Name: cryo-em and single-particle analysis with scipion
Uploaded: 2021-05-29T13:00:00
Duration: 9 min 6 s
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लेखकों से आर्थिक समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं: अनुदान के माध्यम से विज्ञान और नवाचार के स्पेनिश मंत्रालय: PID2019-104757RB-I00/ AEI / 10.13039 / 501100011033, अनुदान के माध्यम से "Comunidad Autónoma de Madrid", S 731005 2017/ 824087), iNEXT - डिस्कवरी (प्रस्ताव: 871037), और HighResCells (ERC - 2018 - SyG, प्रस्ताव: 810057)। इन परिणामों को जन्म देने वाली परियोजना को "ला कैक्सा" फाउंडेशन (आईडी 100010434) से फैलोशिप का समर्थन मिला। फेलोशिप कोड LCF/BQ/DI18/11660021 है। इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से मैरी स्कोलोवस्का-क्यूरी अनुदान समझौते नंबर 713673 के तहत धन प्राप्त हुआ है। लेखकों का समर्थन और निर्देश, एक मील का पत्थर ESFRI परियोजना के संसाधनों के उपयोग को स्वीकार करते हैं.

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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

वर्तमान में, क्रायो-ईएम जैविक नमूनों की 3 डी संरचना को प्रकट करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। जब माइक्रोस्कोप के साथ अच्छा डेटा एकत्र किया जाता है, तो उपलब्ध प्रसंस्करण उपकरण हमें अध्ययन के तहत मैक्रोमोलेक्यूल का 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करने की अनुमति देगा। क्रायो-ईएम डेटा प्रोसेसिंग निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने में सक्षम है, जो एक मैक्रोमोलेक्यूल के कार्यात्मक व्यवहार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है और दवा की खोज में भी महत्वपूर्ण है।
Scipion एक सॉफ्टवेयर है जो एक एकीकृत तरीके से सबसे प्रासंगिक छवि प्रसंस्करण पैकेजों के संयोजन के पूरे वर्कफ़्लो को बनाने की अनुमति देता है, जो पूरे छवि-प्रसंस्करण वर्कफ़्लो की ट्रेसेबिलिटी और पुनरुत्पादन में मदद करता है। Scipion प्रसंस्करण को पूरा करने के लिए उपकरणों का एक बहुत ही पूरा सेट प्रदान करता है; हालांकि, उच्च संकल्प पुनर्निर्माण प्राप्त करना पूरी तरह से अधिग्रहित डेटा की गुणवत्ता पर निर्भर करता है और इन डेटा को कैसे संसाधित किया जाता है। 
एक उच्च रिज़ॉल्यूशन 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए, पहली आवश्यकता माइक्रोस्कोप से अच्छी फिल्में प्राप्त करना है, जो संरचनात्मक जानकारी को उच्च रिज़ॉल्यूशन तक संरक्षित करती है। यदि यह मामला नहीं है, तो वर्कफ़्लो डेटा से उच्च परिभाषा जानकारी निकालने में सक्षम नहीं होगा. फिर, एक सफल प्रसंस्करण वर्कफ़्लो को उन कणों को निकालने में सक्षम होना चाहिए जो वास्तव में संरचना के अनुरूप हैं और 3 डी स्पेस में इन कणों के झुकाव को खोजने के लिए। यदि वर्कफ़्लो में कोई भी चरण विफल रहता है, तो पुनर्निर्मित वॉल्यूम की गुणवत्ता अवक्रमित हो जाएगी. Scipion प्रसंस्करण चरणों में से किसी में विभिन्न पैकेजों का उपयोग करने की अनुमति देता है, जो डेटा को संसाधित करने के लिए सबसे पर्याप्त दृष्टिकोण खोजने में मदद करता है। इसके अलावा, कई पैकेज उपलब्ध होने के लिए धन्यवाद, आम सहमति उपकरण, जो विभिन्न तरीकों के अनुमानित आउटपुट में एक समझौते को खोजने से सटीकता को बढ़ावा देते हैं, का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में