Name: nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode
Uploaded: 2021-06-04T15:00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل iNEXT-Discovery ، المشروع رقم 871037 ، بتمويل من برنامج Horizon 2020 التابع للمفوضية الأوروبية.

<ol>
	<li>Yanamala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-Based+Screening+of+Membrane+Protein+Ligands.">NMR-Based Screening of Membrane Protein Ligands.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 75, 237-256 (2010).</li><li>Souers, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABT-199,+a+potent+and+selective+BCL-2+inhibitor,+achieves+antitumor+activity+while+sparing+platelets.">ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets.</a> Nature Medicine. 19, 202-208 (2013).</li><li>Su, M. C., Te Chang, C., Chu, C. H., Tsai, C. H., Chang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atypical+RNA+pseudoknot+stimulator+and+an+upstream+attenuation+signal+for+-1+ribosomal+frameshifting+of+SARS+coronavirus.">An atypical RNA pseudoknot stimulator and an upstream attenuation signal for -1 ribosomal frameshifting of SARS coronavirus.</a> Nucleic Acids Research. 33, 4265-4275 (2005).</li><li>Perera, T. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+&amp;+pharmacological+characterization+of+JNJ-42756493+(Erdafitinib),+a+functionally+selective+small-molecule+FGFR+family+inhibitor.">Discovery &amp; pharmacological characterization of JNJ-42756493 (Erdafitinib), a functionally selective small-molecule FGFR family inhibitor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16, 1010-1020 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+pharmacology+of+a+highly+specific+dual+FMS+and+KIT+kinase+inhibitor.">Design and pharmacology of a highly specific dual FMS and KIT kinase inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5689-5694 (2013).</li><li>Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., Feeney, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+computational+approaches+to+estimate+solubility+and+permeability+in+drug+discovery+and+development+settings.">Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 23, 3-25 (1997).</li><li>Congreve, M., Carr, R., Murray, C., Jhoti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+'Rule+of+Three'+for+fragment-based+lead+discovery.">A 'Rule of Three' for fragment-based lead discovery.</a> Drug Discovery Today. 8, 876-877 (2003).</li><li>Ch&#225;vez-Hern&#225;ndez, A. L., S&#225;nchez-Cruz, N., Medina-Franco, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+Library+of+Natural+Products+and+its+Comparative+Chemoinformatic+Characterization.">A Fragment Library of Natural Products and its Comparative Chemoinformatic Characterization.</a> Molecular Informatics. 39, 2000050 (2020).</li><li>Sreeramulu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+quality+control+of+fragment+libraries+for+screening.">NMR quality control of fragment libraries for screening.</a> Journal of Biomolecular NMR. , 00327-00329 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+NMR+Fragment+Based+Screening+Identified+a+Novel+Interface+Blocker+to+the+LARG/RhoA+Complex.">Automated NMR Fragment Based Screening Identified a Novel Interface Blocker to the LARG/RhoA Complex.</a> PLoS One. 9, 88098 (2014).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Efficient+Fragment-Based+Lead+Generation+by+Fully+Automated+Processing+and+Analysis+of+Ligand-Observed+NMR+Binding+Data.">Fast and Efficient Fragment-Based Lead Generation by Fully Automated Processing and Analysis of Ligand-Observed NMR Binding Data.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 3303-3310 (2016).