Name: cryo-em and single-particle analysis with scipion
Uploaded: 2021-05-29T13:00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne økonomisk støtte fra: Det spanske vitenskaps- og innovasjonsdepartementet gjennom tilskudd: PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033, "Comunidad Autónoma de Madrid" gjennom Grant: S2017/BMD-3817, Instituto de Salud Carlos III, Carlos III, PT17/0009/0010 (ISCIII-SGEFI/ERDF), EU og Horizon 2020 gjennom stipend: INSTRUCT - ULTRA (INFRADEV-03-2016-2017, Forslag: 731005), EOSC Life (INFRAEOSC-04-2018, Forslag: 824087), iNEXT - Discovery (Forslag: 871037) og HighResCells (ERC - 2018 - SyG, Forslag: 810057). Prosjektet som ga opphav til disse resultatene fikk støtte fra et stipend fra "la Caixa" Foundation (ID 100010434). Stipendiatkoden er LCF/BQ/DI18/11660021. Dette prosjektet har fått støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddsavtalen Nr. 713673. Forfatterne anerkjenner støtten og bruken av ressurser fra Instruct, et Landmark ESFRI-prosjekt.

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Resolution+Revolution.">The Resolution Revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>. 1.15 A structure of human apoferritin obtained from Titan Mono- BCOR microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/7A6A">https://www.rcsb.org/structure/7A6A</a> (2021)</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturizing+EM+Sample+Preparation:+Opportunities,+Challenges,+and+"Visual+Proteomics".">Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics".</a> PROTEOMICS. 18 (5-6), 1700176 (2018).</li><li>Faruqi, A. R., McMullan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+detectors+for+electron+microscopy.">Direct imaging detectors for electron microscopy.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 878, 180-190 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+image+processing+for+single-particle+analysis+by+electron+cryomicroscopy+and+challenges+ahead.">Advances in image processing for single-particle analysis by electron cryomicroscopy and challenges ahead.</a> Current Opinion in Structural Biology. 52, 127-145 (2018).</li><li>Martinez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Cryo-EM+Model+Building+Software+in+Scipion.">Integration of Cryo-EM Model Building Software in Scipion.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 60, 2533-2540 (2020).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195, 93-99 (2016).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xmipp+3.0:+an+improved+software+suite+for+image+processing+in+electron+microscopy.">Xmipp 3.0: an improved software suite for image processing in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 184, 321-328 (2013).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. The Resolution Revolution: Recent Advances In cryoEM. , 125-157 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14, 290-296 (2017).</li><li>Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+structures+of+macromolecules+using+single-particle+analysis+in+EMAN.">3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN.</a> Methods in Molecular Biology. 673, 157-173 (2010).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3, 1941-1974 (2008).</li><li>Wagner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPHIRE-crYOLO+is+a+fast+and+accurate+fully+automated+particle+picker+for+cryo-EM.">SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM.</a> Communications Biology. 2, (2019).</li><li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy.">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 142, 334-347 (2003).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 67, 235-242 (2011).</li><li>Liebschner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+structure+determination+using+X-rays,+neutrons+and+electrons:+recent+developments+in+Phenix.">Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix.</a> Acta Crystallographica Section D. 75, 861-887 (2019).</li><li>Wong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+Plasmodium+falciparum+80S+ribosome+bound+to+the+anti-protozoan+drug+emetine.">Cryo-EM structure of the Plasmodium falciparum 80S ribosome bound to the anti-protozoan drug emetine.</a> eLife. 3, 03080 (2014).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+direct+detection+device+micrographs+using+a+robust+Optical+Flow+approach.">Alignment of direct detection device micrographs using a robust Optical Flow approach.</a> Journal of Structural Biology. 189, 163-176 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., Jonic, S., Nunez Ramirez, R., Boisset, N., Carazo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+robust+and+accurate+determination+of+transmission+electron+microscopy+contrast+transfer+function.">Fast, robust and accurate determination of transmission electron microscopy contrast transfer function.</a> Journal of Structural Biology. 