Name: cryo-em and single-particle analysis with scipion
Uploaded: 2021-05-29T13:00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

Författarna vill erkänna ekonomiskt stöd från: Det spanska ministeriet för vetenskap och innovation genom bidrag: PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033, "Comunidad Autónoma de Madrid" genom bidrag: S2017/BMD-3817, Instituto de Salud Carlos III, PT17/0009/0010 (ISCIII-SGEFI/ERUF), Europeiska unionen (EU) och Horisont 2020 genom bidrag: INSTRUCT - ULTRA (INFRADEV-03-2016-2017, förslag: 731005), EOSC Life 824087), iNEXT - Discovery (Förslag: 871037) och HighResCells (ERC - 2018 - SyG, Förslag: 810057). Projektet som gav upphov till dessa resultat fick stöd av ett stipendium från "la Caixa" Foundation (ID 100010434). Stipendiekoden är LCF/BQ/DI18/11660021. Detta projekt har fått finansiering från EUROPEISKA unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie-stipendieavtalet nr 713673. Författarna erkänner stödet och användningen av resurser i Instruct, ett Landmärke ESFRI-projekt.

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Resolution+Revolution.">The Resolution Revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>. 1.15 A structure of human apoferritin obtained from Titan Mono- BCOR microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/7A6A">https://www.rcsb.org/structure/7A6A</a> (2021)</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturizing+EM+Sample+Preparation:+Opportunities,+Challenges,+and+"Visual+Proteomics".">Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics".</a> PROTEOMICS. 18 (5-6), 1700176 (2018).</li><li>Faruqi, A. R., McMullan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+detectors+for+electron+microscopy.">Direct imaging detectors for electron microscopy.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 878, 180-190 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+image+processing+for+single-particle+analysis+by+electron+cryomicroscopy+and+challenges+ahead.">Advances in image processing for single-particle analysis by electron cryomicroscopy and challenges ahead.</a> Current Opinion in Structural Biology. 52, 127-145 (2018).</li><li>Martinez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Cryo-EM+Model+Building+Software+in+Scipion.">Integration of Cryo-EM Model Building Software in Scipion.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 60, 2533-2540 (2020).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195, 93-99 (2016).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xmipp+3.0:+an+improved+software+suite+for+image+processing+in+electron+microscopy.">Xmipp 3.0: an improved software suite for image processing in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 184, 321-328 (2013).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. The Resolution Revolution: Recent Advances In cryoEM. , 125-157 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14, 290-296 (2017).</li><li>Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+structures+of+macromolecules+using+single-particle+analysis+in+EMAN.">3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN.</a> Methods in Molecular Biology. 673, 157-173 (2010).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3, 1941-1974 (2008).</li><li>Wagner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPHIRE-crYOLO+is+a+fast+and+accurate+fully+automated+particle+picker+for+cryo-EM.">SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM.</a> Communications Biology. 2, (2019).</li><li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy.">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 142, 334-347 (2003).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 67, 235-242 (2011).</li><li>Liebschner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+structure+determination+using+X-rays,+neutrons+and+electrons:+recent+developments+in+Phenix.">Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix.</a> Acta Crystallographica Section D. 75, 861-887 (2019).</li><li>Wong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+Plasmodium+falciparum+80S+ribosome+bound+to+the+anti-protozoan+drug+emetine.">Cryo-EM structure of the Plasmodium falciparum 80S ribosome bound to the anti-protozoan drug emetine.</a> eLife. 3, 03080 (2014).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+direct+detection+device+micrographs+using+a+robust+Optical+Flow+approach.">Alignment of direct detection device micrographs using a robust Optical Flow approach.</a> Journal of Structural Biology. 189, 163-176 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., Jonic, S., Nunez Ramirez, R., Boisset, N., Carazo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+robust+and+accurate+determination+of+transmission+electron+microscopy+contrast+transfer+function.">Fast, robust and accurate determination of transmission electron microscopy contrast transfer function.</a> Journal of Structural Biology. 