Name: cryo-em and single-particle analysis with scipion
Uploaded: 2021-05-29T13:00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

המחברים מבקשים להכיר בתמיכה כלכלית מ: משרד המדע והחדשנות הספרדי באמצעות מענקים: PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033, "Comunidad Autónoma de Madrid" באמצעות גרנט: S2017/BMD-3817, מכון סאלוד קרלוס השלישי, PT17/0009/0010 (ISCIII-SGEFI/ERDF), האיחוד האירופי (האיחוד האירופי) ואופק 2020 באמצעות מענק: INSTRUCT - ULTRA (אינפרא-די.וי-03-2016-2017, הצעה: 731005), EOSC Life (INFRAEOSC-04-2018, הצעה: 824087), iNEXT - דיסקברי (הצעה: 871037) ו HighResCells (ERC - 2018 - SyG, הצעה: 810057). הפרויקט שהוליד תוצאות אלה זכה לתמיכת מלגה מקרן "לה Caixa" (ID 100010434). קוד המלגה הוא LCF / BQ / DI18 / 11660021. פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענקים מארי Skłodowska-Curie מס ' 713673. המחברים מכירים בתמיכה ובשימוש במשאבים של Instruct, פרויקט ESFRI של לנדמרק.

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Resolution+Revolution.">The Resolution Revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>. 1.15 A structure of human apoferritin obtained from Titan Mono- BCOR microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/7A6A">https://www.rcsb.org/structure/7A6A</a> (2021)</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturizing+EM+Sample+Preparation:+Opportunities,+Challenges,+and+"Visual+Proteomics".">Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics".</a> PROTEOMICS. 18 (5-6), 1700176 (2018).</li><li>Faruqi, A. R., McMullan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+detectors+for+electron+microscopy.">Direct imaging detectors for electron microscopy.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 878, 180-190 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+image+processing+for+single-particle+analysis+by+electron+cryomicroscopy+and+challenges+ahead.">Advances in image processing for single-particle analysis by electron cryomicroscopy and challenges ahead.</a> Current Opinion in Structural Biology. 52, 127-145 (2018).</li><li>Martinez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Cryo-EM+Model+Building+Software+in+Scipion.">Integration of Cryo-EM Model Building Software in Scipion.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 60, 2533-2540 (2020).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195, 93-99 (2016).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xmipp+3.0:+an+improved+software+suite+for+image+processing+in+electron+microscopy.">Xmipp 3.0: an improved software suite for image processing in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 184, 321-328 (2013).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. The Resolution Revolution: Recent Advances In cryoEM. , 125-157 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14, 290-296 (2017).</li><li>Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+structures+of+macromolecules+using+single-particle+analysis+in+EMAN.">3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN.</a> Methods in Molecular Biology. 673, 157-173 (2010).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3, 1941-1974 (2008).</li><li>Wagner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPHIRE-crYOLO+is+a+fast+and+accurate+fully+automated+particle+picker+for+cryo-EM.">SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM.</a> Communications Biology. 2, (2019).</li><li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy.">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 142, 334-347 (2003).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 67, 235-242 (2011).</li><li>Liebschner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+structure+determination+using+X-rays,+neutrons+and+electrons:+recent+developments+in+Phenix.">Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix.</a> Acta Crystallographica Section D. 75, 861-887 (2019).</li><li>Wong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+Plasmodium+falciparum+80S+ribosome+bound+to+the+anti-protozoan+drug+emetine.">Cryo-EM structure of the Plasmodium falciparum 80S ribosome bound to the anti-protozoan drug emetine.</a> eLife. 3, 03080 (2014).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+direct+detection+device+micrographs+using+a+robust+Optical+Flow+approach.">Alignment of direct detection device micrographs using a robust Optical Flow approach.</a> Journal of Structural Biology. 