160, 249-262 (2007).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pattern+matching+approach+to+the+automatic+selection+of+particles+from+low-contrast+electron+micrographs.">A pattern matching approach to the automatic selection of particles from low-contrast electron micrographs.</a> Bioinformatics. 29, 2460-2468 (2013).</li><li>Sanchez-Garcia, R., Segura, J., Maluenda, D., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Consensus,+a+deep+learning-based+approach+for+particle+pruning+in+cryo-electron+microscopy.">Deep Consensus, a deep learning-based approach for particle pruning in cryo-electron microscopy.</a> IUCrJ. 5, 854-865 (2018).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171, 197-206 (2010).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+approach+to+the+initial+volume+problem+in+Single+Particle+Analysis+by+Electron+Microscopy.">A statistical approach to the initial volume problem in Single Particle Analysis by Electron Microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 189, 213-219 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarm+optimization+as+a+consensus+technique+for+Electron+Microscopy+Initial+Volume.">Swarm optimization as a consensus technique for Electron Microscopy Initial Volume.</a> Applied Analysis and Optimization. 2, 299-313 (2018).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204, 329-337 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+Accurate+Estimation+of+Local+Resolution+for+Electron+Microscopy+Maps.">MonoRes: Automatic and Accurate Estimation of Local Resolution for Electron Microscopy Maps.</a> Structure. 26, 337-344 (2018).</li><li>Ramirez-Aportela, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+local+resolution-based+sharpening+of+cryo-EM+maps.">Automatic local resolution-based sharpening of cryo-EM maps.</a> Bioinformatics. 36, 765-772 (2020).</li><li>Heymann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+3D+EM+Reconstructions:+The+Phantom+in+the+Noise.">Validation of 3D EM Reconstructions: The Phantom in the Noise.</a> AIMS Biophys. 2, 21-35 (2015).</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+An+integrated,+database-drive+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: An integrated, database-drive pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166, 95-102 (2009).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151, 41-60 (2005).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

For tiden er cryo-EM et nøkkelverktøy for å avsløre 3D-strukturen til biologiske prøver. Når det samles inn gode data med mikroskopet, vil de tilgjengelige prosesseringsverktøyene tillate oss å få en 3D-rekonstruksjon av makromolekylet som studeres. Cryo-EM-databehandling er i stand til å oppnå nesten atomisk oppløsning, noe som er nøkkelen til å forstå den funksjonelle oppførselen til en makromolekyl og er også avgjørende for narkotikaoppdagelse.
Scipion er en programvare som gjør det mulig å lage hele arbeidsflyten som kombinerer de mest relevante bildebehandlingspakkene på en integrerende måte, noe som hjelper sporbarheten og reproduserbarheten til hele arbeidsflyten for bildebehandling. Scipion gir et veldig komplett sett med verktøy for å utføre behandlingen; Imidlertid avhenger det å få rekonstruksjoner med høye oppløsninger helt av kvaliteten på de innsamvede dataene og hvordan disse dataene behandles. 
For å få en høyoppløselig 3D-rekonstruksjon er det første kravet å få gode filmer fra mikroskopet, som bevarer strukturell informasjon til høy oppløsning. Hvis dette ikke er tilfellet, kan ikke arbeidsflyten trekke ut HD-informasjon fra dataene. Deretter bør en vellykket prosesseringsarbeidsflyt kunne trekke ut partikler som virkelig samsvarer med strukturen og finne retningene til disse partiklene i 3D-rommet. Hvis noen av trinnene i arbeidsflyten mislykkes, forringes kvaliteten på det rekonstruerte volumet. Scipion tillater bruk av forskjellige pakker i noen av behandlingstrinnene, noe som bidrar til å finne den mest tilstrekkelige tilnærmingen til å behandle dataene. Videre, takket være å ha mange pakker tilgjengelig, kan konsensusverktøy, som øker nøyaktigheten ved å finne en avtale i estimerte utganger av forskjellige metoder, brukes. Det har også blitt diskutert i detalj i delen Representative Results flere valideringsverktøy og hvordan du identifiserer nøyaktige og unøyaktige resultater i hvert trinn i arbeidsflyten, for å oppdage potensielle problemer og hvordan du prøver å løse dem. Det er flere kontrollpunkter langs protokollen som kan bidra til å innse om protokollen kjører som den skal eller ikke. Noen av de mest relevante er: plukking, 2D-klassifisering, innledende volumestimering og 3D-justering. Å sjekke inngangene, gjenta trinnet med en annen metode, eller bruke konsensus, er alternativer som er tilgjengelige i Scipion som brukeren kan bruke til å finne løsninger når problemer oppstår. 