160, 249-262 (2007).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pattern+matching+approach+to+the+automatic+selection+of+particles+from+low-contrast+electron+micrographs.">A pattern matching approach to the automatic selection of particles from low-contrast electron micrographs.</a> Bioinformatics. 29, 2460-2468 (2013).</li><li>Sanchez-Garcia, R., Segura, J., Maluenda, D., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Consensus,+a+deep+learning-based+approach+for+particle+pruning+in+cryo-electron+microscopy.">Deep Consensus, a deep learning-based approach for particle pruning in cryo-electron microscopy.</a> IUCrJ. 5, 854-865 (2018).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171, 197-206 (2010).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+approach+to+the+initial+volume+problem+in+Single+Particle+Analysis+by+Electron+Microscopy.">A statistical approach to the initial volume problem in Single Particle Analysis by Electron Microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 189, 213-219 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarm+optimization+as+a+consensus+technique+for+Electron+Microscopy+Initial+Volume.">Swarm optimization as a consensus technique for Electron Microscopy Initial Volume.</a> Applied Analysis and Optimization. 2, 299-313 (2018).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204, 329-337 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+Accurate+Estimation+of+Local+Resolution+for+Electron+Microscopy+Maps.">MonoRes: Automatic and Accurate Estimation of Local Resolution for Electron Microscopy Maps.</a> Structure. 26, 337-344 (2018).</li><li>Ramirez-Aportela, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+local+resolution-based+sharpening+of+cryo-EM+maps.">Automatic local resolution-based sharpening of cryo-EM maps.</a> Bioinformatics. 36, 765-772 (2020).</li><li>Heymann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+3D+EM+Reconstructions:+The+Phantom+in+the+Noise.">Validation of 3D EM Reconstructions: The Phantom in the Noise.</a> AIMS Biophys. 2, 21-35 (2015).</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+An+integrated,+database-drive+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: An integrated, database-drive pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166, 95-102 (2009).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151, 41-60 (2005).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

För närvarande är cryo-EM ett viktigt verktyg för att avslöja 3D-strukturen hos biologiska prover. När bra data samlas in med mikroskopet kommer de tillgängliga bearbetningsverktygen att göra det möjligt för oss att få en 3D-rekonstruktion av makromolekylen som studeras. Cryo-EM databehandling kan uppnå nära atomisk upplösning, vilket är nyckeln till att förstå det funktionella beteendet hos en makromolekyl och är också avgörande för läkemedelsupptäckt.
Scipion är en programvara som gör det möjligt att skapa hela arbetsflödet som kombinerar de mest relevanta bildbehandlingspaketen på ett integrerande sätt, vilket hjälper spårbarheten och reproducerbarheten för hela bildbehandlingsarbetsflödet. Scipion ger en mycket komplett uppsättning verktyg för att utföra behandlingen; Att få högupplösta rekonstruktioner beror dock helt på kvaliteten på de förvärvade uppgifterna och hur dessa uppgifter behandlas. 
För att få en högupplöst 3D-rekonstruktion är det första kravet att få bra filmer från mikroskopet, som bevarar strukturell information till hög upplösning. Om så inte är fallet kommer arbetsflödet inte att kunna extrahera högupplöst information från data. Sedan bör ett framgångsrikt bearbetningsarbetsflöde kunna extrahera partiklar som verkligen motsvarar strukturen och hitta orienteringarna för dessa partiklar i 3D-utrymmet. Om något av stegen i arbetsflödet misslyckas försämras kvaliteten på den rekonstruerade volymen. Scipion gör det möjligt att använda olika paket i något av bearbetningsstegen, vilket hjälper till att hitta det lämpligaste tillvägagångssättet för att bearbeta data. Tack vare att det finns många paket tillgängliga kan dessutom konsensusverktyg som ökar noggrannheten genom att nå en överenskommelse om de uppskattade resultaten av olika metoder användas. Det har också diskuterats i detalj i avsnittet Representativa resultat flera valideringsverktyg och hur man identifierar korrekta och felaktiga resultat i varje steg i arbetsflödet, för att upptäcka potentiella problem och hur man försöker lösa dem. Det finns flera kontroll punkter längs protokollet som kan hjälpa till att inse om protokollet körs korrekt eller inte. Några av de mest relevanta är: plockning, 2D-klassificering, inledande volymuppskattning och 3D-justering. Att kontrollera indata, upprepa steget med en annan metod eller använda konsensus är alternativ som är tillgängliga i Scipion som användaren kan använda för att hitta lösningar när problem uppstår. 
