Name: cryo-em and single-particle analysis with scipion
Uploaded: 2021-05-29T13:00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

De auteurs willen graag economische steun erkennen van: Het Spaanse ministerie van Wetenschap en Innovatie door middel van subsidies: PID2019-104757RB-I00 / AEI / 10.13039 / 501100011033, de "Comunidad Autónoma de Madrid" via Grant: S2017 / BMD-3817, Instituto de Salud Carlos III, PT17 / 0009 / 0010 (ISCIII-SGEFI / EFRO), Europese Unie (EU) en Horizon 2020 door middel van subsidie: INSTRUCT - ULTRA (INFRADEV-03-2016-2017, Voorstel: 731005), EOSC Life (INFRAEOSC-04-2018, Voorstel: 824087), iNEXT - Discovery (Voorstel: 871037) en HighResCells (ERC - 2018 - SyG, Voorstel: 810057). Het project dat aanleiding gaf tot deze resultaten kreeg de steun van een fellowship van "la Caixa" Foundation (ID 100010434). De fellowshipcode is LCF/BQ/DI18/11660021. Dit project heeft financiering ontvangen van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 713673. De auteurs erkennen de steun en het gebruik van middelen van Instruct, een Landmark ESFRI-project.

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Resolution+Revolution.">The Resolution Revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>. 1.15 A structure of human apoferritin obtained from Titan Mono- BCOR microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/7A6A">https://www.rcsb.org/structure/7A6A</a> (2021)</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturizing+EM+Sample+Preparation:+Opportunities,+Challenges,+and+"Visual+Proteomics".">Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics".</a> PROTEOMICS. 18 (5-6), 1700176 (2018).</li><li>Faruqi, A. R., McMullan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+detectors+for+electron+microscopy.">Direct imaging detectors for electron microscopy.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 878, 180-190 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+image+processing+for+single-particle+analysis+by+electron+cryomicroscopy+and+challenges+ahead.">Advances in image processing for single-particle analysis by electron cryomicroscopy and challenges ahead.</a> Current Opinion in Structural Biology. 52, 127-145 (2018).</li><li>Martinez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Cryo-EM+Model+Building+Software+in+Scipion.">Integration of Cryo-EM Model Building Software in Scipion.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 60, 2533-2540 (2020).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195, 93-99 (2016).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xmipp+3.0:+an+improved+software+suite+for+image+processing+in+electron+microscopy.">Xmipp 3.0: an improved software suite for image processing in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 184, 321-328 (2013).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. The Resolution Revolution: Recent Advances In cryoEM. , 125-157 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14, 290-296 (2017).</li><li>Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+structures+of+macromolecules+using+single-particle+analysis+in+EMAN.">3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN.</a> Methods in Molecular Biology. 673, 157-173 (2010).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3, 1941-1974 (2008).</li><li>Wagner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPHIRE-crYOLO+is+a+fast+and+accurate+fully+automated+particle+picker+for+cryo-EM.">SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM.</a> Communications Biology. 2, (2019).</li><li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy.">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 142, 334-347 (2003).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 67, 235-242 (2011).</li><li>Liebschner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+structure+determination+using+X-rays,+neutrons+and+electrons:+recent+developments+in+Phenix.">Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix.</a> Acta Crystallographica Section D. 75, 861-887 (2019).</li><li>Wong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+Plasmodium+falciparum+80S+ribosome+bound+to+the+anti-protozoan+drug+emetine.">Cryo-EM structure of the Plasmodium falciparum 80S ribosome bound to the anti-protozoan drug emetine.