189, 163-176 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., Jonic, S., Nunez Ramirez, R., Boisset, N., Carazo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+robust+and+accurate+determination+of+transmission+electron+microscopy+contrast+transfer+function.">Fast, robust and accurate determination of transmission electron microscopy contrast transfer function.</a> Journal of Structural Biology. 160, 249-262 (2007).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pattern+matching+approach+to+the+automatic+selection+of+particles+from+low-contrast+electron+micrographs.">A pattern matching approach to the automatic selection of particles from low-contrast electron micrographs.</a> Bioinformatics. 29, 2460-2468 (2013).</li><li>Sanchez-Garcia, R., Segura, J., Maluenda, D., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Consensus,+a+deep+learning-based+approach+for+particle+pruning+in+cryo-electron+microscopy.">Deep Consensus, a deep learning-based approach for particle pruning in cryo-electron microscopy.</a> IUCrJ. 5, 854-865 (2018).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171, 197-206 (2010).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+approach+to+the+initial+volume+problem+in+Single+Particle+Analysis+by+Electron+Microscopy.">A statistical approach to the initial volume problem in Single Particle Analysis by Electron Microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 189, 213-219 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarm+optimization+as+a+consensus+technique+for+Electron+Microscopy+Initial+Volume.">Swarm optimization as a consensus technique for Electron Microscopy Initial Volume.</a> Applied Analysis and Optimization. 2, 299-313 (2018).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204, 329-337 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+Accurate+Estimation+of+Local+Resolution+for+Electron+Microscopy+Maps.">MonoRes: Automatic and Accurate Estimation of Local Resolution for Electron Microscopy Maps.</a> Structure. 26, 337-344 (2018).</li><li>Ramirez-Aportela, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+local+resolution-based+sharpening+of+cryo-EM+maps.">Automatic local resolution-based sharpening of cryo-EM maps.</a> Bioinformatics. 36, 765-772 (2020).</li><li>Heymann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+3D+EM+Reconstructions:+The+Phantom+in+the+Noise.">Validation of 3D EM Reconstructions: The Phantom in the Noise.</a> AIMS Biophys. 2, 21-35 (2015).</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+An+integrated,+database-drive+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: An integrated, database-drive pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166, 95-102 (2009).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151, 41-60 (2005).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

נכון לעכשיו, cryo-EM הוא כלי מפתח לחשוף את המבנה 3D של דגימות ביולוגיות. כאשר נתונים טובים נאספים עם המיקרוסקופ, כלי העיבוד הזמינים יאפשרו לנו להשיג שחזור תלת-ממדי של המאקרומולקול הנחקר. עיבוד נתונים Cryo-EM הוא מסוגל להשיג רזולוציה כמעט אטומית, שהוא המפתח להבנת ההתנהגות התפקודית של macromolecule והוא גם חיוני בגילוי סמים.
Scipion היא תוכנה המאפשרת ליצור את כל זרימת העבודה המשלבת את חבילות עיבוד התמונה הרלוונטיות ביותר באופן אינטגרטיבי, המסייע למעקב ולשחזור של כל זרימת העבודה של עיבוד תמונה. Scipion מספק קבוצה שלמה מאוד של כלים כדי לבצע את העיבוד; עם זאת, קבלת שחזורים ברזולוציות גבוהות תלויה לחלוטין באיכות הנתונים שנרכשו ובאופן עיבוד הנתונים הללו. 
כדי לקבל שחזור תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה, הדרישה הראשונה היא להשיג סרטים טובים מהמיקרוסקופ, אשר משמרים מידע מבני לרזולוציה גבוהה. אם זה לא המקרה, זרימת העבודה לא תוכל לחלץ מידע בחדות גבוהה מהנתונים. לאחר מכן, זרימת עבודה מוצלחת של עיבוד אמורה להיות מסוגלת לחלץ חלקיקים שבאמת תואמים למבנה ולמצוא את הכיוונים של חלקיקים אלה בחלל 3D. אם אחד מהשלבים בזרימת העבודה נכשל, איכות אמצעי האחסון המשוחזר תיפגע. Scipion מאפשרת להשתמש בחבילות שונות בכל אחד שלבי העיבוד, אשר מסייע למצוא את הגישה המתאימה ביותר לעיבוד הנתונים. יתר על כן, הודות לחבילות רבות זמינות, כלי קונצנזוס, המגבירים את הדיוק על ידי מציאת הסכם בתפוקות המשוערות של שיטות שונות, ניתן להשתמש. כמו כן, הוא נדון בפירוט בסעיף תוצאות מייצגות מספר כלי אימות וכיצד לזהות תוצאות מדויקות ולא מדויקות בכל שלב בזרימת העבודה, כדי לזהות בעיות פוטנציאליות וכיצד לנסות לפתור אותן. ישנם מספר נקודות ביקורת לאורך הפרוטוקול שיכולים לעזור להבין אם הפרוטוקול פועל כראוי או לא. חלק מהרלוונטיים ביותר הם: איסוף, סיווג 2D, הערכת נפח ראשונית ויישור תלת-ממדי. בדיקת הקלט, חזרה על השלב בשיטה אחרת, או באמצעות קונצנזוס, הן אפשרויות זמינות ב- Scipion שהמשתמש יכול להשתמש בהן כדי למצוא פתרונות כאשר מופיעות בעיות. 