Når det gjelder de tidligere tilnærmingene til pakkeintegrasjon i Cryo-EM-feltet, er Appion31 den eneste som tillater reell integrasjon av forskjellige programvarepakker. Appion er imidlertid tett forbundet med Leginon32, et system for automatisert innsamling av bilder fra elektronmikroskop. Hovedforskjellen med Scipion er at datamodell og lagring er mindre koblet. På en slik måte, for å lage en ny protokoll i Scipion, trenger bare et Python-skript å utvikles. I Appion må imidlertid utvikleren skrive skriptet og endre den underliggende databasen. Oppsummert ble Scipion utviklet for å forenkle vedlikehold og utvidbarhet.
Vi har presentert i dette manuskriptet en komplett arbeidsflyt for Cryo-EM-behandling, ved hjelp av det virkelige saksdatasettet til Plasmodium falciparum 80S Ribosome (EMPIAR oppføring: 10028, EMDB oppføring: 2660). Trinnene som dekkes og diskuteres her, kan oppsummeres som filmjustering, CTF-estimering, partikkelplukking, 2D-klassifisering, innledende kartestimering, 3D-klassifisering, 3D-raffinement, evaluering og etterbehandling. Ulike pakker har blitt brukt og konsensusverktøy ble brukt i flere av disse trinnene. Det endelige 3D-rekonstruerte volumet oppnådde en oppløsning på 3 Å, og i det etterbehandlede volumet kan noen sekundære strukturer skille seg ut, som alfa-helikvier, noe som bidrar til å beskrive hvordan atomer er ordnet i rommet.
Arbeidsflyten som presenteres i dette manuskriptet viser hvordan Scipion kan brukes til å kombinere forskjellige Cryo-EM-pakker på en enkel og integrert måte for å forenkle behandlingen, og oppnå mer pålitelig resultat samtidig.
I fremtiden vil utviklingen av nye metoder og pakker fortsette å vokse, og programvare som Scipion for enkelt å integrere dem alle vil være enda viktigere for forskerne. Konsensustilnærminger vil være mer relevante selv da, når mange metoder med forskjellig grunnlag vil være tilgjengelige, og bidra til å oppnå mer nøyaktige beregninger av alle parametrene som er involvert i gjenoppbyggingsprosessen i Cryo-EM. Sporing og reproduserbarhet er nøkkelen i forskningsprosessen og enklere å oppnå med Scipion takket være å ha et felles rammeverk for utførelse av komplette arbeidsflyter.

I kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er enkeltpartikkelanalyse (SPA) av vitrifiserte frosne hydrerte prøver en av de mest brukte og vellykkede varianter av avbildning for biologiske makromolekyler, da det gjør det mulig å forstå molekylære interaksjoner og funksjonen til biologiske ensembler1. Dette er takket være de siste fremskrittene i denne bildeteknikken som ga opphav til "oppløsningsrevolusjonen"2 og har tillatt vellykket bestemmelse av biologiske 3D-strukturer med nesten atomisk oppløsning. For tiden var den høyeste oppløsningen oppnådd i SPA cryo-EM 1,15 Å for apoferritin3 (EMDB-oppføring: 11668). Disse teknologiske fremskrittene omfatter forbedringer i prøveprepareringen4, bildeinnhentingen5 og bildebehandlingsmetodene6. Denne artikkelen er fokusert på dette siste punktet.
Kort sagt er målet med bildebehandlingsmetodene å identifisere alle anskaffelsesparametrene for å invertere avbildningsprosessen til mikroskopet og gjenopprette 3D-strukturen til den biologiske prøven som studeres. Disse parametrene er forsterkningen av kameraet, den stråleinduserte bevegelsen, mikroskopets avvik (hovedsakelig defokus), vinkelretningen og oversettelsen av hver partikkel, og konformasjonstilstanden i tilfelle å ha et eksemplar med konformasjonsendringer. Imidlertid er antall parametere svært høyt, og cryo-EM krever bruk av lavdosebilder for å unngå strålingsskader, noe som reduserer signal-til-støy-forholdet (SNR) til de oppkjøpte bildene betydelig. Dermed kan problemet ikke løses utvetydig, og alle parametrene som skal beregnes, kan bare estimeres. Langs arbeidsflyten for bildebehandling bør de riktige parametrene identifiseres, og de resterende forkastes for endelig å få en 3D-rekonstruksjon med høy oppløsning.
