Name: cryo-em and single-particle analysis with scipion
Uploaded: 2021-05-29T13:00:00
Duration: 9 min 6 s
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Los autores desean agradecer el apoyo económico de: El Ministerio de Ciencia e Innovación de España a través de Subvenciones: PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033, la "Comunidad Autónoma de Madrid" a través de la Subvención: S2017/BMD-3817, Instituto de Salud Carlos III, PT17/0009/0010 (ISCIII-SGEFI/FEDER), Unión Europea (UE) y Horizonte 2020 a través de la subvención: INSTRUCT - ULTRA (INFRADEV-03-2016-2017, Propuesta: 731005), EOSC Life (INFRAEOSC-04-2018, Propuesta: 824087), iNEXT - Discovery (Propuesta: 871037) y HighResCells (ERC - 2018 - SyG, Propuesta: 810057). El proyecto que dio lugar a estos resultados recibió el apoyo de una beca de la Fundación "la Caixa" (ID 100010434). El código de la beca es LCF/BQ/DI18/11660021. Este proyecto ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie n.º 713673. Los autores reconocen el apoyo y el uso de los recursos de Instruct, un proyecto de Landmark ESFRI.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Actualmente, la crio-EM es una herramienta clave para revelar la estructura 3D de las muestras biológicas. Cuando se recogen buenos datos con el microscopio, las herramientas de procesamiento disponibles nos permitirán obtener una reconstrucción 3D de la macromolécula en estudio. El procesamiento de datos cryo-EM es capaz de lograr una resolución casi atómica, que es clave para comprender el comportamiento funcional de una macromolécula y también es crucial en el descubrimiento de fármacos.
Scipion es un software que permite crear todo el flujo de trabajo combinando los paquetes de procesamiento de imágenes más relevantes de forma integradora, lo que ayuda a la trazabilidad y reproducibilidad de todo el flujo de trabajo de procesamiento de imágenes. Scipion proporciona un conjunto muy completo de herramientas para llevar a cabo el procesamiento; sin embargo, la obtención de reconstrucciones de alta resolución depende completamente de la calidad de los datos adquiridos y de cómo se procesan estos datos. 
Para obtener una reconstrucción 3D de alta resolución, el primer requisito es obtener buenas películas del microscopio, que conserven la información estructural a alta resolución. Si este no es el caso, el flujo de trabajo no podrá extraer información de alta definición de los datos. Luego, un flujo de trabajo de procesamiento exitoso debería poder extraer partículas que realmente correspondan a la estructura y encontrar las orientaciones de estas partículas en el espacio 3D. Si se produce un error en alguno de los pasos del flujo de trabajo, la calidad del volumen reconstruido se degradará. Scipion permite utilizar diferentes paquetes en cualquiera de los pasos de procesamiento, lo que ayuda a encontrar el enfoque más adecuado para procesar los datos. Además, gracias a tener muchos paquetes disponibles, se pueden utilizar herramientas de consenso que aumentan la precisión al encontrar un acuerdo en los resultados estimados de diferentes métodos. Además, se han discutido en detalle en la sección de Resultados Representativos varias herramientas de validación y cómo identificar resultados precisos e inexactos en cada paso del flujo de trabajo, para detectar problemas potenciales y cómo tratar de resolverlos. Hay varios puntos de control a lo largo del protocolo que podrían ayudar a darse cuenta de si el protocolo se está ejecutando correctamente o no. Algunos de los más relevantes son: picking, clasificación 2D, estimación inicial de volumen y alineación 3D. Comprobar las entradas, repetir el paso con un método diferente, o utilizar el consenso, son opciones disponibles en Scipion que el usuario puede utilizar para encontrar soluciones cuando aparecen problemas. 
Con respecto a los enfoques anteriores para la integración de paquetes en el campo Cryo-EM, Appion31 es el único que permite la integración real de diferentes paquetes de software. Sin embargo, Appion está estrechamente conectado con Leginon32, un sistema para la recopilación automatizada de imágenes de microscopios electrónicos. La principal diferencia con Scipion es que el modelo de datos y el almacenamiento están menos acoplados. De tal manera, para crear un nuevo protocolo en Scipion, solo se necesita desarrollar un script de Python. Sin embargo, en Appion, el desarrollador debe escribir el script y cambiar la base de datos subyacente. En resumen, Scipion fue desarrollado para simplificar el mantenimiento y la extensibilidad.
Hemos presentado en este manuscrito un flujo de trabajo completo para el procesamiento cryo-EM, utilizando el conjunto de datos de casos reales del plasmodium falciparum 80S Ribosoma (entrada EMPIAR: 10028, entrada EMDB: 2660). Los pasos cubiertos y discutidos aquí se pueden resumir como alineación de películas, estimación de CTF, selección de partículas, clasificación 2D, estimación de mapas iniciales, clasificación 3D, refinamiento 3D, evaluación y post-procesamiento. Se han utilizado diferentes paquetes y se han aplicado herramientas de consenso en varios de estos pasos. El volumen final reconstruido en 3D alcanzó una resolución de 3 Å y, en el volumen postprocesado, se pueden distinguir algunas estructuras secundarias, como las hélices alfa, lo que ayuda a describir cómo se organizan los átomos en el espacio.
El flujo de trabajo presentado en este manuscrito muestra cómo Scipion se puede utilizar para combinar diferentes paquetes Cryo-EM de una manera directa e integradora para simplificar el procesamiento y obtener resultados más confiables al mismo tiempo.
En el futuro, el desarrollo de nuevos métodos y paquetes seguirá creciendo y el software como Scipion para integrar fácilmente todos ellos será aún más importante para los investigadores. Los enfoques de consenso serán más relevantes incluso entonces, cuando haya muchos métodos con diferentes bases disponibles, lo que ayudará a obtener estimaciones más precisas de todos los parámetros involucrados en el proceso de reconstrucción en Cryo-EM. El seguimiento y la reproducibilidad son claves en el proceso de investigación y más fáciles de lograr con Scipion gracias a tener un marco común para la ejecución de flujos de trabajo completos.