לגבי הגישות הקודמות לשילוב חבילות בתחום Cryo-EM, Appion31 הוא היחיד המאפשר שילוב אמיתי של חבילות תוכנה שונות. עם זאת, Appion מחוברת קשר הדוק עם Leginon32, מערכת לאוסף אוטומטי של תמונות ממיקרוסקופים אלקטרונים. ההבדל העיקרי עם Scipion הוא כי מודל נתונים ואחסון הם פחות מצמידים. באופן כזה, כדי ליצור פרוטוקול חדש בסיפיון, רק תסריט פייתון צריך להיות מפותח. עם זאת, ב- Appion, על המפתח לכתוב את קובץ ה- Script ולשנות את מסד הנתונים המשמש כבסיס. לסיכום, Scipion פותחה כדי לפשט את התחזוקה וההרחבה.
הצגנו בכתב יד זה זרימת עבודה מלאה לעיבוד Cryo-EM, תוך שימוש במערך הנתונים האמיתי של פלסמודיום פאלסיפארום 80S ריבוזום (ערך EMPIAR: 10028, ערך EMDB: 2660). ניתן לסכם את השלבים המכוסים ונדונים כאן כיישור סרט, הערכת CTF, קטיף חלקיקים, סיווג דו-ממדי, הערכת מפה ראשונית, סיווג תלת-ממדי, עידון תלת-ממד, הערכה ולאחר עיבוד. נעשה שימוש בחבילות שונות וכלי קונצנזוס הוחלו בכמה שלבים אלה. הנפח המשוחזר בתלת-ממד האחרון השיג רזולוציה של 3 Å, ובנפח שלאחר העיבוד ניתן להבחין בין כמה מבנים משניים, כמו אלפא-הליס, המסייע לתאר כיצד אטומים מסודרים בחלל.
זרימת העבודה המוצגת בכתב יד זה מראה כיצד ניתן להשתמש ב- Scipion כדי לשלב חבילות Cryo-EM שונות בצורה פשוטה ואינטגרטיבית כדי לפשט את העיבוד, ולהשיג תוצאה אמינה יותר בו זמנית.
בעתיד, פיתוח שיטות וחבילות חדשות ימשיך לגדול ותוכנות כמו Scipion כדי לשלב בקלות את כולם יהיה אפילו יותר חשוב עבור החוקרים. גישות קונצנזוס יהיו רלוונטיות יותר גם אז, כאשר שפע של שיטות עם בסיס שונה יהיה זמין, עוזר להשיג הערכות מדויקות יותר של כל הפרמטרים הכרוכים בתהליך השיקום Cryo-EM. מעקב ושחזור הם המפתח בתהליך המחקר וקל יותר להשיג עם Scipion הודות למסגרת משותפת לביצוע זרימות עבודה שלמות.

במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM), ניתוח חלקיקים יחיד (SPA) של דגימות מיובשות קפואות הוא אחד הווריאנטים הנפוצים והמצליחים ביותר של הדמיה עבור מקרומולקולות ביולוגיות, שכן הוא מאפשר להבין אינטראקציות מולקולריות ואת הפונקציה של הרכבים ביולוגיים1. זאת הודות להתקדמות האחרונה בטכניקת הדמיה זו שהולידה את "מהפכת הרזולוציה" 2 ואפשרה קביעה מוצלחת של מבנים תלת-ממדיים ביולוגיים ברזולוציה כמעט אטומית. נכון לעכשיו, הרזולוציה הגבוהה ביותר שהושגה בספא cryo-EM היה 1.15 Å עבור apoferritin3 (ערך EMDB: 11668). התפתחויות טכנולוגיות אלה כוללות שיפורים בהכנת המדגם4, ברכישת התמונה5 ובשיטות עיבוד התמונה6. מאמר זה מתמקד בנקודה אחרונה זו.
