Name: cryo-em and single-particle analysis with scipion
Uploaded: 2021-05-29T13:00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

Yazarlar, İspanya Bilim ve Yenilik Bakanlığı'nın Hibe yoluyla ekonomik desteğini kabul etmek istiyor: PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033, Hibe yoluyla "Comunidad Autónoma de Madrid": S2017/BMD-3817, Instituto de Salud Carlos III, PT17/0009/0010 (ISCIII-SGEFI/ERDF), Avrupa Birliği (AB) ve Horizon 2020 hibe yoluyla: INSTRUCT - ULTRA (INFRADEV-03-2016-2017, Teklif: 731005), EOSC Life (INFRAEOSC-04-2018, Teklif: 824087), iNEXT - Discovery (Teklif: 871037) ve HighResCells (ERC - 2018 - SyG, Teklif: 810057). Bu sonuçlara yol açan proje ,"la Caixa" Vakfı'ndan (ID 100010434) burs desteği aldı. Burs kodu LCF/BQ/DI18/11660021'dir. Bu proje, 713673 Numaralı Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon almıştır. Yazarlar, bir Landmark ESFRI projesi olan Instruct'ın desteklerini ve kaynaklarının kullanımını kabul ediyorlar.

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Resolution+Revolution.">The Resolution Revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li><li>. 1.15 A structure of human apoferritin obtained from Titan Mono- BCOR microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/7A6A">https://www.rcsb.org/structure/7A6A</a> (2021)</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturizing+EM+Sample+Preparation:+Opportunities,+Challenges,+and+"Visual+Proteomics".">Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics".</a> PROTEOMICS. 18 (5-6), 1700176 (2018).</li><li>Faruqi, A. R., McMullan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+detectors+for+electron+microscopy.">Direct imaging detectors for electron microscopy.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 878, 180-190 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+image+processing+for+single-particle+analysis+by+electron+cryomicroscopy+and+challenges+ahead.">Advances in image processing for single-particle analysis by electron cryomicroscopy and challenges ahead.</a> Current Opinion in Structural Biology. 52, 127-145 (2018).</li><li>Martinez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Cryo-EM+Model+Building+Software+in+Scipion.">Integration of Cryo-EM Model Building Software in Scipion.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 60, 2533-2540 (2020).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195, 93-99 (2016).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xmipp+3.0:+an+improved+software+suite+for+image+processing+in+electron+microscopy.">Xmipp 3.0: an improved software suite for image processing in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 184, 321-328 (2013).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. The Resolution Revolution: Recent Advances In cryoEM. , 125-157 (2016).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14, 290-296 (2017).</li><li>Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+structures+of+macromolecules+using+single-particle+analysis+in+EMAN.">3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN.</a> Methods in Molecular Biology. 673, 157-173 (2010).</li><li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3, 1941-1974 (2008).</li><li>Wagner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPHIRE-crYOLO+is+a+fast+and+accurate+fully+automated+particle+picker+for+cryo-EM.">SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM.</a> Communications Biology. 2, (2019).</li><li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy.">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 142, 334-347 (2003).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 67, 235-242 (2011).</li><li>Liebschner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+structure+determination+using+X-rays,+neutrons+and+electrons:+recent+developments+in+Phenix.">Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix.</a> Acta Crystallographica Section D. 75, 861-887 (2019).</li><li>Wong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+the+Plasmodium+falciparum+80S+ribosome+bound+to+the+anti-protozoan+drug+emetine.">Cryo-EM structure of the Plasmodium falciparum 80S ribosome bound to the anti-protozoan drug emetine.</a> eLife. 3, 03080 (2014).