</li><li>Cox, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP(2),+an+atypical+bromodomain.">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).</li><li>Hwang, T. L., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Suppression+That+Works.+Excitation+Sculpting+Using+Arbitrary+Wave-Forms+and+Pulsed-Field+Gradients.">Water Suppression That Works. Excitation Sculpting Using Arbitrary Wave-Forms and Pulsed-Field Gradients.</a> Journal of Magnetic Resonance, Series A. 112, 275-279 (1995).</li><li>Gossert, A. D., Jahnke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+in+drug+discovery:+A+practical+guide+to+identification+and+validation+of+ligands+interacting+with+biological+macromolecules.">NMR in drug discovery: A practical guide to identification and validation of ligands interacting with biological macromolecules.</a> Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 97, 82-125 (2016).</li><li>Sklenar, V., Bax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+water+suppression+technique+for+generating+pure-phase+spectra+with+equal+excitation+over+a+wide+bandwidth.">A new water suppression technique for generating pure-phase spectra with equal excitation over a wide bandwidth.</a> Journal of Magnetic Resonance. 75, 378-383 (1987).</li><li>Binas, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=19F+NMR-Based+Fragment+Screening+for+14+Different+Biologically+Active+RNAs+and+10+DNA+and+Protein+Counter-Screens.">19F NMR-Based Fragment Screening for 14 Different Biologically Active RNAs and 10 DNA and Protein Counter-Screens.</a> ChemBioChem. , (2020).</li></ol>

براعة فحص الشظايا / المخدرات القائم على الرنين المغناطيسي النووي. نفذت BMRZ بنجاح أحدث أجهزة الرنين المغناطيسي النووي الآلية بالإضافة إلى تجارب STD-NMR و waterLOGSY والاسترخاء لتحديد الشظايا ضمن مجموعة واسعة من نظام التقارب لاكتشاف الأدوية. تشتمل الأجهزة المثبتة على روبوت تحضير عينات عالي الإنتاجية ووحدة تخزين ومبدل ووحدة للحصول على بيانات عالية الإنتاجية مرتبطة بمطياف 600 ميجاهرتز. يضمن المسبار المبرد الذي تم شراؤه مؤخرا ل 1 H و 19 F و 13C و 15 N الحساسية المطلوبة للقياسات المقترحة ويسمح بفصل 1 H (1) أثناء اكتشاف 19F. يتصل هذا المسبار بأحدث جيل من وحدة تحكم الرنين المغناطيسي النووي التي توفر إمكانية استخدام أدوات البرامج المتقدمة من Bruker ، بما في ذلك CMC-q و CMC-assist و CMC-se و FBS (المضمنة في TopSpin). تم تضمين أداة الفحص القائمة على الأجزاء (FBS) في أحدث إصدار من TopSpin وتساعد على تحليل البيانات عالية الإنتاجية التي تتكون من STD و waterLOGSY و T2 / T1r-relaxation experiments. يمكن ملء مجموعة العينات السائلة 1D 1H في أنابيب الرنين المغناطيسي النووي بطريقة آلية باستخدام روبوت ملء العينة. عادة ، يتم ملء كتلة من 96 أنبوبا (3 مم) في حوالي ساعتين. يتم وضع رفوف 96 لوحة بئر مباشرة في مبدل عينة HT ، الذي يقرأ الرمز الشريطي للكتلة ويعين أنابيب الرنين المغناطيسي النووي للتجارب التي يتحكم فيها برنامج الأتمتة (IconNMR). يمكن تخزين خمسة رفوف ذات 96 بئرا وبرمجتها في مبدل عينات HT في نفس الوقت. يمكن التحكم في درجة حرارة كل من الرفوف الفردية وتنظيمها بشكل منفصل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف كل عينة فردية مسبقا (التسخين المسبق وتجفيف الأنبوب لإزالة الرطوبة المكثفة) إلى درجة الحرارة المطلوبة قبل القياس.
ملاءمة لمجموعة واسعة من التطبيقات. أحد التطبيقات الواسعة لهذا الفحص الآلي القائم على الرنين المغناطيسي النووي هو تحديد وتطوير روابط جديدة مرتبطة بهدف جزيئي حيوي (DNA / RNA / Proteins). يمكن أن تشتمل هذه الروابط على مثبطات تقويم العظام ومثبطات الستيريك التي ترتبط عادة بشكل غير تساهمي. علاوة على ذلك ، عادة ما يتم استخدام FBDD بواسطة الرنين المغناطيسي النووي كخطوة أولى لاختيار المركبات الواعدة ، والمتطلبات التي يجب الوفاء بها هي توافر الهدف الجزيئي الحيوي بكميات كافية. وينقسم هذا الهدف إلى مهمتين رئيسيتين.
