Name: cryo-em and single-particle analysis with scipion
Uploaded: 2021-05-29T13:00:00
Duration: 9 min 6 s
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Die Autoren danken der wirtschaftlichen Unterstützung von: Dem spanischen Ministerium für Wissenschaft und Innovation durch Zuschüsse: PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033, der "Comunidad Autónoma de Madrid" durch Zuschuss: S2017/BMD-3817, Instituto de Salud Carlos III, PT17/0009/0010 (ISCIII-SGEFI/EFRE), Europäische Union (EU) und Horizon 2020 durch Zuschuss: INSTRUCT - ULTRA (INFRADEV-03-2016-2017, Vorschlag: 731005), EOSC Life (INFRAEOSC-04-2018, Vorschlag: 824087), iNEXT - Discovery (Vorschlag: 871037) und HighResCells (ERC - 2018 - SyG, Vorschlag: 810057). Das Projekt, das zu diesen Ergebnissen führte, wurde von der Stiftung "la Caixa" (ID 100010434) mit einem Stipendium unterstützt. Der Stipendiencode lautet LCF/BQ/DI18/11660021. Dieses Projekt wurde aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 713673 gefördert. Die Autoren würdigen die Unterstützung und den Einsatz von Ressourcen von Instruct, einem Landmark ESFRI-Projekt.

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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Derzeit ist Kryo-EM ein Schlüsselwerkzeug, um die 3D-Struktur biologischer Proben aufzudecken. Wenn gute Daten mit dem Mikroskop gesammelt werden, können wir mit den verfügbaren Verarbeitungswerkzeugen eine 3D-Rekonstruktion des untersuchten Makromoleküls erhalten. Die Kryo-EM-Datenverarbeitung ist in der Lage, eine nahezu atomare Auflösung zu erreichen, die für das Verständnis des funktionellen Verhaltens eines Makromoleküls von entscheidender Bedeutung ist und auch für die Wirkstoffforschung von entscheidender Bedeutung ist.
Scipion ist eine Software, die es ermöglicht, den gesamten Workflow zu erstellen und die relevantesten Bildverarbeitungspakete auf integrative Weise zu kombinieren, was die Rückverfolgbarkeit und Reproduzierbarkeit des gesamten Bildverarbeitungsworkflows unterstützt. Scipion bietet einen sehr vollständigen Satz von Werkzeugen, um die Verarbeitung durchzuführen; Die Erzielung hochauflösender Rekonstruktionen hängt jedoch vollständig von der Qualität der erfassten Daten und der Art und Weise ab, wie diese Daten verarbeitet werden. 
Um eine hochauflösende 3D-Rekonstruktion zu erhalten, ist die erste Voraussetzung, gute Filme aus dem Mikroskop zu erhalten, die strukturelle Informationen auf hoher Auflösung erhalten. Ist dies nicht der Fall, kann der Workflow keine hochauflösenden Informationen aus den Daten extrahieren. Dann sollte ein erfolgreicher Verarbeitungsworkflow in der Lage sein, Partikel zu extrahieren, die wirklich der Struktur entsprechen, und die Orientierungen dieser Partikel im 3D-Raum zu finden. Wenn einer der Schritte im Workflow fehlschlägt, verschlechtert sich die Qualität des rekonstruierten Volumes. Scipion ermöglicht die Verwendung verschiedener Pakete in jedem der Verarbeitungsschritte, was dazu beiträgt, den am besten geeigneten Ansatz zur Verarbeitung der Daten zu finden. Darüber hinaus können dank der Verfügbarkeit vieler Pakete Konsenswerkzeuge verwendet werden, die die Genauigkeit erhöhen, indem sie eine Übereinstimmung in den geschätzten Ergebnissen verschiedener Methoden finden. Außerdem wurden im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse mehrere Validierungstools ausführlich diskutiert und wie man genaue und ungenaue Ergebnisse in jedem Schritt des Workflows identifiziert, potenzielle Probleme erkennt und versucht, sie zu lösen. Es gibt mehrere Prüfpunkte entlang des Protokolls, die helfen können zu erkennen, ob das Protokoll ordnungsgemäß ausgeführt wird oder nicht. Einige der relevantesten sind: Kommissionierung, 2D-Klassifizierung, anfängliche Volumenschätzung und 3D-Ausrichtung. Das Überprüfen der Eingaben, das Wiederholen des Schritts mit einer anderen Methode oder das Verwenden eines Konsenses sind Optionen, die in Scipion verfügbar sind, mit denen der Benutzer Lösungen finden kann, wenn Probleme auftreten. 