कई सत्यापन उपकरण ों पर विस्तार से चर्चा की गई है और वर्कफ़्लो के हर चरण में सटीक और गलत परिणामों की पहचान कैसे करें, संभावित समस्याओं का पता लगाने के लिए, और उन्हें हल करने का प्रयास कैसे करें। प्रोटोकॉल के साथ कई चौकियां हैं जो यह महसूस करने में मदद कर सकती हैं कि प्रोटोकॉल ठीक से चल रहा है या नहीं। सबसे प्रासंगिक में से कुछ हैं: उठाना, 2 डी वर्गीकरण, प्रारंभिक मात्रा अनुमान, और 3 डी संरेखण। इनपुट की जाँच करना, किसी भिन्न विधि के साथ चरण को दोहराना, या आम सहमति का उपयोग करना, Scipion में उपलब्ध विकल्प हैं जिनका उपयोग उपयोगकर्ता समस्याओं के प्रकट होने पर समाधान खोजने के लिए कर सकता है। 
क्रायो-ईएम क्षेत्र में पैकेज एकीकरण के लिए पिछले दृष्टिकोणों के बारे में, Appion31 केवल एक ही है जो विभिन्न सॉफ़्टवेयर पैकेजों के वास्तविक एकीकरण की अनुमति देता है। हालांकि, Appion कसकर Leginon32, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप से छवियों के स्वचालित संग्रह के लिए एक प्रणाली के साथ जुड़ा हुआ है। Scipion के साथ मुख्य अंतर यह है कि डेटा मॉडल और भंडारण कम युग्मित हैं। इस तरह, स्किपियन में एक नया प्रोटोकॉल बनाने के लिए, केवल एक पायथन स्क्रिप्ट विकसित करने की आवश्यकता है। हालाँकि, Appion में, डेवलपर स्क्रिप्ट लिखना चाहिए और अंतर्निहित डेटाबेस परिवर्तित करें। संक्षेप में, Scipion रखरखाव और extensibility को सरल बनाने के लिए विकसित किया गया था।
हमने इस पांडुलिपि में क्रायो-ईएम प्रसंस्करण के लिए एक पूर्ण वर्कफ़्लो प्रस्तुत किया है, जिसमें प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम 80एस राइबोसोम (EMPIAR प्रविष्टि: 10028, EMDB प्रविष्टि: 2660) के वास्तविक मामले डेटासेट का उपयोग किया गया है। यहां कवर किए गए और चर्चा किए गए चरणों को फिल्म संरेखण, सीटीएफ अनुमान, कण चयन, 2 डी वर्गीकरण, प्रारंभिक मानचित्र अनुमान, 3 डी वर्गीकरण, 3 डी शोधन, मूल्यांकन और पोस्ट-प्रोसेसिंग के रूप में संक्षेप में प्रस्तुत किया जा सकता है। विभिन्न पैकेजों का उपयोग किया गया है और इनमें से कई चरणों में आम सहमति उपकरण लागू किए गए थे। अंतिम 3 डी पुनर्निर्मित मात्रा ने 3 Å का एक संकल्प प्राप्त किया और, पोस्ट-प्रोसेस्ड वॉल्यूम में, कुछ माध्यमिक संरचनाओं को अलग किया जा सकता है, जैसे अल्फा-हेलिसेस, जो यह वर्णन करने में मदद करता है कि परमाणुओं को अंतरिक्ष में कैसे व्यवस्थित किया जाता है।
इस पांडुलिपि में प्रस्तुत वर्कफ़्लो से पता चलता है कि कैसे Scipion का उपयोग प्रसंस्करण को सरल बनाने के लिए एक सरल और एकीकृत तरीके से विभिन्न क्रायो-ईएम पैकेजों को संयोजित करने के लिए किया जा सकता है, और एक ही समय में अधिक विश्वसनीय परिणाम प्राप्त किया जा सकता है।
भविष्य में, नए तरीकों और पैकेजों का विकास बढ़ता रहेगा और उन सभी को आसानी से एकीकृत करने के लिए स्किपियन जैसे सॉफ़्टवेयर शोधकर्ताओं के लिए और भी महत्वपूर्ण होंगे। आम सहमति के दृष्टिकोण तब भी अधिक प्रासंगिक होंगे, जब विभिन्न आधारों के साथ बहुत सारे तरीके उपलब्ध होंगे, जिससे क्रायो-ईएम में पुनर्निर्माण प्रक्रिया में शामिल सभी मापदंडों के अधिक सटीक अनुमान प्राप्त करने में मदद मिलेगी। ट्रैकिंग और पुनरुत्पादन अनुसंधान प्रक्रिया में महत्वपूर्ण हैं और पूर्ण वर्कफ़्लो के निष्पादन के लिए एक सामान्य रूपरेखा रखने के लिए स्किपियन धन्यवाद के साथ प्राप्त करना आसान है।