</a> eLife. 3, 03080 (2014).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+direct+detection+device+micrographs+using+a+robust+Optical+Flow+approach.">Alignment of direct detection device micrographs using a robust Optical Flow approach.</a> Journal of Structural Biology. 189, 163-176 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., Jonic, S., Nunez Ramirez, R., Boisset, N., Carazo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+robust+and+accurate+determination+of+transmission+electron+microscopy+contrast+transfer+function.">Fast, robust and accurate determination of transmission electron microscopy contrast transfer function.</a> Journal of Structural Biology. 160, 249-262 (2007).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pattern+matching+approach+to+the+automatic+selection+of+particles+from+low-contrast+electron+micrographs.">A pattern matching approach to the automatic selection of particles from low-contrast electron micrographs.</a> Bioinformatics. 29, 2460-2468 (2013).</li><li>Sanchez-Garcia, R., Segura, J., Maluenda, D., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Consensus,+a+deep+learning-based+approach+for+particle+pruning+in+cryo-electron+microscopy.">Deep Consensus, a deep learning-based approach for particle pruning in cryo-electron microscopy.</a> IUCrJ. 5, 854-865 (2018).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171, 197-206 (2010).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+approach+to+the+initial+volume+problem+in+Single+Particle+Analysis+by+Electron+Microscopy.">A statistical approach to the initial volume problem in Single Particle Analysis by Electron Microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 189, 213-219 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarm+optimization+as+a+consensus+technique+for+Electron+Microscopy+Initial+Volume.">Swarm optimization as a consensus technique for Electron Microscopy Initial Volume.</a> Applied Analysis and Optimization. 2, 299-313 (2018).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204, 329-337 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+Accurate+Estimation+of+Local+Resolution+for+Electron+Microscopy+Maps.">MonoRes: Automatic and Accurate Estimation of Local Resolution for Electron Microscopy Maps.</a> Structure. 26, 337-344 (2018).</li><li>Ramirez-Aportela, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+local+resolution-based+sharpening+of+cryo-EM+maps.">Automatic local resolution-based sharpening of cryo-EM maps.</a> Bioinformatics. 36, 765-772 (2020).</li><li>Heymann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+3D+EM+Reconstructions:+The+Phantom+in+the+Noise.">Validation of 3D EM Reconstructions: The Phantom in the Noise.</a> AIMS Biophys. 2, 21-35 (2015).</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+An+integrated,+database-drive+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: An integrated, database-drive pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166, 95-102 (2009).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151, 41-60 (2005).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Momenteel is cryo-EM een belangrijk hulpmiddel om de 3D-structuur van biologische monsters te onthullen. Wanneer goede gegevens met de microscoop worden verzameld, zullen de beschikbare verwerkingstools ons in staat stellen om een 3D-reconstructie van het bestudeerde macromolecuul te verkrijgen. Cryo-EM-gegevensverwerking is in staat om een bijna atomaire resolutie te bereiken, wat de sleutel is tot het begrijpen van het functionele gedrag van een macromolecuul en ook cruciaal is bij het ontdekken van geneesmiddelen.
Scipion is een software die het mogelijk maakt om de hele workflow te creëren door de meest relevante beeldverwerkingspakketten op een integratieve manier te combineren, wat de traceerbaarheid en reproduceerbaarheid van de volledige beeldverwerkingsworkflow ten goede komt. Scipion biedt een zeer complete set tools om de verwerking uit te voeren; het verkrijgen van hoge resolutie reconstructies hangt echter volledig af van de kwaliteit van de verkregen gegevens en hoe deze gegevens worden verwerkt. 