Dataene som genereres av mikroskopet, samles inn i rammer. Forenkling inneholder en ramme antall elektroner som har kommet til en bestemt posisjon (piksel) i bildet, når elektrontellingsdetektorer brukes. I et bestemt synsfelt samles flere rammer, og dette kalles en film. Siden lave elektrondoser brukes til å unngå strålingsskader som kan ødelegge prøven, er SNR svært lav og rammene som tilsvarer samme film må beregnes i gjennomsnitt for å få et bilde som avslører strukturell informasjon om prøven. Imidlertid brukes ikke bare et enkelt gjennomsnitt, prøven kan lide skift og andre typer bevegelser i løpet av bildetiden på grunn av den stråleinduserte bevegelsen som må kompenseres. De skiftkompenserte og gjennomsnittlige rammene kommer fra en mikrograf.
Når mikrografene er oppnådd, må vi estimere avvikene introdusert av mikroskopet for hver av dem, kalt Contrast Transfer Function (CTF), som representerer endringene i mikrografens kontrast som en frekvensfunksjon. Deretter kan partiklene velges og ekstraheres, som kalles partikkelplukking. Hver partikkel skal være et lite bilde som bare inneholder en kopi av prøven som studeres. Det er tre familier av algoritmer for partikkelplukking: 1) de som bare bruker noen grunnleggende parameterisering av partikkelens utseende for å finne dem i hele settet med mikrografer (f.eks. partikkelstørrelse), 2) de som lærer hvordan partiklene ser ut fra brukeren eller et forhåndsskolert sett, og 3) de som bruker bildemaler. Hver familie har forskjellige egenskaper som vil bli vist senere.
Det ekstraherte settet med partikler som finnes i mikrografene, vil bli brukt i en 2D-klassifiseringsprosess som har to mål: 1) rengjøring av settet med partikler ved å kaste delsettet som inneholder rene støybilder, overlappende partikler eller andre artefakter, og 2) de gjennomsnittlige partiklene som representerer hver klasse, kan brukes som innledende informasjon for å beregne et 3D-startvolum. 
Den første volumberegningen for 3D er det neste avgjørende trinnet. Problemet med å skaffe 3D-strukturen kan sees på som et optimaliseringsproblem i et flerdimensjonalt løsningslandskap, hvor det globale minimumet er det beste 3D-volumet som representerer den opprinnelige strukturen, men flere lokale minima som representerer suboptimale løsninger kan bli funnet, og hvor det er veldig enkelt å bli fanget. Det første volumet representerer utgangspunktet for søkeprosessen, så dårlig innledende volumestimering kan hindre oss i å finne det globale minimumet. Fra det første volumet vil et 3D-klassifiseringstrinn bidra til å oppdage forskjellige konformasjonstilstander og å rengjøre igjen settet av partikler; målet er å oppnå en strukturelt homogen populasjon av partikler. Etter det vil et 3D-raffineringstrinn være ansvarlig for å raffinere vinkel- og oversettelsesparametrene for hver partikkel for å få best mulig 3D-volum. 
Til slutt, i de siste trinnene, kan den oppnådde 3D-rekonstruksjonen gjøres skarpere og polert. Skarpgjøring er en prosess for å øke de høye frekvensene til det rekonstruerte volumet, og poleringen er et skritt for å ytterligere avgrense noen parametere, som CTF eller stråleindusert bevegelseskompensasjon, på nivået av partikler. Noen valideringsprosedyrer kan også brukes til å få en bedre forståelse av den oppnådde løsningen på slutten av arbeidsflyten. 
Etter alle disse trinnene vil sporings- og dokkingprosessene7 bidra til å gi en biologisk betydning for den oppnådde 3D-rekonstruksjonen, ved å bygge atommodeller de novo eller montere eksisterende modeller. Hvis høy oppløsning oppnås, vil disse prosessene fortelle oss posisjonene til de biologiske strukturene, selv av de forskjellige atomene, i vår struktur.