När det gäller tidigare metoder för paketintegration inom Cryo-EM-området är Appion31 den enda som möjliggör verklig integration av olika programvarupaket. Appion är dock tätt förknippat med Leginon32, ett system för automatiserad insamling av bilder från elektronmikroskop. Den största skillnaden med Scipion är att datamodellen och lagringen är mindre kopplade. På ett sådant sätt, för att skapa ett nytt protokoll i Scipion, behöver endast ett Python-skript utvecklas. Men i Appion måste utvecklaren skriva skriptet och ändra den underliggande databasen. Sammanfattningsvis utvecklades Scipion för att förenkla underhåll och utökningsbarhet.
Vi har i detta manuskript presenterat ett komplett arbetsflöde för Cryo-EM-bearbetning, med hjälp av den verkliga falldatauppsättningen för Plasmodium falciparum 80S Ribosome (EMPIAR-post: 10028, EMDB-post: 2660). Stegen som behandlas och diskuteras här kan sammanfattas som filmjustering, CTF-uppskattning, partikelplockning, 2D-klassificering, inledande kartuppskattning, 3D-klassificering, 3D-förfining, utvärdering och efterbehandling. Olika paket har använts och konsensusverktyg har tillämpats i flera av dessa steg. Den slutliga 3D-rekonstruerade volymen uppnådde en upplösning på 3 Å och i den efterbehandlade volymen kan vissa sekundära strukturer särskiljas, som alfa-spiraler, vilket hjälper till att beskriva hur atomer är ordnade i rymden.
Arbetsflödet som presenteras i detta manuskript visar hur Scipion kan användas för att kombinera olika Cryo-EM-paket på ett enkelt och integrerande sätt för att förenkla behandlingen och samtidigt få ett mer tillförlitligt resultat.
I framtiden kommer utvecklingen av nya metoder och paket att fortsätta växa och programvara som Scipion för att enkelt integrera dem alla kommer att bli ännu viktigare för forskarna. Konsensusstrategier kommer att vara mer relevanta även då, när det kommer att finnas gott om metoder med olika grund, vilket bidrar till att få mer exakta uppskattningar av alla parametrar som ingår i återuppbyggnadsprocessen i Cryo-EM. Spårning och reproducerbarhet är nyckeln i forskningsprocessen och lättare att uppnå med Scipion tack vare att ha ett gemensamt ramverk för utförande av kompletta arbetsflöden.

I kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) är enstaka partikelanalys (SPA) av vitrifierade frysta hydratiserade exemplar en av de mest använda och framgångsrika varianterna av avbildning för biologiska makromolekyler, eftersom det gör det möjligt att förstå molekylära interaktioner och funktionen hos biologiska ensembler1. Detta är tack vare de senaste framstegen inom denna bildteknik som gav upphov till "upplösningsrevolutionen"2 och har möjliggjort framgångsrik bestämning av biologiska 3D-strukturer med nära atomupplösning. För närvarande var den högsta upplösningen i SPA cryo-EM 1,15 Å för apoferritin3 (EMDB-post: 11668). Dessa tekniska framsteg omfattar förbättringar i provberedningen4, bildförvärvet5 och bildbehandlingsmetoderna6. Den här artikeln fokuserar på den sista punkten.
Kortfattat är målet med bildbehandlingsmetoderna att identifiera alla förvärvsparametrar för att invertera mikroskopets avbildningsprocess och återställa 3D-strukturen hos det biologiska exemplaret som studeras. Dessa parametrar är kamerans vinst, den strålinducerade rörelsen, mikroskopets avvikelser (främst defokuseringen), 3D-vinkelorienteringen och översättningen av varje partikel och konformationstillståndet vid ett prov med konformationella förändringar. Antalet parametrar är dock mycket högt och cryo-EM kräver att man använder lågdosbilder för att undvika strålningsskador, vilket avsevärt minskar signal-till-brusförhållandet (SNR) för de förvärvade bilderna. Problemet kan således inte lösas entydigt och alla parametrar som endast ska beräknas kan uppskattas. Längs arbetsflödet för bild bearbetning bör rätt parametrar identifieras och ignorera de återstående för att slutligen få en högupplöst 3D-rekonstruktion.