المهمة الأولى هي تطوير وتوصيف مكتبة أجزاء داخلية للأسباب التالية: مراقبة الجودة الأولية والدورية ، وتوصيف ، وتحديد كمية أكثر من 1000 جزء ؛ تحديد قابلية ذوبان الشظايا في المخازن المؤقتة المحسنة لكل هدف ، ولا سيما بالنسبة لأهداف البروتين ؛ وإنشاء العديد من المكتبات لاستيعاب سقالات متنوعة وتمتد نحو فئات الجزيئات الكبيرة الأخرى. وتتمثل المهمة الثانية في إدماج تدفقات العمل لتصميم العقاقير المرتكزة على الأجزاء (FBDD) بواسطة الرنين المغناطيسي النووي باستخدام: الفحص الآلي لليجند المرصود 1D (1 H و 19 F المرصود)؛ والفحص الآلي لليجند (1 H و 19 F)؛ والفحص الآلي لليجند (1 H و 19 F المرصود)؛ والفحص الآلي 1D-ligand (1 H و 19 F المرصود)؛ والفحص الآلي لليجند (1H و 19F المر مقايسات الاستبدال الآلي (تجارب المنافسة مع الرباط (الطبيعي)) للتمييز بين الربط التقويمي والخيفي ؛ الفحوصات الثانوية الآلية مع أجزاء متعددة ؛ الفحص الآلي لبروتين 2D ، والفحص الثانوي لمجموعة من المشتقات حول ضربة أولية باستخدام مكتبة EU-OPENSCREEN أو أي مكتبة أخرى ؛ وإعادة فحص التنميط لمكتبة إدارة الغذاء والدواء مقابل الأهداف المختارة.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء التمثيل الغذائي لخطوط الخلايا المختلفة (ذات الصلة بالمرض) من أجل كشف الآليات التنظيمية التي تربط التحكم في دورة الخلية والتمثيل الغذائي. أيضا ، هناك توصيف وظيفي لعناصر تنظيم الحمض النووي الريبي / الحمض النووي / البروتين في الجسم الحي وفي المختبر لتحسين البناء / المجال (تحسين الاستقرار للتحقيقات الهيكلية (المخزن المؤقت ، ودرجة الحموضة ، ودرجة الحرارة ، وفحص الملح) ، وتمديد فحص الشظايا القائم على الرنين المغناطيسي النووي إلى البروتينات الغشائية والبروتينات المضطربة جوهريا ، والتي لا يمكن الوصول إليها بشكل عام لتقنيات أخرى.
القيود. استخدام مكتبات أجزاء 19F و 1H له إيجابيات وسلبيات ، سيتم ذكر القليل منها في ما يلي. أكبر فائدة من قياسات 19F مقابل 1H هي سرعة كل من وقت القياس الفعلي والتحليل اللاحق ، حيث تحتوي المخاليط على ضعف عدد الأجزاء تقريبا ويجب إجراء عدد أقل من التجارب. يعد تحليل المتابعة أسهل أيضا لفحص 19درجة فهرنهايت ، حيث لا يوجد تداخل من المخازن المؤقتة ويوفر بالإضافة إلى ذلك نطاق تحول كيميائي أوسع مع عدم وجود تداخل إشارة تقريبا لخليط شظايا مصمم على النحو الأمثل. يتم تبسيط الأطياف نفسها إلى حد كبير ، وعادة ما تحتوي على إشارة واحدة أو اثنتين فقط لكل جزء ، اعتمادا على عدد ذرات الفلور. وبالتالي يمكن أتمتة تحليل هذه الأطياف ، مما يقلل مرة أخرى من الوقت. يأتي هذا على حساب التنوع الكيميائي ، على الأقل بالنسبة للمكتبة المستخدمة في هذه الدراسة. نظرا لأن ~ 13٪ فقط من المكتبة تحتوي على 19 فهرنهايت ، ولكن من الطبيعي أن تكون جميعها قابلة للاستخدام في فحص 1H ، فإن تنوع أجزاء الفحص 19F سيكون أقل. يمكن التحايل على ذلك باستخدام مكتبات 19F المصممة خصيصا مع المزيد من الأجزاء والتنوع الكيميائي الأكبر. عيب آخر لفحص 19F هو انخفاض عدد الإشارات لكل جزء. تتكون الشظايا بشكل عام من أكثر من ذرة هيدروجين واحدة. لذلك ، يمكن أن تعتمد تجارب الفحص المرصودة 1H على إشارات مختلفة لنفس الجزء للكشف عن الارتباط. يعطي هذا درجة أعلى من الثقة عند تحديد النتائج لفحص 1H ، في حين يجب أن يعتمد فحص 19F على إشارة أو إشارتين معطيتين لكل جزء.
وقدم بيان مفصل عن أجهزة فحص الشظايا الآلية الحديثة القائمة على الرنين المغناطيسي النووي، والبرمجيات وأساليب التحليل والبروتوكولات الخاصة بها. تشتمل الأجهزة المركبة على روبوت تحضير عينات عالي الإنتاجية ووحدة تخزين ومبدل واكتساب بيانات عالية الإنتاجية مرتبطة بمطياف 600 ميجاهرتز. يضمن رأس المسبار المبرد الذي تم تركيبه مؤخرا ل 1 H و 19 F و 13C و 15 N الحساسية المطلوبة للقياسات المقترحة ويسمح بفصل 1H أثناء اكتشاف 19F. علاوة على ذلك ، يوفر أحدث جيل من وحدة التحكم NMR إمكانية استخدام برامج تحليلية متقدمة للمساعدة في الاستحواذ والتحليل السريع. يجب أن تعزز التكنولوجيا التي تمت مناقشتها أعلاه وسير العمل والبروتوكولات الموصوفة نجاحا ملحوظا للمستخدمين الذين يتابعون FBS بواسطة الرنين المغناطيسي النووي.