En la microscopía crioelectrónica (crio-EM), el análisis de partículas individuales (SPA) de especímenes vitrificados congelados-hidratados es una de las variantes de imagen más utilizadas y exitosas para macromoléculas biológicas, ya que permite comprender las interacciones moleculares y la función de los conjuntos biológicos1. Esto es gracias a los recientes avances en esta técnica de imagen que dieron lugar a la "revolución de la resolución"2 y han permitido la determinación exitosa de estructuras biológicas 3D con resolución casi atómica. Actualmente, la resolución más alta alcanzada en SPA cryo-EM fue de 1,15 Å para apoferritina3 (entrada EMDB: 11668). Estos avances tecnológicos comprenden mejoras en la preparación de muestras4, la adquisición de imágenes5 y los métodos de procesamiento de imágenes6. Este artículo se centra en este último punto.
Brevemente, el objetivo de los métodos de procesamiento de imágenes es identificar todos los parámetros de adquisición para invertir el proceso de imagen del microscopio y recuperar la estructura 3D del espécimen biológico en estudio. Estos parámetros son la ganancia de la cámara, el movimiento inducido por el haz, las aberraciones del microscopio (principalmente el desenfoque), la orientación angular 3D y la traslación de cada partícula, y el estado conformacional en caso de tener un ejemplar con cambios conformacionales. Sin embargo, el número de parámetros es muy alto y la crio-EM requiere el uso de imágenes de dosis bajas para evitar el daño por radiación, lo que reduce significativamente la relación señal-ruido (SNR) de las imágenes adquiridas. Por lo tanto, el problema no se puede resolver inequívocamente y todos los parámetros a calcular solo pueden ser estimaciones. A lo largo del flujo de trabajo de procesamiento de imágenes, se deben identificar los parámetros correctos, descartando los restantes para finalmente obtener una reconstrucción 3D de alta resolución.
Los datos generados por el microscopio se recogen en marcos. Simplificando, un marco contiene el número de electrones que han llegado a una posición particular (píxel) en la imagen, siempre que se utilicen detectores de conteo de electrones. En un campo de visión particular, se recopilan varios fotogramas y esto se llama película. Como se utilizan dosis bajas de electrones para evitar daños por radiación que podrían destruir la muestra, el SNR es muy bajo y los fotogramas correspondientes a la misma película deben promediarse para obtener una imagen que revele información estructural sobre la muestra. Sin embargo, no solo se aplica un promedio simple, la muestra puede sufrir cambios y otros tipos de movimientos durante el tiempo de imagen debido al movimiento inducido por el haz que deben compensarse. Los fotogramas compensados por desplazamiento y promediados originan una micrografía.
Una vez obtenidas las micrografías, necesitamos estimar las aberraciones introducidas por el microscopio para cada una de ellas, llamada Función de Transferencia de Contraste (CTF), que representa los cambios en el contraste de la micrografía en función de la frecuencia. Luego, las partículas se pueden seleccionar y extraer, lo que se denomina recolección de partículas. Cada partícula debe ser una pequeña imagen que contenga solo una copia de la muestra en estudio. Hay tres familias de algoritmos para la selección de partículas: 1) los que solo utilizan cierta parametrización básica de la apariencia de la partícula para encontrarlos en todo el conjunto de micrografías (por ejemplo, el tamaño de partícula), 2) los que aprenden cómo se ven las partículas del usuario o un conjunto preentrenado, y 3) los que usan plantillas de imágenes. Cada familia tiene diferentes propiedades que se mostrarán más adelante.
