de forskellige dele af lydstyrken vises. De fleste af voxels af de centrale dele af strukturerne bør repræsentere beslutninger omkring tre angstroms, mens de værste beslutninger vil blive observeret i de ydre regioner af strukturerne. Et histogramme af opløsningerne pr voxel med en top omkring eller under tre angstroms vil også blive vist.Hvis du vil anvende en skarphed, skal du åbne xmipp3 localdeblur-skarphed og vælge outputtet fra det sidste raffinementstrin som inputkort og indstille opløsningskortet til kortet hent MonoRes. Når kommandoen er udført, skal du dobbeltklikke på det sæt diskenheder, der genereres som output under fanen Oversigt. De diskenheder, der genereres i hver gentagelse, kan kontrolleres.Det anbefales også at åbne lydstyrken med andre værktøjer, såsom UCSF Chimera, for bedre at observere lydstyrken i 3D. I dette tal kan en Fourier shell korrelation af tre angstroms, som er meget tæt på Nyquist-grænsen, observeres. Som illustreret udviser de rekonstruerede 3D-volumenskiver et højt detaljeringsniveau og veldefinerede strukturer.Efter lokal analyse opnår de fleste af de centrale voxels en opløsning under tre angstromer. De ydre regioner i de lokale opløsningsskiver viser imidlertid en lavere opløsning, hvilket er i overensstemmelse med den sløring, der observeres inden for disse områder. Efter efterbehandling kan de højere frekvenser af 3D-kortvolumen observeres, afsløre flere detaljer og forbedre repræsentationen.Når den opnåede opløsning er høj nok, kan selv nogle af de biokemiske dele af strukturen observeres. Hvis den opnåede struktur har en lav opløsning, og ikke er i stand til at blive udviklet til en bedre, en sløret volumen med en lav Fourier shell korrelation, opløsning kurve, og histogramme af den lokale skøn kan observeres. Efter plukning kan 2D-klassificeringen kontrolleres for at evaluere partikelkvaliteten.I denne klassifikation er partiklerne f.eks. støjende, ikke-centrerede eller koblede, hvilket indikerer, at pluk var forkert. Et andet kontrolpunkt kan udføres under det første volumenestimat. I dette eksempel blev der oprettet et forkert forkalkulation ved hjælp af en forkert opsætning for metoden.Når et 3D-kort med en tilstrækkelig opløsning er produceret, er det næste skridt at foreslå en atommodel til kortet. Dette kan gøres inden for Scipion ved hjælp af modellering plugins. Denne teknik kan bruges til med succes at rekonstruere biologiske makromolekyler til evaluering af deres molekylære interaktioner og biologiske ensemble fungere som grundlag for lægemiddeldesign.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse af histonantistofspecifikitet med peptidmikroarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Proteinekspression og -oprensning af menneskelige Lipid-følsomme kation kanal TRPC3 for Strukturbestemmelse af enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuel blot-og-plunge frysning af biologiske prøver til enkelt-partikel kryogen elektronmikroskopi

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Forberedelse af højtemperaturprøvegitre til Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust arbejdsgang for behandling af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med cryoSPARC, RELION og Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinemæssig indsamling af kryo-EM-datasæt i høj opløsning ved hjælp af 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-Blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveforberedelsesmetode til adskillelse af enkeltlag fra flerlags eller koncentrerede biologiske prøver

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...