Om een 3D-reconstructie met hoge resolutie te krijgen, is de eerste vereiste om goede films van de microscoop te verkrijgen, die structurele informatie tot hoge resolutie bewaren. Als dit niet het geval is, kan de workflow geen high-definition informatie uit de gegevens extraheren. Vervolgens moet een succesvolle verwerkingsworkflow in staat zijn om deeltjes te extraheren die echt overeenkomen met de structuur en om de oriëntaties van deze deeltjes in de 3D-ruimte te vinden. Als een van de stappen in de workflow mislukt, gaat de kwaliteit van het gereconstrueerde volume achteruit. Scipion maakt het mogelijk om verschillende pakketten te gebruiken in een van de verwerkingsstappen, wat helpt om de meest adequate aanpak te vinden om de gegevens te verwerken. Bovendien kunnen, dankzij het beschikbaar hebben van vele pakketten, consensustools worden gebruikt, die de nauwkeurigheid vergroten door overeenstemming te vinden in de geschatte outputs van verschillende methoden. Ook is het in detail besproken in de sectie Representatieve resultaten verschillende validatietools en hoe u nauwkeurige en onnauwkeurige resultaten in elke stap van de workflow kunt identificeren, potentiële problemen kunt detecteren en hoe u kunt proberen ze op te lossen. Er zijn verschillende checkpoints langs het protocol die kunnen helpen om te beseffen of het protocol goed werkt of niet. Enkele van de meest relevante zijn: picking, 2D-classificatie, initiële volumeschatting en 3D-uitlijning. Het controleren van de invoer, het herhalen van de stap met een andere methode of het gebruik van consensus zijn beschikbare opties in Scipion die de gebruiker kan gebruiken om oplossingen te vinden wanneer er problemen optreden. 
Met betrekking tot de vorige benaderingen van pakketintegratie in het Cryo-EM-veld, is Appion31 de enige die echte integratie van verschillende softwarepakketten mogelijk maakt. Appion is echter nauw verbonden met Leginon32, een systeem voor het geautomatiseerd verzamelen van beelden van elektronenmicroscopen. Het belangrijkste verschil met Scipion is dat datamodel en opslag minder gekoppeld zijn. Op deze manier hoeft er voor het maken van een nieuw protocol in Scipion alleen een Python-script te worden ontwikkeld. In Appion moet de ontwikkelaar echter het script schrijven en de onderliggende database wijzigen. Samenvattend is Scipion ontwikkeld om onderhoud en uitbreidbaarheid te vereenvoudigen.
We hebben in dit manuscript een complete workflow voor Cryo-EM verwerking gepresenteerd, met behulp van de real case dataset van het Plasmodium falciparum 80S Ribosoom (EMPIAR entry: 10028, EMDB entry: 2660). De stappen die hier worden behandeld en besproken, kunnen worden samengevat als filmuitlijning, CTF-schatting, deeltjesselectie, 2D-classificatie, initiële kaartschatting, 3D-classificatie, 3D-verfijning, evaluatie en nabewerking. Er zijn verschillende pakketten gebruikt en in verschillende van deze stappen zijn consensustools toegepast. Het uiteindelijke 3D gereconstrueerde volume bereikte een resolutie van 3 Å en in het nabewerkte volume kunnen enkele secundaire structuren worden onderscheiden, zoals alfa-helices, die helpen beschrijven hoe atomen in de ruimte zijn gerangschikt.
De workflow die in dit manuscript wordt gepresenteerd, laat zien hoe Scipion kan worden gebruikt om verschillende Cryo-EM-pakketten op een eenvoudige en integratieve manier te combineren om de verwerking te vereenvoudigen en tegelijkertijd een betrouwbaarder resultaat te verkrijgen.
In de toekomst zal de ontwikkeling van nieuwe methoden en pakketten blijven groeien en software zoals Scipion om ze allemaal gemakkelijk te integreren zal nog belangrijker zijn voor de onderzoekers. Consensusbenaderingen zullen zelfs dan relevanter zijn, wanneer er veel methoden met verschillende basis beschikbaar zullen zijn, waardoor nauwkeurigere schattingen kunnen worden verkregen van alle parameters die betrokken zijn bij het reconstructieproces in Cryo-EM. Tracking en reproduceerbaarheid zijn de sleutel in het onderzoeksproces en gemakkelijker te bereiken met Scipion dankzij het hebben van een gemeenschappelijk kader voor de uitvoering van volledige workflows.

In cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) is single particle analysis (SPA) van verglaasde bevroren gehydrateerde monsters een van de meest gebruikte en succesvolle varianten van beeldvorming voor biologische macromoleculen, omdat het moleculaire interacties en de functie van biologische ensembles kan begrijpen1. Dit is te danken aan de recente vooruitgang in deze beeldvormingstechniek die aanleiding gaf tot de "resolutierevolutie"2 en die de succesvolle bepaling van biologische 3D-structuren met bijna atomaire resolutie mogelijk heeft gemaakt. Momenteel was de hoogste resolutie bereikt in SPA cryo-EM 1,15 Å voor apoferritin3 (EMDB-vermelding: 11668). Deze technologische vooruitgang omvat verbeteringen in de monstervoorbereiding4, de beeldacquisitie5 en de beeldverwerkingsmethoden6. Dit artikel is gericht op dit laatste punt.
Kortom, het doel van de beeldverwerkingsmethoden is om alle acquisitieparameters te identificeren om het beeldvormingsproces van de microscoop om te keren en de 3D-structuur van het bestudeerde biologische monster te herstellen. Deze parameters zijn de versterking van de camera, de door de bundel geïnduceerde beweging, de aberraties van de microscoop (voornamelijk de onscherpte), de 3D-hoekoriëntatie en vertaling van elk deeltje en de conformatietoestand in het geval van een monster met conformatieveranderingen. Het aantal parameters is echter zeer hoog en cryo-EM vereist het gebruik van lage dosisbeelden om stralingsschade te voorkomen, wat de signaal-ruisverhouding (SNR) van de verkregen beelden aanzienlijk vermindert. Het probleem kan dus niet ondubbelzinnig worden opgelost en alle te berekenen parameters kunnen alleen schattingen zijn. Tijdens de beeldverwerkingsworkflow moeten de juiste parameters worden geïdentificeerd, waarbij de resterende worden weggegooid om uiteindelijk een 3D-reconstructie met hoge resolutie te verkrijgen.
De gegevens die door de microscoop worden gegenereerd, worden verzameld in frames. Simpel gezegd, een frame bevat het aantal elektronen dat op een bepaalde positie (pixel) in het beeld is aangekomen, wanneer elektronenteldetectoren worden gebruikt. In een bepaald gezichtsveld worden verschillende frames verzameld en dit wordt een film genoemd. Omdat lage elektronendoses worden gebruikt om stralingsschade te voorkomen die het monster zou kunnen vernietigen, is de SNR erg laag en moeten de frames die overeenkomen met dezelfde film worden gemiddeld om een beeld te verkrijgen dat structurele informatie over het monster onthult. Er wordt echter niet alleen een eenvoudig gemiddelde toegepast, het monster kan tijdens de beeldvormingstijd verschuivingen en andere soorten bewegingen ondergaan als gevolg van de door de bundel geïnduceerde beweging die moet worden gecompenseerd. De shift-gecompenseerde en gemiddelde frames zijn afkomstig van een micrograaf.
Zodra de micrografieën zijn verkregen, moeten we de aberraties schatten die door de microscoop voor elk van hen worden geïntroduceerd, de contrastoverdrachtfunctie (CTF) genoemd, die de veranderingen in het contrast van de micrograaf als functie van de frequentie vertegenwoordigt. Vervolgens kunnen de deeltjes worden geselecteerd en geëxtraheerd, wat deeltjesplukken wordt genoemd. Elk deeltje moet een kleine afbeelding zijn die slechts één kopie van het bestudeerde monster bevat. Er zijn drie families van algoritmen voor deeltjesselectie: 1) degenen die alleen een basisparametrisatie van het uiterlijk van het deeltje gebruiken om ze te vinden in de hele set micrografieën (bijv. Deeltjesgrootte), 2) degenen die leren hoe de deeltjes eruit zien van de gebruiker of een voorgetrainde set, en 3) degenen die afbeeldingssjablonen gebruiken. Elke familie heeft andere eigenschappen die later worden getoond.