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+of+direct+detection+device+micrographs+using+a+robust+Optical+Flow+approach.">Alignment of direct detection device micrographs using a robust Optical Flow approach.</a> Journal of Structural Biology. 189, 163-176 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., Jonic, S., Nunez Ramirez, R., Boisset, N., Carazo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+robust+and+accurate+determination+of+transmission+electron+microscopy+contrast+transfer+function.">Fast, robust and accurate determination of transmission electron microscopy contrast transfer function.</a> Journal of Structural Biology. 160, 249-262 (2007).</li><li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pattern+matching+approach+to+the+automatic+selection+of+particles+from+low-contrast+electron+micrographs.">A pattern matching approach to the automatic selection of particles from low-contrast electron micrographs.</a> Bioinformatics. 29, 2460-2468 (2013).</li><li>Sanchez-Garcia, R., Segura, J., Maluenda, D., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Consensus,+a+deep+learning-based+approach+for+particle+pruning+in+cryo-electron+microscopy.">Deep Consensus, a deep learning-based approach for particle pruning in cryo-electron microscopy.</a> IUCrJ. 5, 854-865 (2018).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy.">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171, 197-206 (2010).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+approach+to+the+initial+volume+problem+in+Single+Particle+Analysis+by+Electron+Microscopy.">A statistical approach to the initial volume problem in Single Particle Analysis by Electron Microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 189, 213-219 (2015).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swarm+optimization+as+a+consensus+technique+for+Electron+Microscopy+Initial+Volume.">Swarm optimization as a consensus technique for Electron Microscopy Initial Volume.</a> Applied Analysis and Optimization. 2, 299-313 (2018).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).</li><li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy.">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204, 329-337 (2018).</li><li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MonoRes:+Automatic+and+Accurate+Estimation+of+Local+Resolution+for+Electron+Microscopy+Maps.">MonoRes: Automatic and Accurate Estimation of Local Resolution for Electron Microscopy Maps.</a> Structure. 26, 337-344 (2018).</li><li>Ramirez-Aportela, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+local+resolution-based+sharpening+of+cryo-EM+maps.">Automatic local resolution-based sharpening of cryo-EM maps.</a> Bioinformatics. 36, 765-772 (2020).</li><li>Heymann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+3D+EM+Reconstructions:+The+Phantom+in+the+Noise.">Validation of 3D EM Reconstructions: The Phantom in the Noise.</a> AIMS Biophys. 2, 21-35 (2015).</li><li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+An+integrated,+database-drive+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: An integrated, database-drive pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166, 95-102 (2009).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+molecular+microscopy:+The+new+Leginon+system.">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151, 41-60 (2005).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Şu anda, kriyo-EM biyolojik örneklerin 3D yapısını ortaya çıkarmak için önemli bir araçtır. Mikroskopla iyi veriler toplandığında, mevcut işleme araçları, incelenmekte olan makromolekülün 3D yeniden yapılandırılmasını elde etmemizi sağlayacaktır. Cryo-EM veri işleme, bir makromolekülün işlevsel davranışını anlamanın anahtarı olan ve ilaç keşfinde de çok önemli olan atoma yakın çözünürlük elde edebilir.
Scipion, en alakalı görüntü işleme paketlerini bütünleştirici bir şekilde birleştirerek tüm iş akışının oluşturulmasına izin veren ve tüm görüntü işleme iş akışının izlenebilirliğine ve tekrarlanabilirliğine yardımcı olan bir yazılımdır. Scipion, işlemi gerçekleştirmek için çok eksiksiz bir araç seti sağlar; ancak, yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonlar elde etmek tamamen elde edilen verilerin kalitesine ve bu verilerin nasıl işlendiğini bağlıdır. 