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) में, विट्रीफाइड जमे हुए-हाइड्रेटेड नमूनों का एकल कण विश्लेषण (एसपीए) जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स के लिए इमेजिंग के सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले और सफल रूपों में से एक है, क्योंकि यह आणविक इंटरैक्शन और जैविक ensembles1 के कार्य को समझने की अनुमति देता है। यह इस इमेजिंग तकनीक में हाल की प्रगति के लिए धन्यवाद है जिसने "संकल्प क्रांति" 2 को जन्म दिया और निकट-परमाणु संकल्प के साथ जैविक 3 डी संरचनाओं के सफल निर्धारण की अनुमति दी है। वर्तमान में, एसपीए क्रायो-ईएम में प्राप्त उच्चतम रिज़ॉल्यूशन एपोफेरिटिन 3 (EMDB प्रविष्टि: 11668) के लिए 1.15 Å था। इन तकनीकी प्रगति में नमूना तैयारी 4, छवि अधिग्रहण 5, और छवि प्रसंस्करण विधियों में सुधार शामिल हैं6। यह लेख इस अंतिम बिंदु पर केंद्रित है। 
संक्षेप में, छवि प्रसंस्करण विधियों का लक्ष्य माइक्रोस्कोप की इमेजिंग प्रक्रिया को उलटने और अध्ययन के तहत जैविक नमूने की 3 डी संरचना को पुनर्प्राप्त करने के लिए सभी अधिग्रहण मापदंडों की पहचान करना है। ये पैरामीटर कैमरे का लाभ, बीम-प्रेरित आंदोलन, माइक्रोस्कोप (मुख्य रूप से डिफोकस) के विपथन, प्रत्येक कण के 3 डी कोणीय अभिविन्यास और अनुवाद, और संरचनात्मक परिवर्तनों के साथ एक नमूना होने के मामले में संरचनात्मक स्थिति हैं। हालांकि, मापदंडों की संख्या बहुत अधिक है और क्रायो-ईएम को विकिरण क्षति से बचने के लिए कम खुराक वाली छवियों का उपयोग करने की आवश्यकता होती है, जो अधिग्रहित छवियों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) को काफी कम कर देता है। इस प्रकार, समस्या को स्पष्ट रूप से हल नहीं किया जा सकता है और केवल गणना किए जाने वाले सभी पैरामीटर अनुमान हो सकते हैं। छवि प्रसंस्करण वर्कफ़्लो के साथ, सही पैरामीटर की पहचान की जानी चाहिए, अंतमें एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए शेष लोगों को छोड़ दिया जाना चाहिए।
माइक्रोस्कोप द्वारा उत्पन्न डेटा को फ्रेम में इकट्ठा किया जाता है। सरलीकरण करते हुए, एक फ्रेम में इलेक्ट्रॉनों की संख्या होती है जो छवि में एक विशेष स्थिति (पिक्सेल) पर पहुंचे हैं, जब भी इलेक्ट्रॉन-गिनती डिटेक्टरों का उपयोग किया जाता है। देखने के एक विशेष क्षेत्र में, कई फ्रेम एकत्र किए जाते हैं और इसे एक फिल्म कहा जाता है। चूंकि कम इलेक्ट्रॉन खुराक का उपयोग विकिरण क्षति से बचने के लिए किया जाता है जो नमूने को नष्ट कर सकता है, एसएनआर बहुत कम है और उसी फिल्म के अनुरूप फ्रेम को नमूने के बारे में संरचनात्मक जानकारी का खुलासा करने वाली छवि प्राप्त करने के लिए औसत करने की आवश्यकता होती है। हालांकि, न केवल एक साधारण औसत लागू किया जाता है, नमूना बीम-प्रेरित आंदोलन के कारण इमेजिंग समय के दौरान बदलाव और अन्य प्रकार के आंदोलनों का सामना कर सकता है, जिसे मुआवजा देने की आवश्यकता होती है। शिफ्ट-क्षतिपूर्ति और औसत फ्रेम एक माइक्रोग्राफ की उत्पत्ति करते हैं।
एक बार माइक्रोग्राफ प्राप्त होने के बाद, हमें उनमें से प्रत्येक के लिए माइक्रोस्कोप द्वारा पेश किए गए विपथन का अनुमान लगाने की आवश्यकता होती है, जिसे कंट्रास्ट ट्रांसफर फंक्शन (सीटीएफ) कहा जाता है, जो आवृत्ति के एक कार्य के रूप में माइक्रोग्राफ के विपरीत परिवर्तनों का प्रतिनिधित्व करता है। फिर, कणों का चयन किया जा सकता है और निकाला जा सकता है, जिसे कण पिकिंग कहा जाता है। प्रत्येक कण एक छोटी सी छवि होनी चाहिए जिसमें अध्ययन के तहत नमूने की केवल एक प्रतिहो। कण चुनने के लिए एल्गोरिदम के तीन परिवार हैं: 1) वे लोग जो केवल माइक्रोग्राफ (जैसे, कण आकार) के पूरे सेट में उन्हें खोजने के लिए कण की उपस्थिति के कुछ बुनियादी पैरामीटराइजेशन का उपयोग करते हैं, 2) वे लोग जो सीखते हैं कि कण उपयोगकर्ता या पूर्वप्रशिक्षित सेट से कैसे दिखते हैं, और 3) जो छवि टेम्पलेट्स का उपयोग करते हैं। प्रत्येक परिवार के अलग-अलग गुण होते हैं जिन्हें बाद में दिखाया जाएगा।
माइक्रोग्राफ में पाए जाने वाले कणों के निकाले गए सेट का उपयोग 2 डी वर्गीकरण प्रक्रिया में किया जाएगा जिसमें दो लक्ष्य हैं: 1) शुद्ध शोर छवियों, अतिव्यापी कणों, या अन्य कलाकृतियों वाले सबसेट को त्यागकर कणों के सेट की सफाई, और 2) प्रत्येक वर्ग का प्रतिनिधित्व करने वाले औसत कणों का उपयोग 3 डी प्रारंभिक मात्रा की गणना करने के लिए प्रारंभिक जानकारी के रूप में किया जा सकता है। 