أصبح الفحص القائم على الشظايا الآن طريقة شائعة الاستخدام لتحديد جزيئات بسيطة ومنخفضة الوزن الجزيئي (MW <250 Da) التي تظهر ارتباطا ضعيفا بالأهداف الجزيئية الكبيرة بما في ذلك البروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي. تعمل النتائج الأولية من الشاشات الأولية كأساس لإجراء شاشة ثانوية من نظائرها الأكبر المتاحة تجاريا للزيارات ثم استخدام نمو الأجزاء القائمة على الكيمياء أو استراتيجيات الربط. من أجل منصة ناجحة لاكتشاف الأدوية القائمة على الشظايا (FBDD) ، بشكل عام ، هناك حاجة إلى طريقة فيزيائية حيوية قوية للكشف عن وتوصيف الضربات الضعيفة ، ومكتبة شظايا ، وهدف جزيئي حيوي واستراتيجية لمتابعة الكيمياء. أربع طرق فيزيائية حيوية شائعة التطبيق في حملات اكتشاف الأدوية هي مقايسات التحول الحراري ، ورنين البلازمون السطحي (SPR) ، وعلم البلورات ، والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR).
أظهر التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي أدوارا متنوعة في المراحل المختلفة من FBDD. بصرف النظر عن ضمان النقاء الكيميائي وقابلية ذوبان الشظايا في مكتبة شظايا مذابة في نظام عازل محسن ، يمكن لتجارب الرنين المغناطيسي النووي المرصودة أن تكتشف ارتباط الشظايا بهدف ذي تقارب منخفض ويمكن لتجارب الرنين المغناطيسي النووي المرصودة الهدف تحديد حاتمة الربط للجزء ، وبالتالي تمكين دراسات مفصلة للعلاقة بين الهيكل والنشاط. ضمن رسم الخرائط ، لا يمكن لتغييرات التحول الكيميائي القائمة على الرنين المغناطيسي النووي تحديد مواقع الربط التقويمي فحسب ، بل أيضا المواقع الخيفية التي قد تكون مشفرة ولا يمكن الوصول إليها إلا في ما يسمى بالحالات التوافقية المثارة للهدف الجزيئي الحيوي. إذا كان الهدف الجزيئي الحيوي يربط بالفعل ليجند داخلي المنشأ ، فيمكن تصنيف ضربات الشظية المحددة بسهولة على أنها خيفية أو تقويمية عن طريق إجراء تجارب المنافسة القائمة على الرنين المغناطيسي النووي. يعد تحديد ثابت التفكك (KD) لتفاعل الرباط والهدف جانبا مهما في عملية FBDD. يمكن إجراء معايرات التحول الكيميائي القائمة على الرنين المغناطيسي النووي ، إما الرباط أو الهدف الملاحظ بسهولة لتحديد KD. الميزة الرئيسية للرنين المغناطيسي النووي هي أن دراسات التفاعل يتم إجراؤها في محلول وبالقرب من الظروف الفسيولوجية. وبالتالي ، يمكن التحقيق في جميع الحالات المطابقة لتحليل تفاعل الرباط / الشظايا مع هدفها. علاوة على ذلك ، لا تقتصر الأساليب القائمة على الرنين المغناطيسي النووي على فحص البروتينات القابلة للذوبان المطوية جيدا فحسب ، بل يتم تطبيقها أيضا لاستيعاب مساحة مستهدفة أكبر بما في ذلك الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات المرتبطة بالغشاء والمضطربةجوهريا 1.