Yüksek çözünürlüklü bir 3D rekonstrüksiyon elde etmek için ilk gereksinim, yapısal bilgileri yüksek çözünürlüğe koruyan mikroskoptan iyi filmler elde etmektir. Bu durumda, iş akışı verilerden yüksek tanımlı bilgileri ayıklayamaz. Daha sonra, başarılı bir işleme iş akışı, yapıya gerçekten karşılık gelen parçacıkları çıkarabilmeli ve bu parçacıkların 3D alandaki yönelimlerini bulmalıdır. İş akışındaki adımlardan herhangi biri başarısız olursa, yeniden yapılanan birimin kalitesi düşer. Scipion, işleme adımlarından herhangi birinde farklı paketler kullanılmasına izin verir, bu da verileri işlemek için en yeterli yaklaşımı bulmaya yardımcı olur. Ayrıca, birçok paketin mevcut olması sayesinde, farklı yöntemlerin tahmini çıktılarında bir anlaşma bularak doğruluğu artıran konsensüs araçları kullanılabilir. Ayrıca, Temsili Sonuçlar bölümünde çeşitli doğrulama araçları ve iş akışının her adımında doğru ve yanlış sonuçların nasıl belirlenacağı, olası sorunların nasıl tespit edilerek nasıl çözülmeye çalışılacağı ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Protokol boyunca, protokolün düzgün çalıştırılıp çalışmadığını anlamaya yardımcı olabilecek birkaç denetim noktası vardır. En alakalı olanlardan bazıları şunlardır: malzeme çekme, 2D sınıflandırma, ilk hacim tahmini ve 3D hizalama. Girişleri denetlemek, adımı farklı bir yöntemle yinelemek veya fikir birliğini kullanmak, Scipion'da kullanıcının sorunlar göründüğünde çözüm bulmak için kullanabileceği seçeneklerdir. 
Cryo-EM alanındaki paket entegrasyonuna yönelik önceki yaklaşımlarla ilgili olarak Appion31 , farklı yazılım paketlerinin gerçek entegrasyonuna izin veren tek yaklaşımdır. Bununla birlikte, Appion, elektron mikroskoplarından otomatik görüntü toplama sistemi olan Leginon32 ile sıkı bir şekilde bağlantılıdır. Scipion ile temel fark, veri modeli ve depolamanın daha az birleştirilmiş olmasıdır. Bu şekilde, Scipion'da yeni bir protokol oluşturmak için yalnızca bir Python komut dosyası geliştirilmesi gerekir. Ancak, Appion'da geliştiricinin komut dosyasını yazması ve temel veritabanını değiştirmesi gerekir. Özetle, Scipion bakım ve genişletilebilirliği basitleştirmek için geliştirilmiştir.
Bu yazıda , Plasmodium falciparum 80S Ribozom'un gerçek durum veri kümesini kullanarak Cryo-EM işleme için eksiksiz bir iş akışı sunduk (EMPIAR girişi: 10028, EMDB girişi: 2660). Burada ele alınan ve tartışılan adımlar film hizalaması, CTF tahmini, parçacık toplama, 2D sınıflandırma, ilk harita tahmini, 3D sınıflandırma, 3D iyileştirme, değerlendirme ve işlem sonrası olarak özetlenebilir. Bu adımların birkaçında farklı paketler kullanılmış ve konsensüs araçları uygulanmıştır. Son 3D yeniden inşa edilen hacim 3 şçözünürlüğe ulaştı ve işlendikten sonra, atomların uzayda nasıl düzenlendiğini açıklamaya yardımcı olan alfa-helikler gibi bazı ikincil yapılar ayırt edilebilir.
Bu yazıda sunulan iş akışı, Scipion'un farklı Cryo-EM paketlerini basitleştirmek ve aynı zamanda daha güvenilir bir sonuç elde etmek için basit ve bütünleştirici bir şekilde birleştirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Gelecekte, yeni yöntem ve paketlerin geliştirilmesi büyümeye devam edecek ve Scipion gibi yazılımların hepsini kolayca entegre etmesi araştırmacılar için daha da önemli olacaktır. Konsensüs yaklaşımları, farklı temellere sahip birçok yöntemin mevcut olacağı ve Cryo-EM'deki yeniden yapılanma sürecinde yer alan tüm parametrelerin daha doğru tahminlerinin elde edilmesine yardımcı olacaktır. Takip ve tekrarlanabilirlik, araştırma sürecinde anahtardır ve eksiksiz iş akışlarının yürütülmesi için ortak bir çerçeveye sahip olması sayesinde Scipion ile elde etmek daha kolaydır.