De geëxtraheerde set deeltjes in de micrografieën zal worden gebruikt in een 2D-classificatieproces dat twee doelen heeft: 1) het reinigen van de set deeltjes door de subset met zuivere ruisbeelden, overlappende deeltjes of andere artefacten weg te gooien, en 2) de gemiddelde deeltjes die elke klasse vertegenwoordigen, kunnen worden gebruikt als eerste informatie om een 3D-initieel volume te berekenen. 
De 3D initiële volumeberekening is de volgende cruciale stap. Het probleem van het verkrijgen van de 3D-structuur kan worden gezien als een optimalisatieprobleem in een multidimensionaal oplossingslandschap, waar het globale minimum het beste 3D-volume is dat de oorspronkelijke structuur vertegenwoordigt, maar er verschillende lokale minima kunnen worden gevonden die suboptimale oplossingen vertegenwoordigen en waar het heel gemakkelijk is om gevangen te raken. Het initiële volume vertegenwoordigt het startpunt voor het zoekproces, dus een slechte initiële volumeschatting kan ons verhinderen om het globale minimum te vinden. Vanaf het eerste volume zal een 3D-classificatiestap helpen om verschillende conformatietoestanden te ontdekken en de set deeltjes opnieuw te reinigen; het doel is om een structureel homogene populatie van deeltjes te verkrijgen. Daarna zal een 3D-verfijningsstap verantwoordelijk zijn voor het verfijnen van de hoek- en translatieparameters voor elk deeltje om het best mogelijke 3D-volume te krijgen. 
Ten slotte kan in de laatste stappen de verkregen 3D-reconstructie worden geslepen en gepolijst. Slijpen is een proces van het stimuleren van de hoge frequenties van het gereconstrueerde volume, en het polijsten is een stap om sommige parameters, zoals CTF of beam-geïnduceerde bewegingscompensatie, op het niveau van deeltjes verder te verfijnen. Ook kunnen sommige validatieprocedures worden gebruikt om de bereikte oplossing aan het einde van de workflow beter te begrijpen. 
Na al deze stappen zullen de traceer- en koppelingsprocessen7 helpen om een biologische betekenis te geven aan de verkregen 3D-reconstructie, door atoommodellen de novo te bouwen of bestaande modellen aan te passen. Als een hoge resolutie wordt bereikt, zullen deze processen ons de posities van de biologische structuren, zelfs van de verschillende atomen, in onze structuur vertellen.
Met Scipion8 kunt u de hele workflow creëren door de meest relevante beeldverwerkingspakketten op een integratieve manier te combineren. Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, Eman12, Spider13, Cryolo14, Ctffind15, CCP416, Phenix17 en nog veel meer pakketten kunnen worden opgenomen in Scipion. Het bevat ook alle benodigde tools om de integratie, interoperabiliteit, traceerbaarheid en reproduceerbaarheid ten goede te komen om de volledige beeldverwerkingsworkflow volledig te volgen8.
Een van de krachtigste tools die Scipion ons in staat stelt te gebruiken, is de consensus, wat betekent dat we de resultaten die zijn verkregen met verschillende methoden in één stap van de verwerking kunnen vergelijken, waardoor een combinatie van de informatie wordt gemaakt die door verschillende methoden wordt overgebracht om een nauwkeurigere uitvoer te genereren. Dit kan helpen om de prestaties te verbeteren en de bereikte kwaliteit in de geschatte parameters te verbeteren. Merk op dat een eenvoudigere workflow kan worden gebouwd zonder het gebruik van consensusmethoden; we hebben echter de kracht van deze tool gezien22,25 en de workflow die in dit manuscript wordt gepresenteerd, zal deze in verschillende stappen gebruiken.