El conjunto extraído de partículas que se encuentran en las micrografías se utilizará en un proceso de clasificación 2D que tiene dos objetivos: 1) limpiar el conjunto de partículas descartando el subconjunto que contiene imágenes de ruido puro, partículas superpuestas u otros artefactos, y 2) las partículas promediadas que representan cada clase podrían usarse como información inicial para calcular un volumen inicial 3D. 
El cálculo del volumen inicial en 3D es el siguiente paso crucial. El problema de obtener la estructura 3D puede verse como un problema de optimización en un panorama de soluciones multidimensionales, donde el mínimo global es el mejor volumen 3D que representa la estructura original, pero se pueden encontrar varios mínimos locales que representan soluciones subóptimas, y donde es muy fácil quedar atrapado. El volumen inicial representa el punto de partida para el proceso de búsqueda, por lo que una mala estimación del volumen inicial podría impedirnos encontrar el mínimo global. A partir del volumen inicial, un paso de clasificación 3D ayudará a descubrir diferentes estados conformacionales y a limpiar nuevamente el conjunto de partículas; el objetivo es obtener una población estructuralmente homogénea de partículas. Después de eso, un paso de refinamiento 3D se encargará de refinar los parámetros angulares y de traslación para cada partícula para obtener el mejor volumen 3D posible. 
Finalmente, en los últimos pasos, la reconstrucción 3D obtenida se puede afilar y pulir. El afilado es un proceso de aumento de las altas frecuencias del volumen reconstruido, y el pulido es un paso para refinar aún más algunos parámetros, como CTF o compensación de movimiento inducida por haz, a nivel de partículas. Además, se podrían utilizar algunos procedimientos de validación para comprender mejor la resolución lograda al final del flujo de trabajo. 
Después de todos estos pasos, los procesos de trazado y acoplamiento7 ayudarán a dar un significado biológico a la reconstrucción 3D obtenida, mediante la construcción de modelos atómicos de novo o el ajuste de modelos existentes. Si se logra una alta resolución, estos procesos nos dirán las posiciones de las estructuras biológicas, incluso de los diferentes átomos, en nuestra estructura.
Scipion8 permite crear todo el flujo de trabajo combinando los paquetes de procesamiento de imágenes más relevantes de forma integradora. Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, Eman12, Spider13, Cryolo14, Ctffind15, CCP416, Phenix17 y muchos más paquetes se pueden incluir en Scipion. Además, incorpora todas las herramientas necesarias para beneficiar la integración, interoperabilidad, trazabilidad y reproducibilidad para realizar un seguimiento completo de todo el flujo de trabajo de procesamiento de imágenes8.
Una de las herramientas más poderosas que Scipion nos permite utilizar es el consenso, que significa comparar los resultados obtenidos con varios métodos en un paso del procesamiento, haciendo una combinación de la información transmitida por diferentes métodos para generar una salida más precisa. Esto podría ayudar a aumentar el rendimiento y mejorar la calidad alcanzada en los parámetros estimados. Tenga en cuenta que se puede crear un flujo de trabajo más simple sin el uso de métodos de consenso; sin embargo, hemos visto el poder de esta herramienta22,25 y el flujo de trabajo presentado en este manuscrito la utilizará en varios pasos.
Todos los pasos que se han resumido en los párrafos anteriores se explicarán en detalle en la siguiente sección y se combinarán en un flujo de trabajo completo utilizando Scipion. Asimismo, se mostrará cómo utilizar las herramientas de consenso para lograr un mayor acuerdo en los outputs generados. Con ese fin, se ha elegido el conjunto de datos de ejemplo del ribosoma Plasmodium falciparum 80S (entrada EMPIAR: 10028, entrada EMDB: 2660). El conjunto de datos está formado por 600 películas de 16 fotogramas de tamaño 4096x4096 píxeles a un tamaño de píxel de 1.34Å tomadas en una FEI POLARA 300 con una cámara FEI FALCON II, con una resolución reportada en EMDB es 3.2Å18.