Kriyo-elektron mikroskopisinde (kriyo-EM), vitrifiye dondurulmuş nemlendirilmiş örneklerin tek parçacık analizi (SPA), moleküler etkileşimleri ve biyolojik toplulukların işlevini anlamaya izin verdiği için biyolojik makromoleküller için görüntülemenin en yaygın kullanılan ve başarılı varyantlarından biridir1. Bu, "çözünürlük devrimi"2'ye yol açan ve atoma yakın çözünürlükle biyolojik 3D yapıların başarılı bir şekilde belirlenmesine izin veren bu görüntüleme tekniğindeki son gelişmeler sayesindedir. Şu anda SPA cryo-EM'de elde edilen en yüksek çözünürlük apoferritin3 için 1,15 şidi (EMDB girişi: 11668). Bu teknolojik gelişmeler, örnek hazırlama4, görüntü alma5 ve görüntü işleme yöntemlerinde iyileştirmeler içerir6. Bu makale bu son noktaya odaklanmıştır.
Kısaca, görüntü işleme yöntemlerinin amacı, mikroskopun görüntüleme sürecini tersine çevirmek ve incelenmekte olan biyolojik örneğin 3D yapısını kurtarmak için tüm edinme parametrelerini tanımlamaktır. Bu parametreler, kameranın kazancı, ışın kaynaklı hareket, mikroskop sapmaları (özellikle defokus), her parçacığın 3D açısal yönelimi ve çevirisi ve konformasyonel değişikliklere sahip bir numuneye sahip olması durumunda konformasyonel durumdur. Bununla birlikte, parametre sayısı çok yüksektir ve cryo-EM radyasyon hasarını önlemek için düşük dozlu görüntüler kullanmayı gerektirir, bu da elde edilen görüntülerin Sinyal-Gürültü Oranını (SNR) önemli ölçüde azaltır. Bu nedenle, sorun kesin olarak çözülemez ve hesaplanacak tüm parametreler yalnızca tahminler olabilir. Görüntü işleme iş akışı boyunca, sonunda yüksek çözünürlüklü bir 3D yeniden yapılandırma elde etmek için kalanları atarak doğru parametreler tanımlanmalıdır.
Mikroskop tarafından oluşturulan veriler çerçeveler halinde toplanır. Basitleştirici olan çerçeve, elektron sayma dedektörleri kullanıldığında görüntüde belirli bir konuma (piksel) ulaşan elektron sayısını içerir. Belirli bir görüş alanında, birkaç kare toplanır ve buna film denir. Numuneyi yok edebilecek radyasyon hasarını önlemek için düşük elektron dozları kullanıldığından, SNR çok düşüktür ve örnek hakkında yapısal bilgileri ortaya çıkaran bir görüntü elde etmek için aynı filme karşılık gelen karelerin ortalamasının alınması gerekir. Bununla birlikte, sadece basit bir ortalama uygulanmaz, numune, denge edilmesi gereken ışın kaynaklı hareket nedeniyle görüntüleme süresi boyunca kaymalara ve diğer hareket türlerine maruz kalabilmemektedir. Kaydırma telafisi ve ortalama çerçeveler bir mikrografiden kaynaklanır.
Mikrograflar elde edildikten sonra, mikroskop tarafından her biri için tanıtılan sapmaları tahmin etmemiz gerekir, kontrast aktarım fonksiyonu (CTF), bu da mikro grafiğin kontrastındaki değişiklikleri frekansın bir işlevi olarak temsil eder. Daha sonra, parçacık toplama adı verilen parçacıklar seçilebilir ve çıkarılabilir. Her parçacık, incelenmekte olan numunenin sadece bir kopyasını içeren küçük bir görüntü olmalıdır. Parçacık toplama için üç algoritma ailesi vardır: 1) parçacığın görünümünün sadece bazı temel parametrelendirmesini kullanarak tüm mikrografi kümesinde (örneğin, parçacık boyutu), 2) parçacıkların nasıl göründüğünü kullanıcıdan veya önceden eğitilmiş bir kümeden öğrenenler ve 3) görüntü şablonlarını kullananlar. Her ailenin daha sonra gösterilecek farklı özellikleri vardır.
Mikrograflarda bulunan çıkarılan parçacık kümesi, iki hedefi olan bir 2B sınıflandırma işleminde kullanılacaktır: 1) saf gürültü görüntüleri, çakışan parçacıklar veya diğer eserler içeren alt kümeyi atarak parçacık kümesinin temizlenmesi ve 2) her sınıfı temsil eden ortalama parçacıklar, 3B başlangıç hacmini hesaplamak için ilk bilgi olarak kullanılabilir. 