בקצרה, המטרה של שיטות עיבוד התמונה היא לזהות את כל הפרמטרים הרכישה כדי הפוך את תהליך ההדמיה של המיקרוסקופ ולשחזר את המבנה 3D של הדגימה הביולוגית תחת המחקר. פרמטרים אלה הם הרווח של המצלמה, התנועה הנגרמת על ידי קרן, הסטיות של המיקרוסקופ (בעיקר defocus), הכיוון הזוויתי התלת-ממדי ותרגום של כל חלקיק, ואת המצב הקונפורמציה במקרה של דגימה עם שינויים קונפורמיים. עם זאת, מספר הפרמטרים גבוה מאוד ו- cryo-EM דורש שימוש בתמונות במינון נמוך כדי למנוע נזק לקרינה, מה שמפחית באופן משמעותי את יחס האות לרעש (SNR) של התמונות שנרכשו. לכן, לא ניתן לפתור את הבעיה באופן חד משמעי וכל הפרמטרים שיש לחשב בלבד יכולים להיות הערכות. לאורך זרימת העבודה של עיבוד התמונה, יש לזהות את הפרמטרים הנכונים, תוך מחיקת הפרמטרים הנותרים כדי להשיג סוף סוף שחזור תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה.
הנתונים הנוצרים על ידי המיקרוסקופ נאספים במסגרות. בפישוט, מסגרת מכילה את מספר האלקטרונים שהגיעו למיקום מסוים (פיקסל) בתמונה, בכל פעם שנעשה שימוש בגלאי ספירת אלקטרונים. בשדה ראייה מסוים, נאספים מספר מסגרות וזה נקרא סרט. כמו מינונים אלקטרונים נמוכים משמשים כדי למנוע נזק קרינה שיכול להרוס את המדגם, SNR הוא נמוך מאוד ואת המסגרות המתאימות לאותו סרט צריך להיות ממוצע כדי לקבל תמונה חושפת מידע מבני על המדגם. עם זאת, לא רק ממוצע פשוט מוחל, המדגם יכול לסבול משמרות וסוגים אחרים של תנועות במהלך זמן ההדמיה בשל התנועה המושרה קרן כי צריך לפצות. המסגרות בפיצוי משמרת וממוצע מקורן במיקרוגרף.
לאחר קבלת המיקרוגרפים, עלינו להעריך את הסטיות שהוצגו על ידי המיקרוסקופ עבור כל אחת מהן, הנקראת פונקציית העברת ניגודיות (CTF), המייצגת את השינויים בניגוד למיקרוגרף כפונקציה של תדירות. לאחר מכן, ניתן לבחור ולחלץ את החלקיקים, הנקראים קטיף חלקיקים. כל חלקיק צריך להיות תמונה קטנה המכילה רק עותק אחד של הדגימה הנחקרת. ישנן שלוש משפחות של אלגוריתמים לקטיף חלקיקים: 1) אלה שמשתמשים רק בפרמטריזציה בסיסית כלשהי של מראה החלקיק כדי למצוא אותם בכל קבוצת המיקרוגרפים (למשל, גודל החלקיקים), 2) אלה שלומדים כיצד נראים החלקיקים מהמשתמש או מערכה מאומנת מראש, ו -3) אלה המשתמשים בתבניות תמונה. לכל משפחה יש מאפיינים שונים שיוצגו מאוחר יותר.
קבוצת החלקיקים המופקת שנמצאת במיקרוגרפים תשמש בתהליך סיווג דו-ממדי בעל שתי מטרות: 1) ניקוי קבוצת החלקיקים על ידי השלכת קבוצת המשנה המכילה תמונות רעש טהורות, חלקיקים חופפים או חפצים אחרים, ו-2) החלקיקים הממוצעים המייצגים כל מחלקה יכולים לשמש כמידע ראשוני לחישוב נפח ראשוני תלת-ממדי. 