3D प्रारंभिक वॉल्यूम गणना अगला महत्वपूर्ण कदम है। 3 डी संरचना प्राप्त करने की समस्या को एक बहुआयामी समाधान परिदृश्य में एक अनुकूलन समस्या के रूप में देखा जा सकता है, जहां वैश्विक न्यूनतम सबसे अच्छा 3 डी वॉल्यूम है जो मूल संरचना का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन उप-समाधानों का प्रतिनिधित्व करने वाले कई स्थानीय मिनीमा पाया जा सकता है, और जहां फंसना बहुत आसान है। प्रारंभिक वॉल्यूम खोज प्रक्रिया के लिए प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है, इसलिए खराब प्रारंभिक मात्रा अनुमान हमें वैश्विक न्यूनतम खोजने से रोक सकता है। प्रारंभिक मात्रा से, एक 3 डी वर्गीकरण चरण विभिन्न संरचनात्मक राज्यों की खोज करने और कणों के सेट को फिर से साफ करने में मदद करेगा; लक्ष्य कणों की संरचनात्मक रूप से सजातीय आबादी प्राप्त करना है। उसके बाद, एक 3 डी शोधन चरण प्रत्येक कण के लिए कोणीय और अनुवाद मापदंडों को परिष्कृत करने के लिए सबसे अच्छा 3 डी वॉल्यूम संभव प्राप्त करने के लिए प्रभारी होगा। 
अंत में, अंतिम चरणों में, प्राप्त 3 डी पुनर्निर्माण को तेज और पॉलिश किया जा सकता है। Sharpening पुनर्निर्मित मात्रा की उच्च आवृत्तियों को बढ़ावा देने की एक प्रक्रिया है, और चमकाने कुछ मापदंडों को और अधिक परिष्कृत करने के लिए एक कदम है, जैसा कि CTF या बीम-प्रेरित आंदोलन मुआवजे के रूप में, कणों के स्तर पर। इसके अलावा, कुछ मान्यता प्रक्रियाओं का उपयोग वर्कफ़्लो के अंत में प्राप्त रिज़ॉल्यूशन को बेहतर ढंग से समझने के लिए किया जा सकता है। 
इन सभी चरणों के बाद, ट्रेसिंग और डॉकिंग प्रक्रियाएं 7 प्राप्त 3 डी पुनर्निर्माण को जैविक अर्थ देने में मदद करेंगी, परमाणु मॉडल डे नोवो का निर्माण करके या मौजूदा मॉडलों को फिट करके। यदि उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया जाता है, तो ये प्रक्रियाएं हमें जैविक संरचनाओं की स्थिति, यहां तक कि विभिन्न परमाणुओं की स्थिति को हमारी संरचना में भी बताएगी।
Scipion8 एक एकीकृत तरीके से सबसे प्रासंगिक छवि प्रसंस्करण पैकेज के संयोजन पूरे वर्कफ़्लो बनाने की अनुमति देता है। Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, Eman12, Spider13, Cryolo14, Ctffind15, CCP416, Phenix17, और कई और पैकेज ों को Scipion में शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा, यह एकीकरण, इंटरऑपरेबिलिटी, ट्रेसेबिलिटी और पुनरुत्पादन को लाभ पहुंचाने के लिए सभी आवश्यक उपकरणों को शामिल करता है ताकि पूरे छवि-प्रसंस्करण वर्कफ़्लो 8 की पूर्ण ट्रैकिंग की जा सके।
सबसे शक्तिशाली उपकरणों में से एक जो स्किपियन हमें उपयोग करने की अनुमति देता है, वह आम सहमति है, जिसका अर्थ है कि प्रसंस्करण के एक चरण में कई तरीकों से प्राप्त परिणामों की तुलना करना, अधिक सटीक आउटपुट उत्पन्न करने के लिए विभिन्न तरीकों से व्यक्त की गई जानकारी का संयोजन बनाना। यह प्रदर्शन को बढ़ावा देने और अनुमानित मापदंडों में प्राप्त गुणवत्ता में सुधार करने में मदद कर सकता है। ध्यान दें कि एक सरल वर्कफ़्लो आम सहमति विधियों के उपयोग के बिना बनाया जा सकता है; हालांकि, हमने इस टूल 22,25 की शक्ति देखी है और इस पांडुलिपि में प्रस्तुत वर्कफ़्लो इसे कई चरणों में उपयोग करेगा।
पिछले पैराग्राफ में संक्षेप ति किए गए सभी चरणों को निम्न अनुभाग में विस्तार से समझाया जाएगा और Scipion का उपयोग करके एक पूर्ण वर्कफ़्लो में संयोजित किया जाएगा। इसके अलावा, उत्पन्न आउटपुट में एक उच्च समझौते को प्राप्त करने के लिए आम सहमति उपकरणका उपयोग कैसे करें, यह दिखाया जाएगा। उस अंत तक, प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम 80एस राइबोसोम के उदाहरण डेटासेट को चुना गया है (EMPIAR प्रविष्टि: 10028, EMDB प्रविष्टि: 2660)। डेटासेट 1.34Å के पिक्सेल आकार पर 4096x4096 पिक्सेल के 16 फ्रेम की 600 फिल्मों द्वारा गठित किया गया है, जो एक FEI FALCON II कैमरे के साथ एक FEI POLARA 300 पर लिया गया है, EMDB में रिपोर्ट किए गए रिज़ॉल्यूशन के साथ 3.2Å18 है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>no material is used in this article</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
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cryo-em and single-particle analysis with scipion