3D başlangıç hacmi hesaplaması bir sonraki önemli adımdır. 3B yapıyı elde etme sorunu, küresel minimumun orijinal yapıyı temsil eden en iyi 3B birim olduğu, ancak yetersiz çözümleri temsil eden birkaç yerel minimanın bulunabildiği ve tuzağa düşmenin çok kolay olduğu çok boyutlu bir çözüm ortamında optimizasyon sorunu olarak görülebilir. başlangıç hacmi, arama işleminin başlangıç noktasını temsil eder, bu nedenle kötü başlangıç hacmi tahmini, genel minimum noktayı bulmamızı engelleyebilir. İlk hacimden itibaren, 3D sınıflandırma adımı farklı konformasyon durumlarını keşfetmeye ve parçacık kümesini tekrar temizlemeye yardımcı olacaktır; amaç yapısal olarak homojen bir parçacık popülasyonu elde etmektir. Bundan sonra, mümkün olan en iyi 3D hacmi elde etmek için her parçacık için açısal ve çeviri parametrelerini rafine etmekten bir 3D iyileştirme adımı sorumlu olacaktır. 
Son olarak, son adımlarda, elde edilen 3D rekonstrüksiyon keskinleştirilebilir ve parlatılabilir. Keskinleştirme, yeniden inşa edilen hacmin yüksek frekanslarını artırma işlemidir ve parlatma, CTF veya ışın kaynaklı hareket telafisi olarak bazı parametreleri parçacıklar düzeyinde daha da iyileştirmek için bir adımdır. Ayrıca, iş akışının sonunda elde edilen çözünürlüğü daha iyi anlamak için bazı doğrulama yordamları kullanılabilir. 
Tüm bu adımlardan sonra, izleme ve yerleştirme işlemleri7 , atomik modeller de novo inşa ederek veya mevcut modelleri sığdırarak elde edilen 3D rekonstrüksiyona biyolojik bir anlam kazandırmaya yardımcı olacaktır. Yüksek çözünürlük elde edilirse, bu süreçler bize biyolojik yapıların, hatta farklı atomların yapımızdaki konumlarını söyleyecektir.
Scipion8, en alakalı görüntü işleme paketlerini bütünleştirici bir şekilde birleştirerek tüm iş akışının oluşturulmasına olanak tanır. Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, Eman12, Spider13, Cryolo14, Ctffind15, CCP416, Phenix17 ve daha birçok paket Scipion'a dahil edilebilir. Ayrıca, tüm görüntü işleme iş akışının tam bir izlemesini yapmak için entegrasyon, birlikte çalışabilirlik, izlenebilirlik ve tekrarlanabilirlik için gerekli tüm araçları içerir8.
Scipion'un kullanmamıza izin verdiği en güçlü araçlardan biri, işlemin bir adımında elde edilen sonuçları birkaç yöntemle karşılaştırmak ve daha doğru bir çıktı oluşturmak için farklı yöntemlerle aktarılan bilgilerin bir kombinasyonunu yapmak anlamına gelen fikir birliğidir. Bu, tahmini parametrelerde performansı artırmaya ve elde edilen kaliteyi artırmaya yardımcı olabilir. Konsensüs yöntemleri kullanılmadan daha basit bir iş akışının oluşturabileceğini unutmayın; ancak, bu aracın gücünü gördük22,25 ve bu yazıda sunulan iş akışı birkaç adımda kullanacaktır.