חישוב אמצעי האחסון ההתחלתי של 3D הוא השלב המכריע הבא. הבעיה של השגת המבנה 3D ניתן לראות כבעיית אופטימיזציה בנוף פתרון רב ממדי, שבו המינימום הגלובלי הוא אמצעי האחסון 3D הטוב ביותר המייצג את המבנה המקורי, אבל כמה minima מקומי המייצג פתרונות תת-אופטימליים ניתן למצוא, ואיפה זה מאוד קל להילכד. אמצעי האחסון ההתחלתי מייצג את נקודת ההתחלה של תהליך החיפוש, כך שהערכה ראשונית שגויה של נפח יכולה למנוע מאיתנו למצוא את המינימום הכללי. מהנפח הראשוני, שלב סיווג תלת-ממדי יעזור לגלות מצבים קונפורמיים שונים ולנקות שוב את מערכת החלקיקים; המטרה היא להשיג אוכלוסייה הומוגנית מבחינה מבנית של חלקיקים. לאחר מכן, שלב עידון תלת-ממדי יהיה אחראי על עידון הפרמטרים הזוויתיים והתרגום עבור כל חלקיק כדי לקבל את נפח 3D הטוב ביותר האפשרי. 
לבסוף, בשלבים האחרונים, ניתן לחדד ולצחצח את שחזור תלת-ממד שהושג. חידוד הוא תהליך של הגברת התדרים הגבוהים של הנפח המשוחזר, והליטוש הוא צעד כדי לחדד עוד יותר כמה פרמטרים, כמו CTF או פיצוי תנועה הנגרמת על ידי קרן, ברמה של חלקיקים. כמו כן, ניתן להשתמש בהליכי אימות מסוימים כדי להבין טוב יותר את הרזולוציה שהושגה בסוף זרימת העבודה. 
לאחר כל השלבים הללו, תהליכי האיתור והעגינה7 יסייעו לתת משמעות ביולוגית לשחזור תלת-ממדי המתקבל, על ידי בניית מודלים אטומיים דה נובו או התאמת מודלים קיימים. אם ברזולוציה גבוהה מושגת, תהליכים אלה יגידו לנו את עמדות המבנים הביולוגיים, אפילו של האטומים השונים, במבנה שלנו.
Scipion8 מאפשר ליצור את כל זרימת העבודה המשלבת את חבילות עיבוד התמונה הרלוונטיות ביותר באופן אינטגרטיבי. Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, Eman12, Spider13, Cryolo14, Ctffind15, CCP416, Phenix17 וחבילות רבות נוספות ניתן לכלול ב- Scipion. כמו כן, הוא משלב את כל הכלים הדרושים לטובת השילוב, יכולת שיתוף, עקיבות ויכולת רבייה כדי לבצע מעקב מלא אחר כל זרימת העבודה של עיבוד התמונה8.
אחד הכלים החזקים ביותר כי Scipion מאפשר לנו להשתמש הוא הקונצנזוס, כלומר להשוות את התוצאות שהושגו עם כמה שיטות בשלב אחד של העיבוד, מה שהופך שילוב של המידע המועבר על ידי שיטות שונות כדי ליצור פלט מדויק יותר. זה יכול לעזור לשפר את הביצועים ולשפר את האיכות שהושגה בפרמטרים המשוערים. שים לב שניתן לבנות זרימת עבודה פשוטה יותר ללא שימוש בשיטות קונצנזוס; עם זאת, ראינו את העוצמה של כלי זה22,25 ואת זרימת העבודה המוצגת בכתב יד זה ישתמש בו במספר שלבים.