Scipion8 gjør det mulig å opprette hele arbeidsflyten ved å kombinere de mest relevante bildebehandlingspakkene på en integrerende måte. Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, Eman12, Spider13, Cryolo14, Ctffind15, CCP416, Phenix17 og mange flere pakker kan inkluderes i Scipion. Den inneholder også alle nødvendige verktøy for å dra nytte av integrasjon, interoperabilitet, sporbarhet og reproduserbarhet for å gjøre en full sporing av hele arbeidsflyten for bildebehandling8.
Et av de kraftigste verktøyene som Scipion lar oss bruke er konsensus, noe som betyr å sammenligne resultatene oppnådd med flere metoder i ett trinn av behandlingen, noe som gjør en kombinasjon av informasjonen formidlet av forskjellige metoder for å generere en mer nøyaktig utgang. Dette kan bidra til å øke ytelsen og forbedre den oppnådde kvaliteten i de estimerte parametrene. Legg merke til at en enklere arbeidsflyt kan bygges uten bruk av konsensusmetoder. Vi har imidlertid sett kraften i dette verktøyet22,25 og arbeidsflyten som presenteres i dette manuskriptet vil bruke det i flere trinn.
Alle trinnene som er oppsummert i de forrige avsnittene, vil bli forklart i detalj i den følgende delen og kombinert i en fullstendig arbeidsflyt ved hjelp av Scipion. Også hvordan du bruker konsensusverktøyene for å oppnå en høyere avtale i de genererte utgangene vil bli vist. For dette formål er eksempeldatasettet til Plasmodium falciparum 80S Ribosome valgt (EMPIAR-oppføring: 10028, EMDB-oppføring: 2660). Datasettet er dannet av 600 filmer av 16 bilder av størrelse 4096x4096 piksler i en pikselstørrelse på 1.34Å tatt på en FEI POLARA 300 med en FEI FALCON II kamera, med en rapportert oppløsning på EMDB er 3.2Å18 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>no material is used in this article</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-em and single-particle analysis with scipion

Kryo-elektronmikroskopi har blitt et av de viktigste verktøyene i biologisk forskning for å avsløre strukturell informasjon om makromolekyler ved nesten atomoppløsning. I enpartikkelanalyse er den vitrifiserte prøven avbildet av en elektronstråle, og detektorene på slutten av mikroskopkolonnen produserer filmer av den prøven. Disse filmene inneholder tusenvis av bilder av identiske partikler i tilfeldige retninger. Dataene må gå gjennom en arbeidsflyt for bildebehandling med flere trinn for å få det endelige 3D-rekonstruerte volumet. Målet med arbeidsflyten for bildebehandling er å identifisere anskaffelsesparametrene for å kunne rekonstruere prøven som studeres. Scipion inneholder alle verktøyene for å opprette denne arbeidsflyten ved hjelp av flere bildebehandlingspakker i et integrert rammeverk, noe som også gjør det mulig å spore resultatene. I denne artikkelen presenteres og diskuteres hele arbeidsflyten for bildebehandling i Scipion med data som kommer fra et ekte testtilfelle, og gir alle detaljene som er nødvendige for å gå fra filmene oppnådd av mikroskopet til en høyoppløselig endelig 3D-rekonstruksjon. Også kraften i å bruke konsensusverktøy som tillater å kombinere metoder, og bekrefte resultater langs hvert trinn i arbeidsflyten, forbedre nøyaktigheten av de oppnådde resultatene, diskuteres.

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Enpartikkelanalyse i kryo-elektronmikroskopi er en av de viktigste teknikkene som brukes til å bestemme strukturen til biologiske ensembler ved høy oppløsning. Scipion gir verktøy for å lage hele rørledningen for å behandle informasjonen som er oppnådd av mikroskopet og oppnå en 3D-rekonstruksjon av den biologiske prøven.