In Bezug auf die bisherigen Ansätze zur Paketintegration im Cryo-EM-Bereich ist Appion31 der einzige, der eine echte Integration verschiedener Softwarepakete ermöglicht. Appion ist jedoch eng mit Leginon32 verbunden, einem System zur automatisierten Erfassung von Elektronenmikroskopen. Der Hauptunterschied zu Scipion besteht darin, dass Datenmodell und Speicher weniger gekoppelt sind. Um ein neues Protokoll in Scipion zu erstellen, muss nur ein Python-Skript entwickelt werden. In Appion muss der Entwickler jedoch das Skript schreiben und die zugrunde liegende Datenbank ändern. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Scipion entwickelt wurde, um die Wartung und Erweiterbarkeit zu vereinfachen.
Wir haben in diesem Manuskript einen vollständigen Workflow für die Kryo-EM-Verarbeitung vorgestellt, der den realen Falldatensatz des Plasmodium falciparum 80S Ribosoms (EMPIAR-Eintrag: 10028, EMDB-Eintrag: 2660) verwendet. Die hier behandelten und diskutierten Schritte können als Filmausrichtung, CTF-Schätzung, Partikelauswahl, 2D-Klassifizierung, anfängliche Kartenschätzung, 3D-Klassifizierung, 3D-Verfeinerung, Bewertung und Nachbearbeitung zusammengefasst werden. Verschiedene Pakete wurden verwendet und Konsensus-Tools wurden in mehreren dieser Schritte angewendet. Das endgültige rekonstruierte 3D-Volumen erreichte eine Auflösung von 3 Å und im nachbearbeiteten Volumen können einige Sekundärstrukturen unterschieden werden, wie Alpha-Helices, was hilft zu beschreiben, wie Atome im Raum angeordnet sind.
Der in diesem Manuskript vorgestellte Workflow zeigt, wie Scipion verwendet werden kann, um verschiedene Cryo-EM-Pakete auf einfache und integrative Weise zu kombinieren, um die Verarbeitung zu vereinfachen und gleichzeitig ein zuverlässigeres Ergebnis zu erzielen.
In Zukunft wird die Entwicklung neuer Methoden und Pakete weiter wachsen und Software wie Scipion, um sie alle einfach zu integrieren, wird für die Forscher noch wichtiger sein. Konsensansätze werden auch dann relevanter sein, wenn viele Methoden mit unterschiedlicher Basis zur Verfügung stehen werden, die dazu beitragen, genauere Schätzungen aller Parameter zu erhalten, die am Rekonstruktionsprozess in Cryo-EM beteiligt sind. Tracking und Reproduzierbarkeit sind der Schlüssel im Forschungsprozess und dank eines gemeinsamen Frameworks für die Ausführung kompletter Workflows mit Scipion einfacher zu erreichen.

In der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) ist die Einzelpartikelanalyse (SPA) von vitrifizierten gefrorenen hydratisierten Proben eine der am weitesten verbreiteten und erfolgreichsten Varianten der Bildgebung für biologische Makromoleküle, da sie es ermöglicht, molekulare Wechselwirkungen und die Funktion biologischer Ensembles zu verstehen1. Dies ist den jüngsten Fortschritten in dieser Bildgebungstechnik zu verdanken, die zur "Auflösungsrevolution"2 geführt haben und die erfolgreiche Bestimmung biologischer 3D-Strukturen mit nahezu atomarer Auflösung ermöglicht haben. Derzeit betrug die höchste Auflösung, die in SPA-Kryo-EM erreicht wurde, 1,15 Å für Apoferritin3 (EMDB-Eintrag: 11668). Diese technologischen Fortschritte umfassen Verbesserungen in der Probenvorbereitung4, der Bildaufnahme5 und den Bildverarbeitungsmethoden6. Dieser Artikel konzentriert sich auf diesen letzten Punkt.