Önceki paragraflarda özetlenen tüm adımlar aşağıdaki bölümde ayrıntılı olarak açıklanacak ve Scipion kullanılarak eksiksiz bir iş akışında birleştirilecektir. Ayrıca, oluşturulan çıktılarda daha yüksek bir anlaşma elde etmek için konsensüs araçlarının nasıl kullanılacağı gösterilecektir. Bu amaçla, Plasmodium falciparum 80S Ribozom'un örnek veri kümesi seçilmiştir (EMPIAR girişi: 10028, EMDB girişi: 2660). Veri kümesi, 4096x4096 piksel boyutunda 16 karelik 600 filmden oluşur ve FEI FALCON II kameralı bir FEI POLARA 300'de çekilen 1.34şpiksel boyutunda, EMDB'de bildirilen çözünürlük 3.2Å18 'dir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>no material is used in this article</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-em and single-particle analysis with scipion

Kriyo-elektron mikroskopisi, makromoleküllerin yapısal bilgilerini atoma yakın çözünürlükte ortaya çıkarmak için biyolojik araştırmalarda en önemli araçlardan biri haline gelmiştir. Tek parçacıklı analizde, vitrifiye numune bir elektron ışını tarafından görüntülenir ve mikroskop sütununun sonundaki dedektörler bu örneğin filmlerini üretir. Bu filmler rastgele yönelimlerde aynı parçacıkların binlerce görüntüsü içerir. Verilerin, son 3D yeniden yapılandırılmış birimi elde etmek için birden çok adıma sahip bir görüntü işleme iş akışından geçmesi gerekir. Görüntü işleme iş akışının amacı, incelenmek üzere numuneyi yeniden oluşturabilmek için edinme parametrelerini tanımlamaktır. Scipion, tümleştirici bir çerçevede çeşitli görüntü işleme paketleri kullanarak bu iş akışını oluşturmak için tüm araçları sağlar ve ayrıca sonuçların izlenebilirliğine izin verir. Bu makalede, Scipion'daki tüm görüntü işleme iş akışı, mikroskop tarafından elde edilen filmlerden yüksek çözünürlüklü bir son 3D rekonstrüksiyonuna gitmek için gerekli tüm ayrıntıları vererek gerçek bir test durumundan gelen verilerle sunulmakta ve tartışılmaktadır. Ayrıca, yöntemlerin birleştirilmesine izin veren konsensüs araçlarını kullanmanın ve iş akışının her adımı boyunca sonuçları onaylamanın, elde edilen sonuçların doğruluğunu artırmanın gücü tartışılmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion at JoVE.com

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Kriyo-elektron mikroskopisinde tek parçacık analizi, biyolojik toplulukların yapısını yüksek çözünürlükte belirlemek için kullanılan ana tekniklerden biridir. Scipion, mikroskop tarafından elde edilen bilgileri işlemek ve biyolojik numunenin 3D yeniden yapılandırılmasını sağlamak için tüm boru hattını oluşturmak için araçlar sağlar.

Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Scipion, biyolojik numunenin yüksek çözünürlüklü bir yeniden yapılandırılmasını sağlamak için kriyo-EM'deki tek bir parçacık analizi için tüm işleme iş akışını bütünleştirici bir şekilde oluşturmak için araçlar sağlar. Bu çerçeve, daha doğru bir çıktı oluşturmak için birlikte çalışabilirlik, izlenebilirlik, tekrarlanabilirlik ve farklı yöntemlerle iletilen bilgilerin birleşimini destekleyen birkaç görüntü işleme paketi kullanarak işleme iş akışını oluşturmayı mümkün kılar. Scipion, yeni yöntemler ve paketler de dahil olmak üzere sürekli büyüyor.Ayrıca, kriyo-elektron tomografisi ve atom modellemesine genişletilerek bu verileri işlemek için iş akışları oluşturulmasına da olanak sağlanmıştır. Scipion'da bir proje oluşturmak için Proje Oluştur'u tıklatarak projeyi oluşturun. Mikroskop