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cryo-em and single-particle analysis with scipion

La microscopía crioelectrónica se ha convertido en una de las herramientas más importantes en la investigación biológica para revelar la información estructural de las macromoléculas a una resolución casi atómica. En el análisis de una sola partícula, la muestra vitrificada es fotografiada por un haz de electrones y los detectores al final de la columna del microscopio producen películas de esa muestra. Estas películas contienen miles de imágenes de partículas idénticas en orientaciones aleatorias. Los datos deben pasar por un flujo de trabajo de procesamiento de imágenes con múltiples pasos para obtener el volumen final reconstruido en 3D. El objetivo del flujo de trabajo de procesamiento de imágenes es identificar los parámetros de adquisición para poder reconstruir el espécimen en estudio. Scipion proporciona todas las herramientas para crear este flujo de trabajo utilizando varios paquetes de procesamiento de imágenes en un marco integrador, lo que también permite la trazabilidad de los resultados. En este artículo se presenta y discute todo el flujo de trabajo de procesamiento de imágenes en Scipion con datos procedentes de un caso de prueba real, dando todos los detalles necesarios para pasar de las películas obtenidas por el microscopio a una reconstrucción 3D final de alta resolución. Además, se discute el poder de usar herramientas de consenso que permiten combinar métodos y confirmar resultados a lo largo de cada paso del flujo de trabajo, mejorando la precisión de los resultados obtenidos.

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Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

El análisis de partículas individuales en microscopía crioelectrónica es una de las principales técnicas utilizadas para determinar la estructura de conjuntos biológicos a alta resolución. Scipion proporciona las herramientas para crear toda la tubería para procesar la información adquirida por el microscopio y lograr una reconstrucción en 3D del espécimen biológico.