De data som genereras av mikroskopet samlas in i ramar. Förenkla, en ram innehåller antalet elektroner som har kommit till en viss position (pixel) i bilden, när elektronräkningsdetektorer används. I ett visst synfält samlas flera bildrutor in och detta kallas en film. Eftersom låga elektrondoser används för att undvika strålningsskador som kan förstöra provet är SNR mycket låg och ramarna som motsvarar samma film måste vara genomsnittliga för att få en bild som avslöjar strukturell information om provet. Men inte bara ett enkelt medelvärde tillämpas, provet kan drabbas av skift och andra typer av rörelser under avbildningstiden på grund av den strålinducerade rörelsen som behöver kompenseras. De skiftkompenserade och genomsnittliga bildrutorna har en mikrograf.
När mikrograferna har erhållits måste vi uppskatta de avvikelser som mikroskopet introducerar för var och en av dem, kallad Kontrastöverföringsfunktion (CTF), som representerar förändringarna i kontrasten av mikrografen som en funktion av frekvens. Sedan kan partiklarna väljas och extraheras, vilket kallas partikelplockning. Varje partikel bör vara en liten bild som endast innehåller en kopia av det prov som studeras. Det finns tre familjer av algoritmer för partikelplockning: 1) de som bara använder någon grundläggande parameterisering av partikelns utseende för att hitta dem i hela uppsättningen mikrografer (t.ex. partikelstorlek), 2) de som lär sig hur partiklarna ser ut från användaren eller en förtränad uppsättning, och 3) de som använder bildmallar. Varje familj har olika egenskaper som kommer att visas senare.
Den extraherade uppsättningen partiklar som finns i mikrograferna kommer att användas i en 2D-klassificeringsprocess som har två mål: 1) rengöring av uppsättningen partiklar genom att kassera delmängden som innehåller rena brusbilder, överlappande partiklar eller andra artefakter, och 2) de genomsnittliga partiklarna som representerar varje klass kan användas som initial information för att beräkna en 3D-initial volym. 
Den inledande 3D-volymberäkningen är nästa avgörande steg. Problemet med att få 3D-strukturen kan ses som ett optimeringsproblem i ett flerdimensionellt lösningslandskap, där det globala minimumet är den bästa 3D-volymen som representerar den ursprungliga strukturen, men flera lokala minima som representerar suboptimala lösningar kan hittas och där det är mycket lätt att fastna. Den ursprungliga volymen representerar utgångspunkten för sökprocessen, så dålig initial volymuppskattning kan hindra oss från att hitta det globala minimivärdet. Från den ursprungliga volymen hjälper ett 3D-klassificeringssteg till att upptäcka olika konformationstillstånd och rengöra igen uppsättningen partiklar; målet är att få en strukturellt homogen population av partiklar. Därefter kommer ett 3D-förfiningssteg att ansvara för att förfina vinkel- och översättningsparametrarna för varje partikel för att få bästa möjliga 3D-volym. 
Slutligen, i de sista stegen, kan den erhållna 3D-rekonstruktionen slipas och poleras. Slipning är en process för att öka de höga frekvenserna av den rekonstruerade volymen, och poleringen är ett steg för att ytterligare förfina vissa parametrar, som CTF eller strålinducerad rörelsekompensation, på partikelnivå. Vissa valideringsprocedurer kan också användas för att bättre förstå den uppnådda lösningen i slutet av arbetsflödet. 
Efter alla dessa steg kommer spårnings- och dockningsprocesserna7 att bidra till att ge en biologisk mening till den erhållna 3D-rekonstruktionen, genom att bygga atommodeller de novo eller montera befintliga modeller. Om hög upplösning uppnås kommer dessa processer att berätta för oss positionerna för de biologiska strukturerna, även för de olika atomerna, i vår struktur.