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जैविक अनुसंधान में सबसे महत्वपूर्ण उपकरणों में से एक बन गया है ताकि निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन पर मैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचनात्मक जानकारी को प्रकट किया जा सके। एकल-कण विश्लेषण में, विट्रीफाइड नमूने को एक इलेक्ट्रॉन बीम द्वारा चित्रित किया जाता है और माइक्रोस्कोप कॉलम के अंत में डिटेक्टर उस नमूने की फिल्मों का उत्पादन करते हैं। इन फिल्मों में यादृच्छिक अभिविन्यास में समान कणों की हजारों छवियां होती हैं। डेटा को अंतिम 3 डी पुनर्निर्मित वॉल्यूम प्राप्त करने के लिए एकाधिक चरणों के साथ एक छवि प्रसंस्करण वर्कफ़्लो के माध्यम से जाने की आवश्यकता है। छवि प्रसंस्करण वर्कफ़्लो का लक्ष्य अध्ययन के तहत नमूने का पुनर्निर्माण करने में सक्षम होने के लिए अधिग्रहण पैरामीटर की पहचान करना है। Scipion एक एकीकृत ढांचे में कई छवि प्रसंस्करण पैकेज का उपयोग करके इस वर्कफ़्लो को बनाने के लिए सभी उपकरण प्रदान करता है, जो परिणामों की ट्रेसेबिलिटी की भी अनुमति देता है। इस लेख में Scipion में पूरे छवि प्रसंस्करण वर्कफ़्लो प्रस्तुत किया गया है और एक वास्तविक परीक्षण मामले से आने वाले डेटा के साथ चर्चा की है, माइक्रोस्कोप द्वारा प्राप्त फिल्मों से एक उच्च संकल्प अंतिम 3 डी पुनर्निर्माण के लिए जाने के लिए आवश्यक सभी विवरण दे रही है। इसके अलावा, आम सहमति उपकरणों का उपयोग करने की शक्ति जो विधियों के संयोजन की अनुमति देती है, और वर्कफ़्लो के हर चरण के साथ परिणामों की पुष्टि करती है, प्राप्त परिणामों की सटीकता में सुधार करती है, पर चर्चा की जाती है।