Kryo-EM og enkeltpartikkelanalyse med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Scipion gir verktøyene til å lage hele prosesseringsarbeidsflyten på en integrerende måte for en enkelt partikkelanalyse i kryo-EM for å oppnå en høyoppløselig rekonstruksjon av den biologiske prøven. Dette rammeverket gjør det mulig å opprette behandlingsarbeidsflyten ved hjelp av flere bildebehandlingspakker, som favoriserer interoperabilitet, sporbarhet, reproduserbarhet og kombinasjonen av informasjon formidlet av forskjellige metoder for å generere en mer nøyaktig utgang. Scipion vokser stadig, inkludert nye metoder og pakker.Videre har den blitt utvidet til kryo-elektrontomografi og atommodellering, slik at den også kan lage arbeidsflyter for å behandle disse dataene. Hvis du vil opprette et prosjekt i Scipion, klikker du Opprett prosjekt for å opprette prosjektet. Hvis du vil importere mikroskopfilmene, velger du Importer filmer.Et nytt vindu vises. I dette vinduet angir du banen til dataene og setter mikroskopspenningen til 300 kilovolt, den sfæriske avviket til to millimeter, Amplitude-kontrasten til 0,1, forstørrelseshastigheten til 50 000, samplingsfrekvensmodusen til Fra bilde og Pikselstørrelsen til 1,34 angstrom. Når alle parameterne er angitt, klikker du Kjør.Når metoden er ferdig, åpner du kategorien Sammendrag og klikker Analyser resultater. Et nytt vindu vises med en oversikt over utdataene som genereres av metoden. Hvis du vil kjøre den optiske flytmetoden for filmjustering, åpner du xmipp3 optisk justeringsmetode og velger de importerte filmene som inndatafilmer og setter Frames til ALIGN-området fra 2 til 13.Under Flere parametere setter du alternativet Bruk tidligere filmjustering til SUMMER-rammer til Nei.La alle de andre alternativene være satt til standardverdiene, og kjør programmet. Klikk Analyser resultater for å kontrollere de oppnådde mikrografene og banen til de estimerte skiftene. For hver mikrograf er det mulig å sjekke kraftspektral tetthet, banene som er oppnådd for å justere filmen i både kartesiske og polare koordinater, og filnavnet til den oppnådde mikrografen.Legg merke til at partiklene av prøven er mye mer synlige i mikrografen sammenlignet med en enkelt ramme av filmen. For partikkelplukking åpner du xmipp3 manuell plukkmetode og velger de tidligere oppnådde mikrografene som inngangsmikrografer. Klikk Kjør.Et nytt interaktivt vindu vises. I dette vinduet endrer du pikselstørrelsen til 150. Den valgte mikrografen vises i et større vindu.Velg alle synlige partikler innenfor en region. Når alle partiklene er plukket manuelt, klikker du på Aktiver opplæring for å starte læringen. De resterende områdene av mikrografen blir automatisk plukket.Kontroller de plukkede partiklene. For å inkludere en ekstra partikkel, klikk på en partikkel av interesse. Hvis du vil fjerne feil partikler, holder du nede Skift og klikker partiklene etter behov.Når alle partiklene er plukket automatisk, velger du de neste fire mikrografene én om gangen for å opprette et representativt opplæringssett. Partiklene i hver valgte mikrograf plukkes automatisk, og hver mikrograf kontrolleres for å inkludere eller fjerne partikler etter behov. Når et treningssett er anskaffet, klikker du Koordinater for å lagre koordinatene til alle de plukkede partiklene.Etter å ha anskaffet treningssettet, åpner du xmipp3 autoplukking for å indikere forrige manuelle plukking i Xmipp partikkelplukkingskjøring og sett Micrographs til å velge samme som overvåket. Klikk Utfør for å generere et sett med rundt 100 000 koordinater. For å bruke konsensus tilnærming, åpne sphire cryolo plukke og sette forhåndsinnstilte mikrografer som inngangsmikrografer i plukkmodellen til standard.Sett konfidensterskelen til 0,3 og boksstørrelsen til 150, og klikk deretter Utfør. Metoden bør også generere rundt 100 000 koordinater. Deretter åpner du xmipp3 dyp konsensusplukking og angir inngangskoordinatene for å inkludere utgangen av sphire cryolo og xmipp3 autoplukking, Select-modelltypen som skal forhåndsutdannet, og Hopp over trening og score direkte med forhåndsutdannet modell til Ja, og klikk deretter Påfør.Klikk Analyser resultater på slutten av utføringen. Klikk øyeikonet i det