تعد المكتبات المجزأة جزءا لا غنى عنه من عملية FBDD. بشكل عام ، تعمل الشظايا كسلائف أولية تصبح في النهاية جزءا (بنية تحتية) من المانع الجديد الذي تم تطويره لهدف بيولوجي. تم الإبلاغ عن أن العديد من الأدوية (Venetoclax2 ، Vemurafenib3 ، Erdafitinib4 ، Pexidartnib5) قد بدأت كشظايا ويتم استخدامها الآن بنجاح في العيادات. عادة ما تكون الشظايا عبارة عن جزيئات عضوية منخفضة الوزن الجزيئي (<250 دا) ذات قابلية ذوبان مائية عالية واستقرار. يمكن لمكتبة الأجزاء المصممة بعناية والتي تحتوي عادة على بضع مئات من الأجزاء أن تعد بالفعل باستكشاف فعال للفضاء الكيميائي. تطور التكوين العام لمكتبات الأجزاء مع مرور الوقت وغالبا ما تم اشتقاقها عن طريق تشريح الأدوية المعروفة إلى أجزاء أصغر أو مصممة حسابيا. تحتوي مكتبات الأجزاء المتنوعة هذه بشكل أساسي على ذرات عطرية مسطحة أو غير متجانسة وتلتزم بقاعدة Lipinski ل 5 6 ، أو بقاعدة الاتجاه التجاري الحالي 3 7 ، ولكنها تتجنب المجموعات التفاعلية. كما تم اشتقاق بعض مكتبات الأجزاء أو تكوينها من مستقلبات عالية الذوبان ومنتجات طبيعية و / أو مشتقاتها8. التحدي العام الذي تشكله معظم مكتبات الأجزاء هو سهولة الكيمياء النهائية.
مركز الرنين المغناطيسي الجزيئي الحيوي (BMRZ) في جامعة جوته في فرانكفورت ، هو شريك في iNEXT-Discovery (البنية التحتية للرنين المغناطيسي النووي و EM والأشعة السينية للأبحاث الانتقالية - الاكتشاف) ، وهو اتحاد للبنى التحتية للبحوث الهيكلية لجميع الباحثين الأوروبيين من جميع مجالات البحوث البيوكيميائية والطبية الحيوية. ضمن المبادرة السابقة ل iNEXT التي انتهت في عام 2019 ، تم إنشاء مكتبة أجزاء تتكون من 768 جزءا بهدف "الحد الأدنى من الشظايا والحد الأقصى للتنوع" الذي يغطي مساحة كيميائية كبيرة. علاوة على ذلك ، على عكس أي مكتبة أجزاء أخرى ، تم تصميم مكتبة أجزاء iNEXT أيضا بناء على مفهوم "الأجزاء المتوازنة" بهدف تسهيل التوليف النهائي للروابط المعقدة عالية التقارب والمعروفة من الآن فصاعدا باسم المكتبة الداخلية (الماس ، اتحاد الجينوم الهيكلي و iNEXT).
يتطلب إنشاء FBDD بواسطة الرنين المغناطيسي النووي القوى العاملة والمعرفة والأجهزة. في BMRZ ، تم تطوير تدفقات العمل المحسنة لدعم المساعدة الفنية لفحص الأجزاء بواسطة الرنين المغناطيسي النووي. وتشمل هذه مراقبة الجودة وتقييم الذوبان لمكتبة الشظايا 9 ، وتحسين المخزن المؤقت للأهداف المختارة ، والفحص القائم على 1D H أو 19F- المرصود 1D ligand ، وتجارب المنافسة للتمييز بين الربط التقويمي والخيفي ، وتجارب الرنين المغناطيسي النووي المرصودة على الهدف 2D لرسم خرائط الخاتمة ، ولتوصيفالتفاعل مع مجموعة ثانوية من مشتقات ضربات الشظايا الأولية. أنشأت BMRZ إجراءات آلية للتحليل ، كما تمت مناقشته سابقا في الأدبيات 10،11 ، للتفاعلات بين جزيئات البروتين الصغيرة ولديها جميع البنية التحتية الآلية اللازمة لفحص الأجزاء القائمة على الرنين المغناطيسي النووي. وقد نفذت فرق نقل التشبع NMR (STD-NMR) ، وليجند الماء الذي لوحظ عبر التحليل الطيفي المتدرج (waterLOGSY) ، وتجارب الاسترخاء القائمة على Carr-Purcell-Meiboom-Gill (القائمة على CPMG) لتحديد الشظايا ضمن مجموعة واسعة من أنظمة التقارب بالإضافة إلى أحدث أجهزة وبرامج الرنين المغناطيسي النووي الآلية لاكتشاف الأدوية. في حين أن فحص الشظايا القائم على الرنين المغناطيسي النووي راسخ للبروتينات ، فإن هذا النهج أقل استخداما للعثور على روابط جديدة تتفاعل مع