כל השלבים שסוכמו בפסקאות הקודמות יותבררו בפירוט בסעיף הבא וישולבו בזרימת עבודה מלאה באמצעות Scipion. כמו כן, יוצגו כיצד להשתמש בכלי הקונצנזוס כדי להשיג הסכם גבוה יותר בתפוקות שנוצרו. לכך נבחרה ערכת הנתונים לדוגמה של פלסמודיום פאלסיפארום 80S ריבוזום (ערך EMPIAR: 10028, ערך EMDB: 2660). ערכת הנתונים נוצרת על ידי 600 סרטים של 16 מסגרות בגודל 4096x4096 פיקסלים בגודל פיקסלים בגודל פיקסלים של 1.34Å שצולם ב- FEI POLARA 300 עם מצלמת FEI FALCON II, עם רזולוציה מדווחת ב- EMDB היא 3.2Å18 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>no material is used in this article</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-em and single-particle analysis with scipion

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית הפכה לאחד הכלים החשובים ביותר במחקר ביולוגי כדי לחשוף את המידע המבני של מקרומולקולים ברזולוציה כמעט אטומית. בניתוח חלקיקים בודדים, המדגם המהולל הוא בתמונה על ידי קרן אלקטרונים ואת הגלאים בסוף עמוד המיקרוסקופ לייצר סרטים של מדגם זה. סרטים אלה מכילים אלפי תמונות של חלקיקים זהים באוריינטציות אקראיות. הנתונים צריכים לעבור דרך זרימת עבודה של עיבוד תמונה עם שלבים מרובים כדי להשיג את אמצעי האחסון המשוחזר של תלת-ממד הסופי. המטרה של זרימת העבודה של עיבוד תמונה היא לזהות את פרמטרי הרכישה כדי להיות מסוגל לשחזר את הדגימה תחת מחקר. Scipion מספקת את כל הכלים ליצירת זרימת עבודה זו באמצעות מספר חבילות עיבוד תמונה במסגרת אינטגרטיבית, המאפשרות גם את המעקב אחר התוצאות. במאמר זה כל זרימת העבודה עיבוד תמונה ב Scipion מוצג ונדון עם נתונים המגיעים ממקרה בדיקה אמיתי, נותן את כל הפרטים הדרושים כדי לעבור מהסרטים המתקבלים על ידי המיקרוסקופ לשחזור תלת-ממדי סופי ברזולוציה גבוהה. כמו כן, העוצמה של שימוש בכלי קונצנזוס המאפשרים שילוב שיטות, ואישור תוצאות לאורך כל שלב של זרימת העבודה, שיפור הדיוק של התוצאות שהושגו, נדון.

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

ניתוח חלקיקים בודדים במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית היא אחת הטכניקות העיקריות המשמשות לקביעת מבנה ההרכבים הביולוגיים ברזולוציה גבוהה. Scipion מספקת את הכלים ליצירת הצינור כולו לעיבוד המידע שנרכש על ידי המיקרוסקופ ולהשיג שחזור תלת מימדי של הדגימה הביולוגית.

ניתוח קריו-EM וחלקיקים בודדים עם Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Scipion מספקת את הכלים ליצירת זרימת העבודה של העיבוד כולו באופן אינטגרטיבי לניתוח חלקיקים יחיד בקריו-EM כדי להשיג שחזור ברזולוציה גבוהה של הדגימה הביולוגית. מסגרת זו מאפשרת ליצור את זרימת העבודה של העיבוד באמצעות מספר חבילות עיבוד תמונה, תוך העדפת יכולת פעולה הדדית, עקיבות, יכולת רבייה ושילוב של מידע המועבר בשיטות שונות ליצירת פלט מדויק יותר. Scipion גדל כל הזמן, כולל שיטות וחבילות חדשות.יתר על כן, הוא הורחב לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית ומידול אטומי, ומאפשר גם ליצור זרימות עבודה לעיבוד נתונים אלה. כדי ליצור פרוייקט ב- Scipion, לחץ על צור פרוייקט כדי ליצור את הפרוייקט. לייבוא סרטי המיקרוסקופ, בחר ייבוא סרטים.