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Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में एकल-कण विश्लेषण उच्च रिज़ॉल्यूशन पर जैविक ensembles की संरचना को निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली मुख्य तकनीकों में से एक है। Scipion माइक्रोस्कोप द्वारा प्राप्त जानकारी को संसाधित करने और जैविक नमूने के 3 डी पुनर्निर्माण को प्राप्त करने के लिए पूरी पाइपलाइन बनाने के लिए उपकरण प्रदान करता है।

क्रायो-ईएम और Scipion के साथ एकल कण विश्लेषण

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Scipion जैविक नमूने के एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन पुनर्निर्माण को प्राप्त करने के लिए क्रायो-ईएम में एक एकल कण विश्लेषण के लिए एक एकीकृत तरीके से पूरे प्रसंस्करण वर्कफ़्लो को बनाने के लिए उपकरण प्रदान करता है। यह ढांचा कई छवि प्रसंस्करण पैकेजों का उपयोग करके प्रसंस्करण वर्कफ़्लो बनाना संभव बनाता है, जो इंटरऑपरेबिलिटी, ट्रेसेबिलिटी, पुनरुत्पादन, और अधिक सटीक आउटपुट उत्पन्न करने के लिए विभिन्न तरीकों से व्यक्त की गई जानकारी के संयोजन का पक्ष लेता है। Scipion लगातार बढ़ रहा है, जिसमें नए तरीके और पैकेज शामिल हैं।इसके अलावा, इसे क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी और परमाणु मॉडलिंग तक बढ़ाया गया है, जिससे इन डेटा को संसाधित करने के लिए वर्कफ़्लो बनाने की भी अनुमति मिलती है। Scipion में कोई प्रोजेक्ट बनाने के लिए, प्रोजेक्ट बनाने के लिए प्रोजेक्ट बनाएँ क्लिक करें. माइक्रोस्कोप चलचित्रों को आयात करने के लिए, चलचित्र आयात करें का चयन करें.एक नई विंडो दिखाई देगी। इस विंडो में, डेटा के लिए पथ दर्ज करें और माइक्रोस्कोप वोल्टेज को 300 किलोवोल्ट, गोलाकार विपथन को दो मिलीमीटर, आयाम 0.1 के विपरीत, 50, 000 के लिए आवर्धन दर, छवि से नमूना दर मोड, और पिक्सेल आकार को 1.34 एंगस्ट्रोम पर सेट करें। जब सभी पैरामीटर सेट हो गए हैं, तो निष्पादित करें क्लिक करें.विधि पूरी होने पर, सारांश टैब खोलें परिणामों का विश्लेषण करें क्लिक करें. विधि द्वारा उत्पन्न आउटपुट की एक सूची के साथ एक नई विंडो दिखाई देगी। चलचित्र संरेखण के लिए ऑप्टिकल प्रवाह विधि को चलाने के लिए, xmipp3 ऑप्टिकल संरेखण विधि खोलें, और इनपुट फिल्मों के रूप में आयातित फिल्मों का चयन करें और फ्रेम्स को 2 से 13 तक ALIGN श्रेणी में सेट करें।अतिरिक्त पैरामीटर्स के अंतर्गत, सेट करें SUM फ़्रेम के लिए पिछले चलचित्र संरेखण का उपयोग करें विकल्प No.Leave अन्य सभी विकल्पों को उनके डिफ़ॉल्ट मानों पर सेट करें और प्रोग्राम निष्पादित करें करने के लिए। प्राप्त माइक्रोग्राफ और अनुमानित शिफ्ट के प्रक्षेपवक्र की जाँच करने के लिए परिणामों का विश्लेषण करें क्लिक करें. प्रत्येक माइक्रोग्राफ के लिए, शक्ति वर्णक्रमीय घनत्व की जांच करना संभव है, कार्टेशियन और ध्रुवीय निर्देशांक दोनों में फिल्म को संरेखित करने के लिए प्राप्त प्रक्षेपवक्र, और प्राप्त माइक्रोग्राफ का फ़ाइल नाम।ध्यान दें कि नमूने के कण फिल्म के एकल फ्रेम की तुलना में माइक्रोग्राफ में बहुत अधिक दिखाई देते हैं। कण चुनने के लिए, xmipp3 मैनुअल पिकिंग विधि खोलें और इनपुट माइक्रोग्राफ के रूप में पहले से प्राप्त माइक्रोग्राफ का चयन करें। निष्पादित करेंक्लिक करें।एक नई इंटरैक्टिव विंडो दिखाई देगी। इस विंडो में, पिक्सेल का आकार 150 में बदलें. चयनित माइक्रोग्राफ एक बड़ी विंडो में दिखाई देगा।एक क्षेत्र के भीतर दिखाई देने वाले सभी कणों को चुनें। जब सभी कणों को मैन्युअल रूप से चुना गया है, तो सीखने को प्रारंभ करने के लिए प्रशिक्षण सक्रिय करें क्लिक करें. माइक्रोग्राफ के शेष क्षेत्रों को स्वचालित रूप से चुना जाएगा।