nye vinduet. Et annet nytt vindu åpnes med en liste over alle partiklene.Z-score-verdiene i kolonnen vil gi innsikt i kvaliteten på hver partikkel, da en lav verdi indikerer en dårlig kvalitet. Hvis du vil bestille partiklene fra den høyeste til laveste Z-poengsummen, klikker du på Xmipp Z-score dyp læring og velger partiklene med en Z-skår høyere enn 0,75. Klikk deretter Koordinater for å opprette et nytt delsett med omtrent 50 000 koordinater.Hvis du vil beregne oppløsningen lokalt, åpner du xmipp3 lokale MonoRes og setter inndatavolumet til utdataene for det siste forbedringstrinnet, vil du bruke halve volumer til Ja og oppløsningsområdet fra 1 til 10 angstrom. Når parameterne er angitt, klikker du Utfør. Når oppløsningen er beregnet, klikker du Analyser resultater og velger Vis oppløsningshistogram og Vis fargede stykker.Oppløsningen i de ulike delene av volumet vises. De fleste voxels av de sentrale delene av strukturene bør representere oppløsninger rundt tre angstrom, mens de verste oppløsningene vil bli observert i de ytre områdene av strukturene. Et histogram av oppløsningene per voxel med en topp rundt eller under tre angstrom vil også bli vist.Hvis du vil bruke en skarphet, åpner du xmipp3 localdeblur-skarphet og velger utdataene for det siste forbedringstrinnet som Inndatakart, og angir oppløsningskartet til kartet for å hente MonoRes. Når kommandoen er utført, dobbeltklikker du settet med volumer som genereres som utdata i kategorien Sammendrag . Volumene som genereres i hver gjentakelse, kan kontrolleres.Det anbefales også å åpne volumet med andre verktøy, for eksempel UCSF Chimera, for bedre å observere egenskapene til volumet i 3D. I denne figuren kan en Fourier shell korrelasjon på tre angstrom, som er svært nær Nyquist-grensen, observeres. Som illustrert viser de rekonstruerte 3D-volumskivene et høyt detaljnivå og veldefinerte strukturer.Etter lokal analyse oppnår de fleste av de sentrale voxels en oppløsning under tre angstrom. De ytre områdene i de lokale oppløsningsstykkene viser imidlertid en lavere oppløsning, noe som er i samsvar med uskarpheten som observeres i disse områdene. Etter etterbehandling kan de høyere frekvensene til 3D-kartvolumet observeres, avsløre flere detaljer og forbedre representasjonen.Når den oppnådde oppløsningen er høy nok, kan selv noen av de biokjemiske delene av strukturen observeres. Hvis den oppnådde strukturen har lav oppløsning, og ikke kan utvikles til en bedre, kan et uskarpt volum med lav Fourier-skallkorrelasjon, oppløsningskurve og histogram av den lokale beregningen observeres. Etter plukking kan 2D-klassifiseringen kontrolleres for å evaluere partikkelkvaliteten.I denne klassifiseringen er for eksempel partiklene støyende, usentrerte eller koblet, noe som indikerer at plukkingen var feil. Et annet kontrollpunkt kan utføres under den første volumestimeringen. I dette eksemplet ble det opprettet en ugyldig estimering ved hjelp av feil oppsett for metoden.Når et 3D-kart med tilstrekkelig oppløsning er produsert, er neste trinn å foreslå en atommodell for kartet. Dette kan gjøres i Scipion ved hjelp av modelleringspluginene. Denne teknikken kan brukes til å rekonstruere biologiske makromolekyler for evaluering av deres molekylære interaksjoner og biologiske ensemblefunksjon som grunnlag for legemiddeldesign.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse av histonantistof spesifisitet med peptidmikroarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttrykk og rensing av menneskelige Lipid-sensitive kasjon kanal-TRPC3 for strukturelle vilje av Single-partikkel Cryo-elektronmikroskop

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuell flekk-og-dypfrysing av biologiske prøver for kryogen elektronmikroskopi med én partikkel

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Klargjøring av høytemperatur prøvegitter for Cryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinemessig innsamling av kryo-EM-datasett med høy oppløsning ved bruk av 200 KV-transmisjonselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveprepareringsmetode for å skille enkeltlag fra flerlags eller konsentrerte biologiske prøver

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...