filmlerini içe aktarmak için Filmleri içe aktar'ı seçin.Yeni bir pencere görünecektir. Bu pencerede, verilerin yolunu girin ve Mikroskop voltajını 300 kilovolt, Küresel sapmayı iki milimetreye, Genlik kontrastını 0,1'e, Büyütme oranını 50,000'e, Örnekleme hızı modunu Görüntüden'e ve Piksel boyutunu 1,34 angstroms'a ayarlayın. Tüm parametreler ayarlandığında Yürüt'ü tıklatın.Yöntem tamamlandığında, Özet sekmesini açın sonuçları çözümle'yi tıklatın. Yöntem tarafından oluşturulan çıktıların listesini içeren yeni bir pencere görüntülenir. Film hizalaması için optik akış yöntemini çalıştırmak için xmipp3 optik hizalama yöntemini açın ve giriş filmleri olarak içe aktarılan filmleri seçin ve Kareleri 2 ile 13 arasında HIZALAMA aralığına ayarlayın.Ek Parametreler altında, Önceki film hizalamasını SUM karelerine kullan seçeneğini No.Leave diğer seçeneklerin tümünü varsayılan değerlerine bırak olarak ayarlayın ve programı yürütün. Elde edilen mikro grafikleri ve tahmini kaymaların yörüngesini kontrol etmek için Sonuçları Analiz Et'i tıklatın. Her mikrograf için, güç spektral yoğunluğunu, filmi hem Kartezyen hem de kutupsal koordinatlarda hizalamak için elde edilen yörüngeleri ve elde edilen mikro grafiğin dosya adını kontrol etmek mümkündür.Numunenin parçacıklarının mikrografide filmin tek bir karesine kıyasla çok daha görünür olduğuna dikkat edin. Parçacık toplama için xmipp3 manuel malzeme çekme yöntemini açın ve giriş mikrografları olarak önceden elde edilen mikrografları seçin. Yürüt'ü tıklatın.Yeni bir etkileşimli pencere görünecektir. Bu pencerede piksel boyutunu 150 olarak değiştirin. Seçilen mikrograf daha büyük bir pencerede görünecektir.Bir bölgedeki tüm görünür parçacıkları seçin. Tüm parçacıklar manuel olarak seçildiğinde, öğrenmeye başlamak için Eğitimi Etkinleştir'i tıklatın. Mikro grafiğin kalan bölgeleri otomatik olarak seçilecektir.Toplanan parçacıkları kontrol et. Ek bir parçacık eklemek için bir ilgi parçacığına tıklayın. Yanlış parçacıkları gidermek için Shift tuşunu basılı tutun ve gerektiğinde parçacıkları tıklatın.Tüm parçacıklar otomatik olarak seçildiğinde, temsili bir eğitim kümesi oluşturmak için sonraki dört mikrografı teker teker seçin. Seçilen her mikrograftaki parçacıklar otomatik olarak toplanacak ve gerektiğinde parçacıkları içerecek veya kaldıracak şekilde her mikrografi kontrol edilecektir. Bir eğitim kümesi alındığında, toplanan tüm parçacıkların koordinatlarını kaydetmek için Koordinatlar'ı tıklatın.Eğitim setini aldıktan sonra, Xmipp parçacık toplama çalıştırmasında önceki manuel toplamayı belirtmek için xmipp3 otomatik toplamayı açın ve Mikrografileri denetlenenle aynı olarak seçecek şekilde ayarlayın. Yaklaşık 100.000 koordinat kümesi oluşturmak için Yürüt'ü tıklatın. Konsensüs yaklaşımı uygulamak için, sfenk cryolo toplamayı açın ve önceden işlenmiş mikrografları malzeme çekme modelinde giriş mikrografileri olarak varsayılan olarak ayarlayın.Güven eşiğini 0,3'e ve Kutu Boyutu'nu 150 olarak ayarlayın, sonra Yürüt'ü tıklatın. Yöntem ayrıca yaklaşık 100.000 koordinat oluşturmalıdır. Ardından, xmipp3 derin konsensüs toplamayı açın ve giriş koordinatlarını sphire cryolo ve xmipp3 otomatik toplama çıktısını, önceden eğitilecek model türünü ve önceden eğitilmiş modelle doğrudan Eğitim ve puanı Atla'yı Evet'e içerecek şekilde ayarlayın, ardından Yürüt'ü tıklatın.Yürütmenin sonunda Sonuçları Çözümle'yi tıklatın. Yeni pencerede göz simgesini tıklatın. Tüm parçacıkların bir listesiyle ikinci bir yeni pencere açılacaktır.Sütundaki Z-puan değerleri, düşük bir değer düşük bir kalitenin göstergesi olduğundan, her parçacığın kalitesi hakkında fikir verecektir. Parçacıkları en yüksekten en düşük Z puanına sıralamak için Xmipp Z-score derin öğrenme'yi tıklayın ve 0,75'ten daha yüksek Z puanına sahip parçacıkları seçin. Ardından, yaklaşık 50.000 koordinatlı yeni alt küme oluşturmak için Koordinatlar'ı tıklatın.