Scipion8 gör det möjligt att skapa hela arbetsflödet som kombinerar de mest relevanta bildbehandlingspaketen på ett integrerande sätt. Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, Eman12, Spider13, Cryolo14, Ctffind15, CCP416, Phenix17 och många fler paket kan inkluderas i Scipion. Dessutom innehåller det alla nödvändiga verktyg för att gynna integrationen, interoperabiliteten, spårbarheten och reproducerbarheten för att göra en fullständig spårning av hela bildbehandlingsarbetsflödet8.
Ett av de mest kraftfulla verktygen som Scipion tillåter oss att använda är konsensus, vilket innebär att jämföra resultaten som erhållits med flera metoder i ett steg av bearbetningen, vilket gör en kombination av den information som förmedlas av olika metoder för att generera en mer exakt utgång. Detta kan bidra till att öka prestandan och förbättra den uppnådda kvaliteten i de uppskattade parametrarna. Observera att ett enklare arbetsflöde kan byggas utan att använda konsensusmetoder. Vi har dock sett kraften i detta verktyg22,25 och arbetsflödet som presenteras i detta manuskript kommer att använda det i flera steg.
Alla steg som har sammanfattats i föregående stycken kommer att förklaras i detalj i följande avsnitt och kombineras i ett komplett arbetsflöde med hjälp av Scipion. Dessutom kommer hur man använder konsensusverktygen för att uppnå en högre överenskommelse om de genererade utgångarna att visas. I detta syfte har exempeldatauppsättningen för Plasmodium falciparum 80S Ribosome valts (EMPIAR-post: 10028, EMDB-post: 2660). Datasetet består av 600 filmer med 16 bildrutor i storlek 4096x4096 pixlar med en pixelstorlek på 1,34Å tagna vid en FEI POLARA 300 med en FEI FALCON II-kamera, med en rapporterad upplösning på EMDB är 3,2Å18 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>no material is used in this article</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-em and single-particle analysis with scipion

Kryoelektronmikroskopi har blivit ett av de viktigaste verktygen inom biologisk forskning för att avslöja den strukturella informationen om makromolekyler vid nära atomisk upplösning. I en partikelanalys avbildas det för vitrifierade provet av en elektronstråle och detektorerna i slutet av mikroskopkolonnen producerar filmer av det provet. Dessa filmer innehåller tusentals bilder av identiska partiklar i slumpmässiga orienteringar. Data måste gå igenom ett arbetsflöde för bild bearbetning med flera steg för att få den slutliga 3D-rekonstruerade volymen. Målet med bildbehandlingsarbetsflödet är att identifiera förvärvsparametrarna för att kunna rekonstruera det prov som studeras. Scipion tillhandahåller alla verktyg för att skapa det här arbetsflödet med flera bildbehandlingspaket i ett integrerande ramverk, vilket också möjliggör spårbarhet av resultaten. I den här artikeln presenteras hela bildbehandlingsarbetsflödet i Scipion och diskuteras med data som kommer från ett riktigt testfall, vilket ger alla detaljer som behövs för att gå från filmerna som erhålls av mikroskopet till en högupplöst slutlig 3D-rekonstruktion. Dessutom diskuteras kraften i att använda konsensusverktyg som gör det möjligt att kombinera metoder och bekräfta resultat längs varje steg i arbetsflödet, förbättra noggrannheten i de erhållna resultaten.

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Enpartikelanalys i kryoelektronmikroskopi är en av de viktigaste teknikerna som används för att bestämma strukturen hos biologiska ensembler med hög upplösning. Scipion ger verktygen för att skapa hela rörledningen för att bearbeta den information som erhållits av mikroskopet och uppnå en 3D-rekonstruktion av det biologiska provet.