יופיע חלון חדש. בחלון זה, הזן את הנתיב לנתונים והגדר את מתח המיקרוסקופ ל- 300 קילו-וולט, את הסטייה הכדורית לשני מילימטרים, את משרעת לעומת 0.1, את קצב ההגדלה ל- 50,000, את מצב קצב הדגימה ל- From תמונה ואת גודל הפיקסל ל- 1.34 אנגסטרום. לאחר שכל הפרמטרים הוגדרו, לחץ על ביצוע.כאשר פעולת השירות מסתיימת, פתח את הכרטיסיה תקציר לחץ על נתח תוצאות. יופיע חלון חדש עם רשימה של הפלטים שנוצרו על-ידי פעולת השירות. כדי להפעיל את שיטת הזרימה האופטית ליישור סרט, פתח את שיטת היישור האופטי xmipp3 ובחר את הסרטים המיובאים כסרטי הקלט והגדר את טווח המסגרות ל- ALIGN מ- 2 ל- 13.תחת פרמטרים נוספים, הגדר את האפשרות השתמש ביישור הסרט הקודם למסגרות SUM ל- No.השאר את כל האפשרויות האחרות מוגדרות לערכי ברירת המחדל שלהן והבצע את התוכנית. לחץ על נתח תוצאות כדי לבדוק את המיקרוגרפים שהושגו ואת המסלול של המשמרות המשוערות. עבור כל מיקרוגרף, ניתן לבדוק את צפיפות הספקטרלי כוח, את המסלולים המתקבלים כדי ליישר את הסרט הן בקואורדינטות הקרטזיות והן בקואורדינטות הקוטביות, ושם הקובץ של המיקרוגרף המתקבל.שים לב כי החלקיקים של הדגימה נראים הרבה יותר במיקרוגרף בהשוואה למסגרת אחת של הסרט. לקטיף חלקיקים, פתח את שיטת הקטיף הידנית xmipp3 ובחר את המיקרוגרפים שהושגו בעבר כמיקרוגרפי הקלט. לחץ על ביצוע.יופיע חלון אינטראקטיבי חדש. בחלון זה, שנה את גודל הפיקסלים ל- 150. המיקרוגרף שנבחר יופיע בחלון גדול יותר.בחר את כל החלקיקים הנראים בתוך אזור אחד. לאחר שכל החלקיקים נבחרו באופן ידני, לחץ על הפעל אימון כדי להתחיל את הלמידה. האזורים הנותרים של המיקרוגרף ייאספו באופן אוטומטי.בדוק את החלקיקים שנקטפו. כדי לכלול חלקיק נוסף, לחץ על חלקיק מעניין. כדי להסיר חלקיקים שגויים, החזק את מקש Shift ולחץ על החלקיקים לפי הצורך.כאשר כל החלקיקים נבחרו באופן אוטומטי, בחר את ארבעת המיקרוגרפים הבאים בזה אחר זה כדי ליצור ערכת הדרכה מייצגת. החלקיקים בכל מיקרוגרף שנבחר ייאספו באופן אוטומטי, ויבדקו כל מיקרוגרף כדי לכלול או להסיר חלקיקים לפי הצורך. כאשר נרכשה ערכת אימונים, לחץ על קואורדינטות כדי לשמור את הקואורדינטות של כל החלקיקים שנבחרו.לאחר רכישת ערכת האימונים, פתח את הבחירה האוטומטית של xmipp3 כדי לציין את האיסוף הידני הקודם בריצה לקטיף חלקיקים Xmipp והגדיר מיקרוגרפים לבחור כמו בפיקוח. לחץ על בצע כדי ליצור ערכה של כ- 100,000 קואורדינטות. כדי ליישם את גישת הקונצנזוס, פתחו את קטיף המיקרוגרפים המעובדים מראש כמיקרוגרפים של הקלט במודל האיסוף לברירת המחדל.הגדר את סף הביטחון ל- 0.3 ואת גודל התיבה ל- 150 ולאחר מכן לחץ על בצע. השיטה צריכה גם ליצור סביב 100, 000 קואורדינטות. לאחר מכן, פתח את קונצנזוס xmipp3 וקבע את קואורדינטות הקלט כך שיכללו את הפלט של הבחירה האוטומטית sphire cryolo ו- xmipp3, את סוג הדגם Select להכשרה מראש ואת האימון והניקוד של Skip ישירות עם דגם מאומן מראש ל-Yes ולאחר מכן לחץ על ביצוע.בסוף הביצוע, לחץ על נתח תוצאות. בחלון החדש, לחץ על סמל העין. חלון חדש שני ייפתח עם רשימה של כל החלקיקים.ערכי ציון Z בעמודה יתנו תובנה לגבי האיכות של כל חלקיק, שכן ערך נמוך מעיד על איכות ירודה. כדי להזמין את החלקיקים מהציון הגבוה ביותר לנמוך ביותר של Z, לחץ על למידה עמוקה של ציון Xmipp Z ובחר את החלקיקים עם ציון Z גבוה מ- 0.75. לאחר מכן לחץ על קואורדינטות כדי ליצור קבוצת משנה חדשה עם כ- 50,000 קואורדינטות.