Alle stappen die in de vorige paragrafen zijn samengevat, worden in de volgende sectie in detail uitgelegd en gecombineerd in een volledige workflow met behulp van Scipion. Ook zal worden getoond hoe de consensustools kunnen worden gebruikt om een hogere overeenstemming in de gegenereerde outputs te bereiken. Daartoe is gekozen voor de voorbeelddataset van het Plasmodium falciparum 80S Ribosoom (EMPIAR entry: 10028, EMDB entry: 2660). De dataset wordt gevormd door 600 films van 16 frames van grootte 4096x4096 pixels bij een pixelgrootte van 1,34Å genomen bij een FEI POLARA 300 met een FEI FALCON II-camera, met een gerapporteerde resolutie bij EMDB is 3,2Å18 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>no material is used in this article</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-em and single-particle analysis with scipion

Cryo-elektronenmicroscopie is een van de belangrijkste hulpmiddelen in biologisch onderzoek geworden om de structurele informatie van macromoleculen met een bijna atomaire resolutie te onthullen. Bij analyse met één deeltje wordt het verglaasde monster in beeld gebracht door een elektronenbundel en de detectoren aan het einde van de microscoopkolom produceren films van dat monster. Deze films bevatten duizenden afbeeldingen van identieke deeltjes in willekeurige oriëntaties. De gegevens moeten een beeldverwerkingsworkflow doorlopen met meerdere stappen om het uiteindelijke 3D-gereconstrueerde volume te verkrijgen. Het doel van de beeldverwerkingsworkflow is om de acquisitieparameters te identificeren om het bestudeerde monster te kunnen reconstrueren. Scipion biedt alle tools om deze workflow te creëren met behulp van verschillende beeldverwerkingspakketten in een integratief kader, waardoor ook de traceerbaarheid van de resultaten mogelijk is. In dit artikel wordt de hele beeldverwerkingsworkflow in Scipion gepresenteerd en besproken met gegevens afkomstig van een echte testcase, die alle details geeft die nodig zijn om van de films verkregen door de microscoop naar een uiteindelijke 3D-reconstructie met hoge resolutie te gaan. Ook wordt de kracht besproken van het gebruik van consensustools die het combineren van methoden en het bevestigen van resultaten tijdens elke stap van de workflow mogelijk maken, waardoor de nauwkeurigheid van de verkregen resultaten wordt verbeterd.

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Analyse van één deeltje in cryo-elektronenmicroscopie is een van de belangrijkste technieken die worden gebruikt om de structuur van biologische ensembles met hoge resolutie te bepalen. Scipion biedt de tools om de hele pijplijn te creëren om de informatie die door de microscoop wordt verkregen te verwerken en een 3D-reconstructie van het biologische specimen te bereiken.

Cryo-EM en single-particle analyse met Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Scipion biedt de tools om de hele verwerkingsworkflow op een integratieve manier te creëren voor een enkele deeltjesanalyse in cryo-EM om een hoge resolutie reconstructie van het biologische monster te bereiken. Dit raamwerk maakt het mogelijk om de verwerkingsworkflow te creëren met behulp van verschillende beeldverwerkingspakketten, waarbij interoperabiliteit, traceerbaarheid, reproduceerbaarheid en de combinatie van informatie die door verschillende methoden wordt overgebracht, worden bevorderd om een nauwkeurigere uitvoer te genereren. Scipion groeit voortdurend, inclusief nieuwe methoden en pakketten.Bovendien is het uitgebreid naar cryo-elektronentomografie en atomaire modellering, waardoor ook workflows kunnen worden gemaakt om deze gegevens te verwerken. Als u een project wilt maken in Scipion, klikt u op Project maken om het project te maken. Als u de microscoopfilms wilt importeren, selecteert u Films importeren.Er verschijnt een nieuw venster. Voer in dit venster het pad naar de gegevens in en stel de microscoopspanning in op 300 kilovolt, de sferische aberratie op twee millimeter, het amplitudecontrast op 0,1, de vergrotingssnelheid op 50.000, de bemonsteringsfrequentiemodus op Van afbeelding en de pixelgrootte op 1,34 angstroms. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, klikt u op Uitvoeren.Wanneer de methode is voltooid, opent u het tabblad Samenvatting en klikt u op Resultaten analyseren. Er verschijnt een nieuw venster met een lijst met de uitvoer die door de methode wordt gegenereerd. Als u de optische stroommethode voor filmuitlijning wilt uitvoeren, opent u de optische uitlijningsmethode xmipp3 en selecteert u de geïmporteerde films als de invoerfilms en stelt u de frames in op ALIGN-bereik van 2 tot 13.Stel onder Aanvullende parameters de optie Vorige filmuitlijning gebruiken om frames op TE GEVEN in op Nee.Laat alle andere opties ingesteld op hun standaardwaarden en voer het programma uit. Klik op Resultaten analyseren om de verkregen microfoto's en het traject van de geschatte verschuivingen te controleren. Voor elke micrograaf is het mogelijk om de spectrale vermogensdichtheid, de trajecten die zijn verkregen om de film uit te lijnen in zowel de cartesische als de poolcoördinaten en de bestandsnaam van de verkregen micrograaf te controleren.Merk op dat de deeltjes van het monster veel beter zichtbaar zijn in de micrograaf in vergelijking met een enkel frame van de film. Voor deeltjespluk opent u de xmipp3 handmatige pickingmethode en selecteert u de eerder verkregen micrografieën als de invoermicrografen. Klik op Uitvoeren.Er verschijnt een nieuw interactief venster. Wijzig in dit venster de pixelgrootte in 150. De geselecteerde micrograaf verschijnt in een groter venster.Kies alle zichtbare deeltjes binnen één regio. Wanneer alle deeltjes handmatig zijn geselecteerd, klikt u op Training activeren om het leren te starten. De overige gebieden van de micrograaf worden automatisch gekozen.Controleer de geplukte deeltjes. Om een extra deeltje op te nemen, klikt u op een deeltje van belang. Als u onjuiste deeltjes wilt verwijderen, houdt u Shift ingedrukt en klikt u zo nodig op de deeltjes.Wanneer alle deeltjes automatisch zijn geplukt, selecteert u de volgende vier microfoto's één voor één om een representatieve trainingsset te maken. De deeltjes in elke geselecteerde micrograaf worden automatisch geplukt, waarbij elke micrograaf wordt gecontroleerd om deeltjes op te nemen of te verwijderen als dat nodig is. Wanneer een trainingsset is verkregen, klikt u op Coördinaten om de coördinaten van alle geselecteerde deeltjes op te slaan.Na het verkrijgen van de trainingsset, opent u xmipp3 auto-picking om de vorige handmatige picking in Xmipp particle picking run aan te geven en stelt u Micrographs in om te picken op Hetzelfde als onder toezicht. Klik op Uitvoeren om een set van ongeveer 100.000 coördinaten te genereren. Om de consensusbenadering toe te passen, opent u sphire cryolo picking en stelt u de voorbewerkte micrografieën als de invoermicrografen in het pickingmodel in op de standaardinstelling.Stel de betrouwbaarheidsdrempel in op 0,3 en de doosgrootte op 150 en klik vervolgens op Uitvoeren. De methode moet ook ongeveer 100.000 coördinaten genereren. Open vervolgens xmipp3 diepe consensuspicking en stel de invoercoördinaten in om de uitvoer van de sphire cryolo en xmipp3 auto-picking, het selecte modeltype naar voorgetraind en de overslaan van training en score direct met voorgetraind model op te nemen naar Ja en klik vervolgens op Uitvoeren.Klik aan het einde van de uitvoering op Resultaten analyseren. Klik in het nieuwe venster op het oogpictogram. Er wordt een tweede nieuw venster geopend met een lijst van alle deeltjes.De Z-score waarden in de kolom geven inzicht in de kwaliteit van elk deeltje, omdat