الحمض النووي الريبي والحمض النووي. أنشأت BMRZ دليلا على مفهوم البروتوكولات الجديدة التي تمكن من تحديد تفاعلات الجزيئات الصغيرة - الحمض النووي الريبي / الحمض النووي. في الأقسام التالية من هذه المساهمة ، تم الإبلاغ عن تطبيق إجراءات الفحص على عينات البروتين والحمض النووي الريبي لإدراك البروتوكولات المعمول بها لقاعدة واسعة من المستخدمين في أبحاث الجزيئات الحيوية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Avance III HD</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>600 MHz NMR Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes</td>
			<td>3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Barcoded Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix SepraSeal und DuraSeal&#38;</td>
			<td>4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SampleJet</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>HT Sample Changer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SamplePro Tube</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Pipetting Robot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode

الفحص القائم على الشظايا (FBS) هو مفهوم تم التحقق منه وقبوله جيدا في عملية اكتشاف الأدوية في كل من الأوساط الأكاديمية والصناعة. أكبر ميزة لفحص الشظايا القائم على الرنين المغناطيسي النووي هي قدرته ليس فقط على اكتشاف المجلدات التي تزيد عن 7-8 أوامر من حجم التقارب ولكن أيضا لمراقبة النقاء والجودة الكيميائية للشظايا وبالتالي إنتاج ضربات عالية الجودة والحد الأدنى من الإيجابيات الخاطئة أو السلبيات الكاذبة. أحد المتطلبات الأساسية داخل FBS هو إجراء مراقبة الجودة الأولية والدورية لمكتبة الأجزاء ، وتحديد قابلية الذوبان والسلامة الكيميائية للشظايا في المخازن المؤقتة ذات الصلة ، وإنشاء مكتبات متعددة لتغطية سقالات متنوعة لاستيعاب مختلف فئات الجزيئات المستهدفة (البروتينات / الحمض النووي الريبي / الحمض النووي). علاوة على ذلك ، يلزم تحسين بروتوكول الفحص الشامل القائم على الرنين المغناطيسي النووي فيما يتعلق بكميات العينات ، وسرعة الاكتساب والتحليل على مستوى البناء البيولوجي / الفضاء الشظوي ، في مساحة الحالة (العازلة ، والمواد المضافة ، والأيونات ، ودرجة الحموضة ، ودرجة الحرارة) وفي مساحة الرباط (نظائر الربيطة ، تركيز الرباط). على الأقل في الأوساط الأكاديمية ، تم تنفيذ جهود الفحص هذه يدويا حتى الآن بطريقة محدودة للغاية ، مما أدى إلى محدودية توافر البنية التحتية للفحص ليس فقط في عملية تطوير الأدوية ولكن أيضا في سياق تطوير المسبار الكيميائي. من أجل تلبية المتطلبات اقتصاديا ، يتم تقديم مهام سير العمل المتقدمة. إنهم يستفيدون من أحدث الأجهزة المتقدمة ، والتي يمكن من خلالها ملء مجموعة العينات السائلة بطريقة يتم التحكم في درجة حرارتها في أنابيب الرنين المغناطيسي النووي بطريقة آلية. 1ثم يتم جمع الأطياف القائمة على الرباط H / 19F NMR عند درجة حرارة معينة. يمكن لمبدل العينات عالي الإنتاجية (مبدل العينات HT) التعامل مع أكثر من 500 عينة في كتل يتم التحكم في درجة حرارتها. هذا جنبا إلى جنب مع أدوات البرمجيات المتقدمة يسرع الحصول على البيانات وتحليلها. علاوة على ذلك ، يتم وصف تطبيق إجراءات الفحص على عينات البروتين والحمض النووي الريبي للتعرف على البروتوكولات المعمول بها لقاعدة واسعة من المستخدمين في أبحاث الجزيئات الحيوية.