Análisis crio-EM y de partículas individuales con Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Scipion proporciona las herramientas para crear todo el flujo de trabajo de procesamiento de una manera integradora para un análisis de una sola partícula en crio-EM para lograr una reconstrucción de alta resolución de la muestra biológica. Este marco permite crear el flujo de trabajo de procesamiento utilizando varios paquetes de procesamiento de imágenes, favoreciendo la interoperabilidad, la trazabilidad, la reproducibilidad y la combinación de información transmitida por diferentes métodos para generar una salida más precisa. Scipion está en constante crecimiento, incluyendo nuevos métodos y paquetes.Además, se ha extendido a la crioelectrónica y al modelado atómico, lo que permite también crear flujos de trabajo para procesar estos datos. Para crear un proyecto en Scipion, haga clic en Crear proyecto para crear el proyecto. Para importar las películas del microscopio, seleccione Importar películas.Aparecerá una nueva ventana. En esta ventana, ingrese la ruta a los datos y establezca el voltaje del microscopio en 300 kilovoltios, la aberración esférica en dos milímetros, el contraste de amplitud en 0.1, la tasa de aumento en 50, 000, el modo de frecuencia de muestreo en Desde imagen y el tamaño de píxel en 1.34 angstroms. Cuando se hayan establecido todos los parámetros, haga clic en Ejecutar.Cuando finalice el método, abra la ficha Resumen, haga clic en Analizar resultados. Aparecerá una nueva ventana con una lista de las salidas generadas por el método. Para ejecutar el método de flujo óptico para la alineación de películas, abra el método de alineación óptica xmipp3 y seleccione las películas importadas como películas de entrada y establezca el rango de fotogramas en ALIGN de 2 a 13.En Parámetros adicionales, establezca la opción Usar alineación de película anterior a FOTOGRAMAS SUMAR en No.Deje todas las demás opciones establecidas en sus valores predeterminados y ejecute el programa. Haga clic en Analizar resultados para comprobar las micrografías obtenidas y la trayectoria de los desplazamientos estimados. Para cada micrografía, es posible verificar la densidad espectral de potencia, las trayectorias obtenidas para alinear la película tanto en las coordenadas cartesianas como polares, y el nombre de archivo de la micrografía obtenida.Observe que las partículas de la muestra son mucho más visibles en la micrografía en comparación con un solo fotograma de la película. Para la selección de partículas, abra el método de selección manual xmipp3 y seleccione las micrografías obtenidas previamente como micrografías de entrada. Haga clic en Ejecutar.Aparecerá una nueva ventana interactiva. En esta ventana, cambie el tamaño de píxel a 150. La micrografía seleccionada aparecerá en una ventana más grande.Elija todas las partículas visibles dentro de una región. Cuando todas las partículas se hayan seleccionado manualmente, haga clic en Activar entrenamiento para iniciar el aprendizaje. Las regiones restantes de la micrografía se seleccionarán automáticamente.Compruebe las partículas recogidas. Para incluir una partícula adicional, haga clic en una partícula de interés. Para eliminar cualquier partícula incorrecta, mantenga presionada la tecla Mayús y haga clic en las partículas según sea necesario.Cuando todas las partículas se hayan seleccionado automáticamente, seleccione las siguientes cuatro micrografías una a la vez para crear un conjunto de entrenamiento representativo. Las partículas en cada micrografía seleccionada se seleccionarán automáticamente, verificando cada micrografía para incluir o eliminar partículas según sea necesario. Cuando se haya adquirido un conjunto de entrenamiento, haga clic en Coordenadas para guardar las coordenadas de todas las partículas seleccionadas.Después de adquirir el conjunto de entrenamiento, abra xmipp3 auto-picking para indicar la selección manual anterior en Xmipp particle picking run y configure Micrographs para que elija en Igual que supervisado. Haga clic en Ejecutar para generar un conjunto de alrededor de 100.000 coordenadas. Para aplicar el enfoque de consenso, abra la selección criológica de esfín y establezca las micrografías preprocesadas como las micrografías de entrada en el modelo de selección en el valor predeterminado.Establezca el umbral de confianza en 0,3 y el tamaño del cuadro en 150 y, a continuación, haga clic en Ejecutar. El método también debe generar alrededor de 100, 000 coordenadas. A continuación, abra la selección de consenso profundo de xmipp3 y establezca las coordenadas de entrada para incluir la salida del criolo de esfín y la selección automática de xmipp3, el tipo de modelo Seleccionar para preentrenado y el entrenamiento de salto y puntuación directamente con el modelo preentrenado en Sí, luego haga clic en Ejecutar.Al final de la ejecución, haga clic en Analizar resultados. En la nueva ventana, haga clic en el icono del ojo. Se abrirá una segunda ventana nueva con una lista de todas las partículas.Los