een lage waarde duidt op een slechte kwaliteit. Om de deeltjes van de hoogste naar de laagste Z-score te ordenen, klikt u op Xmipp Z-score deep learning en selecteert u de deeltjes met een Z-score hoger dan 0,75. Klik vervolgens op Coördinaten om een nieuwe subset te maken met ongeveer 50.000 coördinaten.Om de resolutie lokaal te berekenen, opent u xmipp3 local MonoRes en stelt u het invoervolume in op de uitvoer van de laatste verfijningsstap, de optie Wilt u halve volumes gebruiken voor Ja en het resolutiebereik van 1 tot 10 angstroms. Wanneer de parameters zijn ingesteld, klikt u op Uitvoeren. Wanneer de resolutie is berekend, klikt u op Resultaten analyseren en selecteert u Histogram van resolutie weergeven en Gekleurde segmenten weergeven.De resolutie in de verschillende delen van het volume wordt weergegeven. De meeste voxels van de centrale delen van de structuren zouden resoluties rond drie angstroms moeten vertegenwoordigen, terwijl de slechtste resoluties zullen worden waargenomen in de buitenste regio's van de structuren. Een histogram van de resoluties per voxel met een piek rond of onder drie angstroms zal ook worden getoond.Als u een verscherping wilt toepassen, opent u xmipp3 localdeblur verscherping en selecteert u de uitvoer van de laatste verfijningsstap als Invoertoewijzing en stelt u de resolutietoewijzing in op de monores-toewijzing verkrijgen. Nadat de opdracht is uitgevoerd, dubbelklikt u op de set volumes die als uitvoer is gegenereerd op het tabblad Samenvatting. De volumes die in elke iteratie worden gegenereerd, kunnen worden gecontroleerd.Het wordt ook aanbevolen om het volume te openen met andere hulpmiddelen, zoals UCSF Chimera, om de kenmerken van het volume beter in 3D te observeren. In deze figuur kan een Fourier-schelpcorrelatie van drie angstroms worden waargenomen, die zeer dicht bij de Nyquist-limiet ligt. Zoals geïllustreerd, vertonen de gereconstrueerde 3D-volumesegmenten een hoog detailniveau en goed gedefinieerde structuren.Na lokale analyse bereiken de meeste centrale voxels een resolutie van minder dan drie angstroms. De buitenste gebieden van de lokale resolutiesegmenten vertonen echter een lagere resolutie, wat consistent is met de vervaging die binnen die gebieden wordt waargenomen. Na nabewerking kunnen de hogere frequenties van het 3D-kaartvolume worden waargenomen, waardoor meer details worden onthuld en de weergave wordt verbeterd.Wanneer de bereikte resolutie hoog genoeg is, kunnen zelfs enkele van de biochemische delen van de structuur worden waargenomen. Als de verkregen structuur een lage resolutie heeft en niet kan worden ontwikkeld tot een betere, kan een wazig volume met een lage Fourier-schaalcorrelatie, resolutiecurve en histogram van de lokale schatting worden waargenomen. Na het plukken kan de 2D-classificatie worden gecontroleerd om de deeltjeskwaliteit te evalueren.In deze classificatie zijn de deeltjes bijvoorbeeld luidruchtig, ongecentreerd of gekoppeld, wat aangeeft dat het plukken onjuist was. Een ander controlepunt kan worden uitgevoerd tijdens de eerste volumeschatting. In dit voorbeeld is een slechte schatting gemaakt met behulp van een onjuiste instelling voor de methode.Zodra een 3D-kaart met een voldoende resolutie is geproduceerd, is de volgende stap het voorstellen van een atoommodel voor de kaart. Dit kan binnen Scipion met behulp van de modellering plugins. Deze techniek kan worden gebruikt om met succes biologische macromoleculen te reconstrueren voor evaluatie van hun moleculaire interacties en biologische ensemblefunctie als basis voor medicijnontwerp.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Voorbereiding van hoge temperatuur monsterroosters voor Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

De Peel-Blot-techniek: een cryo-EM-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...