Cryo-EM och enpartikelanalys med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Scipion tillhandahåller verktygen för att skapa hela bearbetningsarbetsflödet på ett integrerande sätt för en enda partikelanalys i kryo-EM för att uppnå en högupplöst rekonstruktion av det biologiska provet. Det här ramverket gör det möjligt att skapa bearbetningsarbetsflödet med flera bild bearbetningspaket, vilket gynnar interoperabilitet, spårbarhet, reproducerbarhet och kombinationen av information som förmedlas av olika metoder för att generera en mer exakt utdata. Scipion växer ständigt, inklusive nya metoder och paket.Dessutom har det utvidgats till kryoelektrontomografi och atommodellering, vilket också gör det möjligt att skapa arbetsflöden för att bearbeta dessa data. Om du vill skapa ett projekt i Scipion klickar du på Skapa projekt för att skapa projektet. Om du vill importera mikroskopfilmerna väljer du Importera filmer.Ett nytt fönster visas. I det här fönstret anger du sökvägen till data och ställer in mikroskopspänningen till 300 kilovolt, den sfäriska avvikelsen till två millimeter, amplitudkontrasten till 0,1, Förstoringshastigheten till 50 000, samplingshastighetsläget till Från bild och Pixelstorleken till 1,34 angstroms. När alla parametrar har angetts klickar du på Kör.När metoden är klar öppnar du fliken Sammanfattning och klickar på Analysera resultat. Ett nytt fönster visas med en lista över de utdata som genereras av metoden. Om du vill köra den optiska flödesmetoden för filmjustering öppnar du den optiska justeringsmetoden xmipp3 och väljer de importerade filmerna som indatafilmer och ställer in intervallet Bildrutor till JUSTERA från 2 till 13.Under Ytterligare parametrar anger du Använd föregående filmjustering till ALTERNATIVET SUMMA-bildrutor till Nej. Klicka på Analysera resultat om du vill kontrollera erhållna mikrografer och banan för de uppskattade skiften. För varje mikrograf är det möjligt att kontrollera effektspektraldensiteten, de banor som erhålls för att justera filmen i både kartesiska och polära koordinater och filnamnet på den erhållna mikrografen.Observera att partiklarna i provet är mycket mer synliga i mikrografen jämfört med en enda bildruta i filmen. För partikelplockning öppnar du den manuella plockningsmetoden xmipp3 och väljer de tidigare erhållna mikrograferna som indatamikrografer. Klicka på Kör.Ett nytt interaktivt fönster visas. I det här fönstret ändrar du pixelstorleken till 150. Den valda mikrografen visas i ett större fönster.Plocka alla synliga partiklar inom en region. När alla partiklar har plockats manuellt klickar du på Aktivera träning för att starta inlärningen. De återstående regionerna i mikrografen plockas automatiskt.Kolla de plockade partiklarna. För att inkludera ytterligare en partikel, klicka på en partikel av intresse. Om du vill ta bort felaktiga partiklar håller du skift och klickar på partiklarna efter behov.När alla partiklar har plockats automatiskt väljer du de följande fyra mikrograferna en i taget för att skapa en representativ träningsuppsättning. Partiklarna i varje vald mikrograf plockas automatiskt och kontrollerar varje mikrograf för att inkludera eller ta bort partiklar vid behov. När en träningsuppsättning har förvärvats klickar du på Koordinater för att spara koordinaterna för alla plockade partiklar.När du har skaffat träningsuppsättningen öppnar du xmipp3 autoplockning för att indikera den tidigare manuella plockningen i Xmipp partikelplockning och ställer in mikrografer att plocka till Samma som övervakas. Klicka på Kör om du vill generera en uppsättning på cirka 100 000 koordinater. Om du vill tillämpa konsensusmetod öppnar du sphire cryolo-plockning och ställer in de förbehandlade mikrograferna som indatamikrografer i plockmodellen till standard.Ställ in konfidenströskeln till 0,3 och rutans storlek till 150 och klicka sedan på Kör. Metoden bör också generera cirka 100 000 koordinater. Öppna sedan xmipp3 djup konsensusplockning och ställ in indatakoordinaterna så att de inkluderar utdata från sphire cryolo och xmipp3 autoplockning, välj modelltyp som ska förtränas och Hoppa över träning och poäng direkt med förtränad modell till Ja och klicka sedan på Kör.I slutet av körningen klickar du på Analysera resultat. Klicka på ögonikonen i det nya