Kurz gesagt, das Ziel der Bildverarbeitungsmethoden ist es, alle Erfassungsparameter zu identifizieren, um den Bildgebungsprozess des Mikroskops umzukehren und die 3D-Struktur der untersuchten biologischen Probe wiederherzustellen. Diese Parameter sind der Gewinn der Kamera, die strahlinduzierte Bewegung, die Aberrationen des Mikroskops (hauptsächlich die Defokussierung), die 3D-Winkelorientierung und -verschiebung jedes Partikels und der Konformationszustand im Falle einer Probe mit Konformationsänderungen. Die Anzahl der Parameter ist jedoch sehr hoch und Kryo-EM erfordert die Verwendung von niedrig dosierten Bildern, um Strahlenschäden zu vermeiden, was das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) der aufgenommenen Bilder erheblich reduziert. Somit kann das Problem nicht eindeutig gelöst werden und alle zu berechnenden Parameter können nur Schätzungen sein. Entlang des Bildverarbeitungs-Workflows sollten die richtigen Parameter identifiziert und die verbleibenden verworfen werden, um schließlich eine hochauflösende 3D-Rekonstruktion zu erhalten.
Die vom Mikroskop erzeugten Daten werden in Frames gesammelt. Vereinfacht ausgedrückt enthält ein Rahmen die Anzahl der Elektronen, die an einer bestimmten Position (Pixel) im Bild angekommen sind, wenn Elektronenzähldetektoren verwendet werden. In einem bestimmten Sichtfeld werden mehrere Frames gesammelt und dies wird als Film bezeichnet. Da niedrige Elektronendosen verwendet werden, um Strahlenschäden zu vermeiden, die die Probe zerstören könnten, ist der SNR sehr niedrig und die Rahmen, die demselben Film entsprechen, müssen gemittelt werden, um ein Bild zu erhalten, das strukturelle Informationen über die Probe enthüllt. Es wird jedoch nicht nur ein einfacher Mittelwert angewendet, die Probe kann während der Bildgebungszeit aufgrund der strahlinduzierten Bewegung, die kompensiert werden muss, Verschiebungen und andere Arten von Bewegungen erleiden. Die shift-kompensierten und gemittelten Frames stammen aus einer Mikroaufnahme.
Sobald die Mikroaufnahmen erhalten sind, müssen wir die vom Mikroskop für jeden von ihnen eingeführten Aberrationen abschätzen, die als Kontrasttransferfunktion (CTF) bezeichnet werden und die die Änderungen des Kontrasts der Mikroaufnahme als Funktion der Frequenz darstellen. Dann können die Partikel ausgewählt und extrahiert werden, was als Partikelpicking bezeichnet wird. Jedes Partikel sollte ein kleines Bild sein, das nur eine Kopie der untersuchten Probe enthält. Es gibt drei Familien von Algorithmen für die Partikelauswahl: 1) diejenigen, die nur eine grundlegende Parametrisierung des Aussehens des Partikels verwenden, um sie in der gesamten Menge von Mikroaufnahmen (z. B. Partikelgröße) zu finden, 2) diejenigen, die lernen, wie die Partikel vom Benutzer oder einem vortrainierten Satz aussehen, und 3) diejenigen, die Bildvorlagen verwenden. Jede Familie hat unterschiedliche Eigenschaften, die später angezeigt werden.
Der extrahierte Satz von Partikeln, die in den Mikroaufnahmen gefunden wurden, wird in einem 2D-Klassifizierungsprozess verwendet, der zwei Ziele verfolgt: 1) Reinigung des Partikelsatzes durch Verwerfen der Teilmenge, die reine Rauschbilder, überlappende Partikel oder andere Artefakte enthält, und 2) die gemittelten Partikel, die jede Klasse darstellen, könnten als Ersteinformation zur Berechnung eines 3D-Anfangsvolumens verwendet werden. 
Die 3D-Anfangsvolumenberechnung ist der nächste entscheidende Schritt. Das Problem, die 3D-Struktur zu erhalten, kann als Optimierungsproblem in einer mehrdimensionalen Lösungslandschaft angesehen werden, in der das globale Minimum das beste 3D-Volumen ist, das die ursprüngliche Struktur darstellt, aber mehrere lokale Minima, die suboptimale Lösungen darstellen, gefunden werden können und wo es sehr leicht ist, gefangen zu werden. Das Anfangsvolumen stellt den Ausgangspunkt für den Suchprozess dar, so dass eine schlechte anfängliche Volumenschätzung uns daran hindern könnte, das globale Minimum zu finden. Vom Anfangsvolumen aus hilft ein 3D-Klassifikationsschritt, verschiedene Konformationszustände zu entdecken und den Partikelsatz erneut zu reinigen. Ziel ist es, eine strukturell homogene Population von Partikeln zu erhalten. Danach ist ein 3D-Verfeinerungsschritt dafür verantwortlich, die Winkel- und Translationsparameter für jedes Partikel zu verfeinern, um das bestmögliche 3D-Volumen zu erhalten. 