مراقبة جودة مكتبة الأجزاء تم تسليم الأجزاء من المكتبة الداخلية كحلول مخزون 50 مللي متر في 90٪ d6-DMSO و 10٪ D 2 O (10٪من D2O يضمن تقليل تدهور المركب بسبب دورات التجميد والذوبان المتكررة14). تتكون العينات المركبة المفردة من 1 mM ligand في 50 mM phosphate buffer (25 mM KPi pH 6.2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl 2) ، درجة الحموضة 6.0 في 90٪ H 2 O / 9٪ D 2O / 1٪ d6-DMSO. 1تم قياس تجارب H-NMR للشظايا من مكتبة iNEXT على مطياف الرنين المغناطيسي النووي 500/600 ميجاهرتز. تم استخدام هذه البيانات أيضا لتحديد المركبات المفردة في حملات فحص 1H باستخدام برنامج CMC-q الذي يسمح للمستخدم بالحصول على الأطياف بالكامل بطريقة آلية وتم تقييم جودة (قابلية الذوبان والسلامة) للشظايا. تظهر نتائج التحليل الآلي من CMC-a كناتج رسومي مشابه لما هو ممثل في الشكل 3. يظهر الإخراج الرسومي تمثيلا للوحة 96 بئرا. تعني الدائرة ذات اللون الأحمر أن هذه القطعة تظهر عدم تناسق في التركيب أو التركيز. تشير الآبار ذات اللون الأخضر إلى أن الجزء متسق.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig03.jpg"> الشكل 3: مراقبة جودة مكتبة الأجزاء. تمثيل تخطيطي للإخراج الآلي القائم على CMC-a. يتم تقييم خصائص الشظايا مثل التركيز والسلامة الهيكلية. الأخضر يرمز إلى متسق ، والبرتقالي في هذه الحالة يرمز إلى غير متسق. تتم مراجعة الأجزاء غير المتناسقة يدويا باتباع سير العمل المعروض. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تم تصنيف ما يقرب من 65٪ و 35٪ من الأجزاء على أنها متسقة وغير متسقة ، على التوالي ، في كل من DMSO والمخزن المؤقت. علاوة على ذلك ، أصبحت 30٪ من الروابط المصنفة غير المتسقة متسقة بعد فحص يدوي دقيق للأطياف9.
19F تصميم خليط تم تقسيم 103 أجزاء تحتوي على مجموعة واحدة أو عدة مجموعات من الفلور من المكتبة الداخلية إلى 5 خلطات (A ، B ، C ، D ، E). يحتوي كل مزيج على 20 إلى 21 جزءا. وفي هذه الحالة، كان لا بد من تصميم المخاليط بعناية لتجنب تداخل الإشارة. 19تم قياس تجارب الاسترخاء المستعرض F لكل خليط يطبق قطارات نبض CPMG. يمكن تعديل هذه التجارب عن طريق تغيير تأخيرات الاسترخاء. يمكن رؤية التحول الكيميائي 19F للخلطات A-E في الشكل 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig04.jpg"> الشكل 4: 19F 1D-NMR أطياف عينات الخليط من المكتبة الداخلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
إعداد العينة تم تحضير العينة في إجراء الفحص 19F إما يدويا أو باستخدام سحب آلي باستخدام روبوت ماصات ماصة . كان تركيز الشظايا في كل خليط 2.5 mM في 90٪ d6-DMSO و 10٪ D2O. كان الحجم النهائي لعينة الفحص 170 ميكرولتر مع 5٪ D2O كعامل قفل. تم سحب كل خليط مرتين ، واحدة في محلول يحتوي على محلول (بدون هدف) والأخرى في هدف يحتوي على محلول عازل. تم ضبط نسبة الهدف والشظية على 1: 1 ، مما أدى إلى تركيز الهدف / الربيطة النهائي 50 ميكرومتر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عينات التحكم هي الجزيء الحيوي المستهدف في فحص المخزن المؤقت بدون خليط لضمان سلامة الهدف بالإضافة إلى عينة تحكم مع المخزن المؤقت فقط و D2O لضمان جودة المخزن المؤقت.
كانت بيانات فحص الرنين المغناطيسي النووي ل 19 F-1D و 19F-CPMG-T2 قياسات كما هو موضح في القسم 3.1. على سبيل المثال ، في حالة الحمض النووي الريبي ، تم الحصول على تسلسل صدى القفز والعودة (pp = zggpjrse ، 15) لعينة الهدف الفردي في المخزن المؤقت.