चुने गए कणों की जाँच करें। एक अतिरिक्त कण को शामिल करने के लिए, ब्याज के एक कण पर क्लिक करें। किसी भी गलत कणों को निकालने के लिए, Shift को पकड़ो और आवश्यक रूप से कणों को क्लिक करें।जब सभी कणों को स्वचालित रूप से चुना गया है, तो प्रतिनिधि प्रशिक्षण सेट बनाने के लिए एक समय में एक अगले चार माइक्रोग्राफ का चयन करें। प्रत्येक चयनित माइक्रोग्राफ में कणों को स्वचालित रूप से उठाया जाएगा, प्रत्येक माइक्रोग्राफ को आवश्यक रूप से कणों को शामिल करने या हटाने के लिए जांच की जाएगी। जब कोई प्रशिक्षण सेट प्राप्त कर लिया गया है, तो सभी चुने गए कणों के निर्देशांक को सहेजने के लिए निर्देशांक क्लिक करें.प्रशिक्षण सेट प्राप्त करने के बाद, Xmipp3 ऑटो-पिकिंग को Xmipp कण पिकिंग रन में पिछले मैनुअल पिकिंग को इंगित करने के लिए खोलें और पर्यवेक्षित के रूप में समान चुनने के लिए माइक्रोग्राफ सेट करें। लगभग 100, 000 निर्देशांक का सेट जनरेट करने के लिए निष्पादित करें क्लिक करें. आम सहमति दृष्टिकोण को लागू करने के लिए, स्फीर क्रायोलो पिकिंग खोलें और डिफ़ॉल्ट रूप से पिकिंग मॉडल में इनपुट माइक्रोग्राफ के रूप में पूर्व-संसाधित माइक्रोग्राफ सेट करें।कॉन्फिडेंस थ्रेशोल्ड को 0.3 पर और बॉक्स का आकार 150 पर सेट करें, फिर निष्पादित करें क्लिक करें. विधि को लगभग 100, 000 निर्देशांक भी उत्पन्न करना चाहिए। अगला, खुला xmipp3 गहरी आम सहमति उठा और इनपुट निर्देशांक सेट करने के लिए स्फियर cryolo और xmipp3 ऑटो-पिकिंग के आउटपुट को शामिल करने के लिए, पूर्व प्रशिक्षित करने के लिए मॉडल प्रकार का चयन करें, और छोड़ें प्रशिक्षण और स्कोर सीधे पूर्व प्रशिक्षित मॉडल के साथ हाँ करने के लिए, तो निष्पादित करें क्लिक करें।निष्पादन के अंत में, परिणामों का विश्लेषण करें क्लिक करें. नई विंडो में, आंख आइकन पर क्लिक करें। एक दूसरी नई विंडो सभी कणों की एक सूची के साथ खुलेगी।कॉलम में जेड-स्कोर मान प्रत्येक कण की गुणवत्ता में अंतर्दृष्टि देंगे, क्योंकि कम मूल्य खराब गुणवत्ता का संकेत है। उच्चतम से निम्नतम Z-स्कोर तक कणों को क्रमबद्ध करने के लिए, Xmipp Z-स्कोर डीप लर्निंग पर क्लिक करें और 0.75 से अधिक Z-स्कोर वाले कणों का चयन करें. उसके बाद लगभग 50, 000 निर्देशांक के साथ नया सबसेट बनाने के लिए निर्देशांक क्लिक करें।स्थानीय रूप से रिज़ॉल्यूशन की गणना करने के लिए, xmipp3 स्थानीय MonoRes खोलें और इनपुट वॉल्यूम को अंतिम परिशोधन चरण के आउटपुट पर सेट करें, क्या आप हाँ में आधे वॉल्यूम का उपयोग करना चाहेंगे, और रिज़ॉल्यूशन रेंज 1 से 10 एंगस्ट्रॉम तक। जब पैरामीटर सेट हो जाते हैं, तो निष्पादित करें क्लिक करें. जब रिज़ॉल्यूशन परिकलित किया गया है, तो परिणामों का विश्लेषण करें क्लिक करें और रिज़ॉल्यूशन हिस्टोग्राम दिखाएँ और रंगीन स्लाइस दिखाएँ का चयन करें.वॉल्यूम के विभिन्न भागों में रिज़ॉल्यूशन दिखाया जाएगा। संरचनाओं के केंद्रीय भागों के अधिकांश वोक्सेल को तीन एंगस्ट्रॉम के आसपास के संकल्पों का प्रतिनिधित्व करना चाहिए, जबकि संरचनाओं के बाहरी क्षेत्रों में सबसे खराब संकल्प देखे जाएंगे। तीन एंगस्ट्रॉम के चारों ओर या नीचे एक चोटी के साथ प्रति वोक्सेल संकल्पों का एक हिस्टोग्राम भी दिखाया जाएगा।एक sharpening लागू करने के लिए, xmipp3 localdeblur sharpening खोलें और इनपुट मैप के रूप में अंतिम परिशोधन चरण के आउटपुट का चयन करें, और रिज़ॉल्यूशन मैप प्राप्त करें MonoRes मानचित्र पर सेट करें। आदेश निष्पादित होने के बाद, सारांश टैब में आउटपुट के रूप में उत्पन्न वॉल्यूम के सेट पर डबल-क्लिक करें। प्रत्येक पुनरावृत्ति में उत्पन्न वॉल्यूम की जाँच की जा सकती है।