Schließlich kann in den letzten Schritten die erhaltene 3D-Rekonstruktion geschärft und poliert werden. Das Schärfen ist ein Prozess der Steigerung der hohen Frequenzen des rekonstruierten Volumens, und das Polieren ist ein Schritt, um einige Parameter wie CTF oder strahlinduzierte Bewegungskompensation auf der Ebene von Partikeln weiter zu verfeinern. Außerdem könnten einige Validierungsverfahren verwendet werden, um die erreichte Auflösung am Ende des Workflows besser zu verstehen. 
Nach all diesen Schritten werden die Tracing- und Docking-Prozesse7 dazu beitragen, der erhaltenen 3D-Rekonstruktion eine biologische Bedeutung zu verleihen, indem atomare Modelle de novo gebaut oder bestehende Modelle angepasst werden. Wenn eine hohe Auflösung erreicht wird, werden uns diese Prozesse die Positionen der biologischen Strukturen, sogar der verschiedenen Atome, in unserer Struktur mitteilen.
Scipion8 ermöglicht es, den gesamten Workflow zu erstellen und die relevantesten Bildverarbeitungspakete auf integrative Weise zu kombinieren. Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, Eman12, Spider13, Cryolo14, Ctffind15, CCP416, Phenix17 und viele weitere Pakete können in Scipion enthalten sein. Darüber hinaus enthält es alle notwendigen Werkzeuge, um die Integration, Interoperabilität, Rückverfolgbarkeit und Reproduzierbarkeit zu unterstützen, um eine vollständige Verfolgung des gesamten Bildverarbeitungs-Workflows zu ermöglichen8.
Eines der mächtigsten Werkzeuge, die Scipion uns ermöglicht, ist der Konsens, was bedeutet, die Ergebnisse mit mehreren Methoden in einem Schritt der Verarbeitung zu vergleichen und eine Kombination der durch verschiedene Methoden vermittelten Informationen zu erstellen, um eine genauere Ausgabe zu erzeugen. Dies könnte dazu beitragen, die Leistung zu steigern und die erreichte Qualität in den geschätzten Parametern zu verbessern. Beachten Sie, dass ein einfacherer Workflow ohne die Verwendung von Konsensmethoden erstellt werden kann. Wir haben jedoch die Leistungsfähigkeit dieses Tools gesehen22,25 und der in diesem Manuskript vorgestellte Workflow wird es in mehreren Schritten verwenden.
Alle Schritte, die in den vorherigen Absätzen zusammengefasst wurden, werden im folgenden Abschnitt ausführlich erläutert und mit Scipion in einem kompletten Workflow zusammengefasst. Außerdem wird gezeigt, wie die Konsensus-Tools verwendet werden können, um eine höhere Übereinstimmung in den generierten Ergebnissen zu erzielen. Dazu wurde der Beispieldatensatz des Plasmodium falciparum 80S Ribosoms ausgewählt (EMPIAR-Eintrag: 10028, EMDB-Eintrag: 2660). Der Datensatz besteht aus 600 Filmen mit 16 Bildern der Größe 4096x4096 Pixel bei einer Pixelgröße von 1,34 Å, die an einer FEI POLARA 300 mit einer FEI FALCON II-Kamera aufgenommen wurden, wobei die gemeldete Auflösung bei EMDB 3,2 Å18 beträgt.