כדי לחשב את הרזולוציה באופן מקומי, פתח את xmipp3 Local MonoRes והגדר את עוצמת הקלט לפלט של שלב השיפור האחרון, את האם ברצונך להשתמש בחצי אמצעי אחסון ל-כן ואת טווח הרזולוציה מ- 1 עד 10 אנגסטרום. לאחר הגדרת הפרמטרים, לחץ על ביצוע. לאחר חישוב הרזולוציה, לחצו על 'נתח תוצאות' ובחרו 'הצג היסטוגרמה של רזולוציה' ו'הצג פרוסות צבעוניות'.הרזולוציה בחלקים השונים של אמצעי האחסון תוצג. רוב voxels של החלקים המרכזיים של המבנים צריך לייצג החלטות סביב שלושה אנגסטרום, בעוד ההחלטות הגרועות ביותר יצפו באזורים החיצוניים של המבנים. היסטוגרמה של ההחלטות לכל ווקסל עם שיא סביב או מתחת לשלוש אנגסטרומים תוצג גם היא.להחלת חידוד, פתחו את חידוד ה-xmipp3 localdeblur ובחרו את הפלט של שלב השיפור האחרון כמפת קלט, והגדירו את מפת הרזולוציה למפת MonoRes השגה. לאחר ביצוע הפקודה, לחץ פעמיים על ערכת אמצעי האחסון שנוצרו כפלט בכרטיסיה סיכום. ניתן לבדוק את אמצעי האחסון שנוצרו בכל איטרציה.מומלץ גם לפתוח את עוצמת הקול עם כלים אחרים, כגון כימרה UCSF, כדי לצפות טוב יותר את התכונות של עוצמת הקול בתלת-ממד. באיור זה, ניתן להבחין בקורלציה של מעטפת פורייה של שלושה אנגסטרומים, הקרובה מאוד לגבול הנייקוויסט. כפי שניתן להמחיש, פרוסות הנפח 3D המשוחזרות מציגות רמה גבוהה של פרטים ומבנים מוגדרים היטב.לאחר ניתוח מקומי, רוב voxels המרכזי להשיג רזולוציה מתחת לשלוש אנגסטרום. האזורים החיצוניים של פרוסות הרזולוציה המקומית מדגימים רזולוציה נמוכה יותר, עם זאת, אשר עולה בקנה אחד עם הטשטוש שנצפו באזורים אלה. לאחר העיבוד, ניתן לראות את התדרים הגבוהים יותר של עוצמת המפה 3D, לחשוף פרטים נוספים ולשפר את הייצוג.כאשר הרזולוציה שהושגה גבוהה מספיק, אפילו חלק מהחלקים הביוכימיים של המבנה ניתן לראות. אם למבנה המתקבל יש רזולוציה נמוכה, והוא אינו מסוגל להתפתח ליותר, ניתן להבחין בנפח מטושטש עם מתאם מעטפת פורייה נמוך, עקומת רזולוציה והיסטוגרמה של ההערכה המקומית. לאחר הקטיף, ניתן לבדוק את הסיווג הדו-חמצני כדי להעריך את איכות החלקיקים.לדוגמה, בסיווג זה, החלקיקים רועשים, לא מרכזיים או מצמידים, מה שמצביע על כך שהקטיף היה שגוי. נקודת ביקורת נוספת יכולה להתבצע במהלך הערכת עוצמת הקול הראשונית. בדוגמה זו, נוצרה הערכה שגויה באמצעות התקנה שגויה עבור פעולת השירות.לאחר הפקת מפה תלת-ממדית ברזולוציה מספקת, השלב הבא הוא להציע מודל אטומי למפה. זה יכול להיעשות בתוך Scipion באמצעות תוספים דוגמנות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לשחזר בהצלחה מקרומולקולות ביולוגיות להערכת האינטראקציות המולקולריות שלהם ותפקוד ההרכב הביולוגי כבסיס לעיצוב תרופות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

הכנת רשתות דגימה בטמפרטורה גבוהה עבור Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

איסוף שגרתי של מערכי נתונים cryo-EM ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים של 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

טכניקת ה-peel-blot: שיטת הכנת דגימות Cryo-EM להפרדת שכבות בודדות מדגימות ביולוגיות רב-שכבתיות או מרוכזות

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...