Çözünürlüğü yerel olarak hesaplamak için xmipp3 yerel MonoRes'i açın ve giriş hacmini son iyileştirme adımının çıktısına ayarlayın, Yarım birimleri Evet olarak ve Çözünürlük Aralığını 1 ile 10 angstrom arasında kullanmak ister misiniz? Parametreler ayarlandığında Yürüt'ü tıklatın. Çözünürlük hesaplandığında Sonuçları Çözümle'yi tıklatın ve Çözünürlük histogramını göster ve Renkli dilimleri göster'i seçin.Birimin farklı bölümlerindeki çözünürlük gösterilecektir. Yapıların orta kısımlarının voksellerinin çoğu üç angstrom etrafında çözünürlükleri temsil etmeli, en kötü çözünürlükler ise yapıların dış bölgelerinde gözlemlenecektir. Voksel başına üç angstrom etrafında veya altında bir tepe ile çözünürlüklerin histogramı da gösterilecektir.Keskinleştirme uygulamak için xmipp3 localdeblur keskinleştirmeyi açın ve son iyileştirme adımının çıktısını Giriş Haritası olarak seçin ve çözünürlük eşlemesini MonoRes eşlemesini elde etmek üzere ayarlayın. Komut çalıştırıldıktan sonra, Özet sekmesinde çıktı olarak oluşturulan birimler kümesini çift tıklatın. Her yinelemede oluşturulan birimler denetlenebilir.Ayrıca, hacmin özelliklerini 3D olarak daha iyi gözlemlemek için hacmi UCSF Chimera gibi diğer araçlarla açmanız önerilir. Bu şekilde, Nyquist sınırına çok yakın olan üç angstromun Fourier kabuk korelasyonu gözlenebilir. Gösterildiği gibi, yeniden inşa edilen 3D hacim dilimleri yüksek düzeyde ayrıntı ve iyi tanımlanmış yapılar sergiler.Yerel analizlerden sonra, merkezi voksellerin çoğu üç angstromun altında bir çözüm elde eder. Ancak, yerel çözünürlük dilimlerinin dış bölgeleri, bu alanlarda gözlenen bulanıklıkla tutarlı olan daha düşük bir çözünürlük gösterir. İşlem sonrası, 3D harita hacminin daha yüksek frekansları gözlemlenebilir, daha fazla ayrıntı ortaya çıkarılabilir ve gösterimin iyileştirilmesi.Elde edilen çözünürlük yeterince yüksek olduğunda, yapının bazı biyokimyasal kısımları bile gözlemlenebilir. Elde edilen yapı düşük çözünürlüğe sahipse ve daha iyi bir çözünürlüğe dönüştürülemezse, yerel tahminin düşük Fourier kabuk korelasyonu, çözünürlük eğrisi ve histogramı ile bulanık bir hacim gözlenebilir. Toplamadan sonra, parçacık kalitesini değerlendirmek için 2D sınıflandırma kontrol edilebilir.Örneğin, bu sınıflandırmada parçacıklar gürültülü, girilmemiş veya birleştirilmiştir, bu da malzeme çekmenin yanlış olduğunu gösterir. İlk birim tahmini sırasında başka bir denetim noktası gerçekleştirilebilir. Bu örnekte, yöntem için yanlış bir kurulum kullanılarak hatalı bir tahmin oluşturulmuştur.Yeterli çözünürlüğe sahip bir 3B harita üretildikten sonra, bir sonraki adım harita için atomik bir model önermektir. Bu, modelleme eklentileri kullanılarak Scipion içinde yapılabilir. Bu teknik, biyolojik makromoleküllerin moleküler etkileşimlerinin ve biyolojik topluluk fonksiyonlarının ilaç tasarımının temeli olarak değerlendirilmesi için başarılı bir şekilde yeniden oluşturmak için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...