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cryo-em and single-particle analysis with scipion

Die Kryo-Elektronenmikroskopie ist zu einem der wichtigsten Werkzeuge in der biologischen Forschung geworden, um die Strukturinformationen von Makromolekülen mit nahezu atomarer Auflösung aufzudecken. Bei der Einzelpartikelanalyse wird die verglaste Probe durch einen Elektronenstrahl abgebildet und die Detektoren am Ende der Mikroskopsäule produzieren Filme dieser Probe. Diese Filme enthalten Tausende von Bildern identischer Partikel in zufälligen Orientierungen. Die Daten müssen einen Bildverarbeitungs-Workflow mit mehreren Schritten durchlaufen, um das endgültige rekonstruierte 3D-Volumen zu erhalten. Ziel des Bildverarbeitungs-Workflows ist es, die Erfassungsparameter zu identifizieren, um die untersuchte Probe rekonstruieren zu können. Scipion stellt alle Werkzeuge zur Verfügung, um diesen Workflow mit mehreren Bildverarbeitungspaketen in einem integrativen Rahmen zu erstellen, was auch die Rückverfolgbarkeit der Ergebnisse ermöglicht. In diesem Artikel wird der gesamte Bildverarbeitungsablauf in Scipion vorgestellt und mit Daten aus einem echten Testfall diskutiert, der alle details enthält, die notwendig sind, um von den vom Mikroskop erhaltenen Filmen zu einer hochauflösenden endgültigen 3D-Rekonstruktion zu gelangen. Außerdem wird die Leistungsfähigkeit der Verwendung von Konsenswerkzeugen diskutiert, die es ermöglichen, Methoden zu kombinieren und Ergebnisse in jedem Schritt des Workflows zu bestätigen, wodurch die Genauigkeit der erhaltenen Ergebnisse verbessert wird.

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Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Die Einzelpartikelanalyse in der Kryo-Elektronenmikroskopie ist eine der wichtigsten Techniken, um die Struktur biologischer Ensembles mit hoher Auflösung zu bestimmen. Scipion bietet die Werkzeuge, um die gesamte Pipeline zu erstellen, um die vom Mikroskop erfassten Informationen zu verarbeiten und eine 3D-Rekonstruktion der biologischen Probe zu erreichen.

Kryo-EM- und Einzelpartikelanalyse mit Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Scipion bietet die Werkzeuge, um den gesamten Verarbeitungsablauf auf integrative Weise für eine einzelne Partikelanalyse in Kryo-EM zu erstellen, um eine hochauflösende Rekonstruktion der biologischen Probe zu erreichen. Dieses Framework ermöglicht es, den Verarbeitungsworkflow mit mehreren Bildverarbeitungspaketen zu erstellen, was Interoperabilität, Rückverfolgbarkeit, Reproduzierbarkeit und die Kombination von Informationen, die durch verschiedene Methoden übertragen werden, zu einer genaueren Ausgabe begünstigt. Scipion wächst ständig, einschließlich neuer Methoden und Verpackungen.Darüber hinaus wurde es um Kryo-Elektronentomographie und Atommodellierung erweitert, so dass auch Workflows zur Verarbeitung dieser Daten erstellt werden können. Um ein Projekt in Scipion zu erstellen, klicken Sie auf Projekt erstellen, um das Projekt zu erstellen. Um die Mikroskopfilme zu importieren, wählen Sie Filme importieren aus.Ein neues Fenster wird angezeigt. Geben Sie in diesem Fenster den Pfad zu den Daten ein und stellen Sie die Mikroskopspannung auf 300 Kilovolt, die sphärische Aberration auf zwei Millimeter, den Amplitudenkontrast auf 0,1, die Vergrößerungsrate auf 50.000, den Abtastratenmodus auf Vom Bild und die Pixelgröße auf 1,34 Angström. Wenn alle Parameter festgelegt sind, klicken Sie auf Ausführen.Wenn die Methode abgeschlossen ist, öffnen Sie die Registerkarte Zusammenfassung und klicken Sie auf Ergebnisse analysieren. Es erscheint ein neues Fenster mit einer Liste der von der Methode generierten Ausgaben. Um die optische Flussmethode für die Filmausrichtung auszuführen, öffnen Sie die optische Ausrichtungsmethode xmipp3, wählen Sie die importierten Filme als Eingabefilme aus, und legen Sie den Bereich Frames auf ALIGN