valores de la puntuación Z en la columna darán una idea de la calidad de cada partícula, ya que un valor bajo es indicativo de una mala calidad. Para ordenar las partículas de la puntuación Z más alta a la más baja, haga clic en Xmipp Z-score deep learning y seleccione las partículas con una puntuación Z superior a 0,75. A continuación, haga clic en Coordenadas para crear un nuevo subconjunto con aproximadamente 50.000 coordenadas.Para calcular la resolución localmente, abra xmipp3 local MonoRes y establezca el volumen de entrada en la salida del último paso de refinamiento, el ¿Desea usar la mitad de volúmenes a Sí, y el Rango de resolución de 1 a 10 angstroms? Cuando se hayan establecido los parámetros, haga clic en Ejecutar. Cuando se haya calculado la resolución, haga clic en Analizar resultados y seleccione Mostrar histograma de resolución y Mostrar sectores de color.Se mostrará la resolución en las diferentes partes del volumen. La mayoría de los vóxeles de las partes centrales de las estructuras deben representar resoluciones alrededor de tres angstroms, mientras que las peores resoluciones se observarán en las regiones exteriores de las estructuras. También se mostrará un histograma de las resoluciones por vóxel con un pico alrededor o por debajo de tres angstroms.Para aplicar un enfoque, abra el afilado xmipp3 localdeblur y seleccione la salida del último paso de refinamiento como Mapa de entrada, y establezca el mapa de resolución en el mapa MonoRes de obtención. Una vez ejecutado el comando, haga doble clic en el conjunto de volúmenes generados como salida en la pestaña Resumen. Se pueden comprobar los volúmenes generados en cada iteración.También se recomienda abrir el volumen con otras herramientas, como UCSF Chimera, para observar mejor las características del volumen en 3D. En esta figura, se puede observar una correlación de concha de Fourier de tres angstroms, que está muy cerca del límite de Nyquist. Como se ilustra, las rebanadas de volumen 3D reconstruidas exhiben un alto nivel de detalle y estructuras bien definidas.Después del análisis local, la mayoría de los vóxeles centrales logran una resolución inferior a tres angstroms. Sin embargo, las regiones exteriores de las rebanadas de resolución local demuestran una resolución más baja, lo que es consistente con la difuminación observada dentro de esas áreas. Después del post-procesamiento, se pueden observar las frecuencias más altas del volumen del mapa 3D, revelando más detalles y mejorando la representación.Cuando la resolución alcanzada es lo suficientemente alta, incluso algunas de las partes bioquímicas de la estructura se pueden observar. Si la estructura obtenida tiene una resolución baja, y no es capaz de evolucionar hacia una mejor, se puede observar un volumen borroso con una baja correlación de capa de Fourier, curva de resolución e histograma de la estimación local. Después de la recolección, se puede verificar la clasificación 2D para evaluar la calidad de la partícula.Por ejemplo, en esta clasificación, las partículas son ruidosas, descentradas o acopladas, lo que indica que la recolección fue incorrecta. Se puede realizar otro punto de control durante la estimación inicial del volumen. En este ejemplo, se creó una estimación incorrecta mediante una configuración incorrecta para el método.Una vez que se produce un mapa 3D con una resolución suficiente, el siguiente paso es proponer un modelo atómico para el mapa. Esto se puede hacer dentro de Scipion utilizando los complementos de modelado. Esta técnica se puede utilizar para reconstruir con éxito macromoléculas biológicas para la evaluación de sus interacciones moleculares y la función del conjunto biológico como base para el diseño de fármacos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Análisis de una sola partícula de alta resolución a partir de imágenes de crosmicroscopía electrónica usando SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Investigación

Bioquímica

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Análisis de especificidad de anticuerpos histona con microarrays peptídicos

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Microscopía crioelectrónica de partícula única: de la muestra a la estructura

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Congelación manual de muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Preparación de rejillas de muestra de alta temperatura para crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Un robusto flujo de trabajo de procesamiento de criomicroscopía electrónica de una sola partícula (cryo-EM) con cryoSPARC, RELION y Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Recopilación rutinaria de conjuntos de datos crio-EM de alta resolución utilizando un microscopio electrónico de transmisión de 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

La técnica Peel-Blot: Un método de preparación de muestras crio-EM para separar capas individuales de muestras biológicas de múltiples capas o concentradas

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...