3 डी में वॉल्यूम की विशेषताओं को बेहतर ढंग से देखने के लिए यूसीएसएफ चिमेरा जैसे अन्य उपकरणों के साथ वॉल्यूम खोलने की भी सिफारिश की जाती है। इस आंकड़े में, तीन एंगस्ट्रॉम का एक फूरियर शेल सहसंबंध, जो कि Nyquist सीमा के बहुत करीब है, को देखा जा सकता है। जैसा कि सचित्र है, पुनर्निर्मित 3 डी वॉल्यूम स्लाइस विस्तार और अच्छी तरह से परिभाषित संरचनाओं के उच्च स्तर को प्रदर्शित करते हैं।स्थानीय विश्लेषण के बाद, अधिकांश केंद्रीय वोक्सेल तीन एंगस्ट्रॉम से नीचे एक संकल्प प्राप्त करते हैं। स्थानीय रिज़ॉल्यूशन स्लाइस के बाहरी क्षेत्र एक कम रिज़ॉल्यूशन प्रदर्शित करते हैं, हालांकि, जो उन क्षेत्रों के भीतर देखे गए धुंधलेपन के अनुरूप है। पोस्ट-प्रोसेसिंग के बाद, 3 डी मानचित्र वॉल्यूम की उच्च आवृत्तियों को देखा जा सकता है, अधिक विवरण का खुलासा किया जा सकता है और प्रतिनिधित्व में सुधार किया जा सकता है।जब प्राप्त संकल्प काफी अधिक होता है, तो यहां तक कि संरचना के कुछ जैव रासायनिक भागों को भी देखा जा सकता है। यदि प्राप्त संरचना में कम रिज़ॉल्यूशन है, और एक बेहतर में विकसित होने में सक्षम नहीं है, तो स्थानीय अनुमान के कम फूरियर शेल सहसंबंध, रिज़ॉल्यूशन वक्र और हिस्टोग्राम के साथ एक धुंधली मात्रा देखी जा सकती है। चुनने के बाद, कण गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए 2 डी वर्गीकरण की जांच की जा सकती है।उदाहरण के लिए, इस वर्गीकरण में, कण शोर, असंकेंद्रित, या युग्मित होते हैं, यह दर्शाता है कि उठाना गलत था। प्रारंभिक वॉल्यूम अनुमान के दौरान अन्य चेकपॉइंट किया जा सकता है। इस उदाहरण में, विधि के लिए एक गलत सेटअप का उपयोग कर एक गलत अनुमान बनाया गया था।एक बार पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन के साथ एक 3 डी मानचित्र का उत्पादन होने के बाद, अगला कदम मानचित्र के लिए एक परमाणु मॉडल का प्रस्ताव करना है। यह मॉडलिंग प्लगइन्स का उपयोग करके स्किपियन के भीतर किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग दवा डिजाइन के आधार के रूप में उनके आणविक इंटरैक्शन और जैविक पहनावा समारोह के मूल्यांकन के लिए जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स के सफलतापूर्वक पुनर्निर्माण के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

उच्च-रिज़ॉल्यूशन एकल कण विश्लेषण, इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी इमेजिंग स्पैयर का उपयोग करना

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

पेप्टाइड माइक्रोरायर्स के साथ हिस्टोन एंटीबॉडी विशिष्टता का विश्लेषण

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

मानव लिपिड के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल TRPC3 के एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए अभिव्यक्ति और शुद्धि

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

सचारोमाइसेस सेरेविसी के सेलुलर लिपिडोम का मात्रात्मक विश्लेषण टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी: नमूना से संरचना तक

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

मैनुअल धब्बा-और-डुबकी एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए जैविक नमूनों की ठंड

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

क्रायो-ईएम के लिए उच्च तापमान नमूना ग्रिड की तैयारी

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

एक मजबूत एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) क्रायोस्पार्क, RELION, और Scipion के साथ प्रसंस्करण वर्कफ़्लो

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

200 केवी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटासेट का नियमित संग्रह

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

पील-ब्लोट तकनीक: बहु-स्तरित या केंद्रित जैविक नमूनों से एकल परतों को अलग करने के लिए एक क्रायो-ईएम नमूना तैयारी विधि

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...