von 2 bis 13 fest.Legen Sie unter Zusätzliche Parameter die Option Vorherige Filmausrichtung auf SUM-Frames verwenden auf Nein fest.Lassen Sie alle anderen Optionen auf ihre Standardwerte festgelegt, und führen Sie das Programm aus. Klicken Sie auf Ergebnisse analysieren, um die erhaltenen Mikroaufnahmen und die Trajektorie der geschätzten Verschiebungen zu überprüfen. Für jede Mikroaufnahme ist es möglich, die spektrale Leistungsdichte, die erhaltenen Trajektorien, um den Film sowohl in der kartesischen als auch in der Polarkoordinate auszurichten, und den Dateinamen der erhaltenen Mikroaufnahme zu überprüfen.Beachten Sie, dass die Partikel der Probe in der Mikroaufnahme im Vergleich zu einem einzelnen Bild des Films viel besser sichtbar sind. Öffnen Sie für die Partikelkommissionierung die manuelle Kommissioniermethode xmipp3 und wählen Sie die zuvor erhaltenen Mikroaufnahmen als Eingangsmikrogramme aus. Klicken Sie auf Ausführen.Ein neues interaktives Fenster wird angezeigt. Ändern Sie in diesem Fenster die Pixelgröße auf 150. Die ausgewählte Mikroaufnahme wird in einem größeren Fenster angezeigt.Wählen Sie alle sichtbaren Partikel in einem Bereich aus. Wenn alle Partikel manuell ausgewählt wurden, klicken Sie auf Training aktivieren, um das Lernen zu starten. Die verbleibenden Bereiche der Mikroaufnahme werden automatisch ausgewählt.Überprüfen Sie die ausgewählten Partikel. Um ein zusätzliches Partikel einzuschließen, klicken Sie auf ein Partikel von Interesse. Um falsche Partikel zu entfernen, halten Sie die Umschalttaste gedrückt, und klicken Sie bei Bedarf auf die Partikel.Wenn alle Partikel automatisch ausgewählt wurden, wählen Sie die nächsten vier Mikroaufnahmen nacheinander aus, um ein repräsentatives Trainingsset zu erstellen. Die Partikel in jeder ausgewählten Mikroaufnahme werden automatisch ausgewählt, wobei jede Mikroaufnahme überprüft wird, um Partikel nach Bedarf einzuschließen oder zu entfernen. Wenn ein Trainingssatz erfasst wurde, klicken Sie auf Koordinaten, um die Koordinaten aller ausgewählten Partikel zu speichern.Öffnen Sie nach dem Erwerb des Trainingssatzes die automatische xmipp3-Kommissionierung, um die vorherige manuelle Kommissionierung im Xmipp-Partikelkommissionierlauf anzuzeigen, und stellen Sie die Mikrographen auf "Wie überwacht" ein. Klicken Sie auf Ausführen, um einen Satz von etwa 100.000 Koordinaten zu generieren. Um den Konsensansatz anzuwenden, öffnen Sie das Sphire-Kryolo-Picking und legen Sie die vorverarbeiteten Mikrographen als Eingabemikrographen im Kommissioniermodell auf den Standardwert fest.Legen Sie den Konfidenzwert auf 0,3 und die Feldgröße auf 150 fest, und klicken Sie dann auf Ausführen. Die Methode sollte auch etwa 100.000 Koordinaten generieren. Öffnen Sie als Nächstes das xmipp3 Deep Consensus Picking und legen Sie die Eingabekoordinaten so fest, dass sie die Ausgabe der automatischen Sphire-Kryolo- und xmipp3-Kommissionierung, den vortrainierten Modelltyp auswählen und die Option Training überspringen und direkt mit vortrainiertem Modell überspringen auf Ja einschließen, und klicken Sie dann auf Ausführen.Klicken Sie am Ende der Ausführung auf Ergebnisse analysieren. Klicken Sie im neuen Fenster auf das Augensymbol. Es öffnet sich ein zweites neues Fenster mit einer Liste aller Partikel.Die Z-Score-Werte in der Spalte geben Einblick in die Qualität jedes Partikels, da ein niedriger Wert auf eine schlechte Qualität hinweist. Um die Partikel vom höchsten zum niedrigsten Z-Score zu ordnen, klicken Sie auf Xmipp Z-score deep learning und wählen Sie die Partikel mit einem Z-Score höher als 0,75 aus. Klicken Sie dann auf Koordinaten, um eine neue Teilmenge mit ca. 50.000 Koordinaten zu erstellen.Um die Auflösung lokal zu berechnen, öffnen Sie xmipp3 local MonoRes und stellen Sie die Eingangslautstärke auf den Ausgang des letzten Verfeinerungsschritts, der Halblautstärke auf Ja und den Auflösungsbereich