fönstret. Ett andra nytt fönster öppnas med en lista över alla partiklar.Z-poängvärdena i kolumnen ger insikt i kvaliteten på varje partikel, eftersom ett lågt värde tyder på en dålig kvalitet. Om du vill beställa partiklarna från den högsta till lägsta Z-poängen klickar du på Xmipp Z-poäng djupinlärning och väljer partiklarna med en Z-poäng högre än 0,75. Klicka sedan på Koordinater om du vill skapa en ny delmängd med cirka 50 000 koordinater.Om du vill beräkna upplösningen lokalt öppnar du xmipp3 lokala MonoRes och ställer in indatavolymen på utdata från det senaste förfiningssteget, vill du använda halva volymer till Ja och upplösningsintervallet från 1 till 10 angstroms. När parametrarna har angetts klickar du på Kör. När upplösningen har beräknats klickar du på Analysera resultat och väljer Visa histogram för upplösning och Visa färgade segment.Upplösningen i de olika delarna av volymen visas. De flesta voxels av de centrala delarna av strukturerna bör representera resolutioner runt tre angstroms, medan de värsta resolutionerna kommer att observeras i de yttre regionerna av strukturerna. Ett histogram av upplösningarna per voxel med en topp runt eller under tre angstroms kommer också att visas.Om du vill använda en skärpning öppnar du xmipp3 localdeblur-skärpan och väljer utdata för det senaste förfiningssteget som Indatakarta och ställer in upplösningskartan på den hämta MonoRes-kartan. När kommandot har utförts dubbelklickar du på den uppsättning volymer som genereras som utdata på fliken Sammanfattning. De volymer som genereras i varje iteration kan kontrolleras.Det rekommenderas också att öppna volymen med andra verktyg, till exempel UCSF Chimera, för att bättre observera volymens egenskaper i 3D. I denna siffra kan en Fourier skalkorrelation på tre angstroms, som ligger mycket nära Nyquist-gränsen, observeras. Som illustrerat uppvisar de rekonstruerade 3D-volymskivorna en hög detaljnivå och väldefinierade strukturer.Efter lokal analys uppnår de flesta av de centrala voxels en upplösning under tre angstroms. De yttre regionerna i de lokala upplösningssegmenten visar dock en lägre upplösning, vilket är förenligt med den suddighet som observerats inom dessa områden. Efter efterbehandling kan de högre frekvenserna av 3D-kartvolymen observeras, vilket avslöjar mer information och förbättrar representationen.När den uppnådda upplösningen är tillräckligt hög kan även några av de biokemiska delarna av strukturen observeras. Om den erhållna strukturen har en låg upplösning och inte kan utvecklas till en bättre, kan en suddig volym med en låg Fourier-skalkorrelation, upplösningskurva och histogram av den lokala uppskattningen observeras. Efter plockning kan 2D-klassificeringen kontrolleras för att utvärdera partikelkvaliteten.I den här klassificeringen är partiklarna till exempel bullriga, ocentrerade eller kopplade, vilket indikerar att plockningen var felaktig. En annan kontrollpunkt kan utföras under den första volymuppskattningen. I det här exemplet skapades en felaktig uppskattning med en felaktig inställning för metoden.När en 3D-karta med tillräcklig upplösning har tagits fram är nästa steg att föreslå en atommodell för kartan. Detta kan göras inom Scipion med hjälp av modelleringsplugins. Denna teknik kan användas för att framgångsrikt rekonstruera biologiska makromolekyler för utvärdering av deras molekylära interaktioner och biologiska ensemble fungerar som grund för läkemedelsdesign.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analys av histonantikroppspecificitet med peptidmikroarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttryck och rening av den mänskliga Lipid-känsliga ering kanal TRPC3 för strukturella bestämning genom Single-particle kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Mikroskopi: Från prov till struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuell Blot-and-Plunge frysning av biologiska exemplar för enpartikel kryogen elektronmikroskopi

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Beredning av högtemperaturprovgaller för kryo-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-blot-tekniken: en kryo-EM-provberedningsmetod för att separera enstaka lager från flerskiktiga eller koncentrerade biologiska prover

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...