von 1 bis 10 Angström. Wenn die Parameter festgelegt wurden, klicken Sie auf Ausführen. Wenn die Auflösung berechnet wurde, klicken Sie auf Ergebnisse analysieren und wählen Sie Auflösungshistogramm anzeigen und Farbige Segmente anzeigen aus.Die Auflösung in den verschiedenen Teilen des Volumens wird angezeigt. Die meisten Voxelle der zentralen Teile der Strukturen sollten Auflösungen um drei Angström darstellen, während die schlechtesten Auflösungen in den äußeren Regionen der Strukturen beobachtet werden. Ein Histogramm der Auflösungen pro Voxel mit einem Peak um oder unter drei Angström wird ebenfalls gezeigt.Um eine Schärfung anzuwenden, öffnen Sie die xmipp3 localdeblur-Schärfung, wählen Sie die Ausgabe des letzten Verfeinerungsschritts als Eingabezuordnung aus, und legen Sie die Auflösungszuordnung auf die erhaltene MonoRes-Zuordnung fest. Nachdem der Befehl ausgeführt wurde, doppelklicken Sie auf der Registerkarte Zusammenfassung auf den Satz von Volumes, die als Ausgabe generiert wurden. Die in jeder Iteration generierten Volumes können überprüft werden.Es wird auch empfohlen, das Volume mit anderen Tools wie UCSF Chimera zu öffnen, um die Eigenschaften des Volumes in 3D besser beobachten zu können. In dieser Abbildung kann eine Fourier-Schalenkorrelation von drei Angströmen beobachtet werden, die sehr nahe an der Nyquist-Grenze liegt. Wie abgebildet, weisen die rekonstruierten 3D-Volumenscheiben einen hohen Detaillierungsgrad und klar definierte Strukturen auf.Nach lokaler Analyse erreichen die meisten Zentralvoxel eine Auflösung unter drei Angströmen. Die äußeren Bereiche der lokalen Auflösungsscheiben weisen jedoch eine niedrigere Auflösung auf, die mit der in diesen Bereichen beobachteten Unschärfe übereinstimmt. Nach der Nachbearbeitung können die höheren Frequenzen des 3D-Kartenvolumens beobachtet werden, wodurch mehr Details aufgedeckt und die Darstellung verbessert werden.Wenn die erreichte Auflösung hoch genug ist, können sogar einige der biochemischen Teile der Struktur beobachtet werden. Wenn die erhaltene Struktur eine niedrige Auflösung hat und nicht in der Lage ist, sich zu einer besseren zu entwickeln, kann ein verschwommenes Volumen mit einer niedrigen Fourier-Schalenkorrelation, Einer Auflösungskurve und einem Histogramm der lokalen Schätzung beobachtet werden. Nach der Kommissionierung kann die 2D-Klassifizierung überprüft werden, um die Partikelqualität zu bewerten.In dieser Klassifizierung sind die Partikel beispielsweise verrauscht, unzentriert oder gekoppelt, was darauf hinweist, dass die Kommissionierung falsch war. Ein weiterer Checkpoint kann während der anfänglichen Volumenschätzung durchgeführt werden. In diesem Beispiel wurde eine fehlerhafte Schätzung mit einer falschen Einstellung für die Methode erstellt.Sobald eine 3D-Karte mit einer ausreichenden Auflösung erstellt wurde, besteht der nächste Schritt darin, ein atomares Modell für die Karte vorzuschlagen. Dies kann innerhalb von Scipion mit den Modellierungs-Plugins erfolgen. Diese Technik kann verwendet werden, um biologische Makromoleküle zur Bewertung ihrer molekularen Wechselwirkungen und biologischen Ensemblefunktion als Grundlage für das Wirkstoffdesign erfolgreich zu rekonstruieren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Forschung

Biochemie

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuelles Blot-and-Plunge-Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Vorbereitung von Hochtemperatur-Probengittern für Kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Routinemäßige Sammlung von hochauflösenden Kryo-EM-Datensätzen mit einem 200-KV-Transmissionselektronenmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Die Peel-Blot-Technik: Eine Kryo-EM-Probenvorbereitungsmethode zur Trennung einzelner Schichten von mehrschichtigen oder konzentrierten biologischen Proben

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...