تحليل البيانات تم تطبيق إجراء الفحص 19 F على TPP riboswitch thiM من E. coli وبروتين التيروزين كيناز (PtkA) من M. السل من بين عدة أهداف أخرى 16. تحتوي مكتبة فحص 19F على 103 أجزاء مقسمة إلى 5 خلطات مصنفة من Mix A إلى E. يمكن إجراء تحضير عينات الفحص يدويا دون استخدام روبوت سحب العينات. تم خلط محلول يحتوي على 40 ميكرومتر من الحمض النووي الريبي (ظروف عازلة) مع 3.2 ميكرولتر من المخاليط. تم تحضير عينات تحكم أخرى تتكون من المخزن المؤقت فقط ، والمخزن المؤقت بنسبة 5٪ من DMSO (يضمن سابقا استقرار الجزيء الحيوي الكبير في وجود تركيز DMSO المطلوب) والمخزن المؤقت مع الحمض النووي الريبي. تم تحضير عينات الفحص ال 13 هذه ونقلها إلى أنابيب NMR مقاس 3 مم. يتم مسح الباركود لأنابيب الرنين المغناطيسي النووي وكل خليط في وجود وغياب الحمض النووي الريبي ، وكذلك تم قياس عينات التحكم وفقا لتجارب الرنين المغناطيسي النووي 19F المذكورة أعلاه التي أجريت عند 298 K. تم إجراء فحص thiM RNA مقابل المكتبة الداخلية عن طريق إجراء قياسات T2 باستخدام CPMGs من 0 مللي ثانية و 200 مللي ثانية لكل عينة مختلفة. تمت مراقبة الشفط السليم وقمع المياه بعد الانتهاء من القياسات من خلال مقارنة جميع قمم DMSO من حيث توسيع الخط وفقدان الشدة لتجارب 1H 1D المقاسة بشكل إضافي لجميع العينات. تم إجراء معالجة أطياف الاسترخاء CPMG T219F التي تم الحصول عليها باستخدام ماكرو معد مسبقا ومؤتمت في TopSpin ، على التوالي. تم إجراء تحليل البيانات باتباع التعليمات الواردة في قسم البروتوكول. يمكن تقييم البيانات المتكاملة التي تم الحصول عليها من TopSpin (باتباع الإرشادات الواردة في البروتوكول) بسرعة وسهولة باستخدام جدول بيانات معد مسبقا أو أي برنامج مشابه ، من خلال تحديد الشروط والعتبات الصحيحة. كما هو موضح سابقا ، تكون العتبات مفيدة في تعريف الموثق أو الموثق الضعيف أو غير الموثق. يوضح الشكل 5 النتائج النموذجية لأطياف CPMG ل thiM RNA و PtkA ، على التوالي. وفي بعض الحالات، يلزم إجراء مزيد من التنقيح من جانب الخبراء. 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig05.jpg"> الشكل 5: قطع من 19 أطياف F CPMG NMR تظهر تغيرات الشدة التي تم الحصول عليها من أوقات التأخير المختلفة للتجارب القائمة على CPMG . (أ) تمثيل مادة رابطة (ضربة) وغير رابطة في 19F فحص قائم على الشظايا تم إجراؤه على TPP riboswitch thiM RNA من الإشريكية القولونية. (ب) تمثيل مادة رابطة وغير موثقة في فحص قائم على الشظايا 19F تم إجراؤه على PtkA من المتفطرة السلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
فحص 1ساعة
تصميم الخليط المكتبة الداخلية المستخدمة متنوعة للغاية لدرجة أنه لأغراض فحص 1H لم يتم تنفيذ أي تصميم خليط. هذا يعني أنه تم تحضير ٦٤ خلطا باختيار ١٢ خلطا عشوائيا لخلطها في خليط واحد.
تحضير العينة بالنسبة لفحص 1H ل SARS-CoV-2 RNA المثالي ، تم إجراء سحب آلي باستخدام روبوت ماصة لإعداد العينات. كان تركيز الشظايا في كل خليط 4.2 mM في 90٪ d6-DMSO و 10٪ D2O. كان الحجم النهائي لعينة الفحص 200 ميكرولتر مع 5٪ D2O كعامل قفل. 64 عينة تحتوي كل منها على خليط مختلف في 25 mM KPi ، و 50 mM KCl عند الرقم الهيدروجيني 6.2 تم سحبها بدون الحمض النووي الريبي المستهدف. على التوالي ، تم سحب 64 عينة باستخدام الحمض النووي الريبي المستهدف ، كل منها يحتوي على خليط مختلف. تم ضبط نسبة RNA: Ligand على 1:20 ، مما أدى إلى تركيز RNA يبلغ 10 ميكرومتر وتركيز ليجند يبلغ 200 ميكرومتر.
تحليل البيانات بالنسبة لتحليل 1H ، تم استخدام أداة FBS في TopSpin. لتحديد ما إذا كانت الشظية ناجحة ، تم إجراء تجارب استرخاء 1D Chemical Shift و waterLOGSY و T2 . بالنسبة لاسترخاء T2 ، تم احتساب انخفاض في الشدة أكبر من 30٪ على أنه ضربة ، بينما بالنسبة للتحول الكيميائي ، كان التحول الأكبر من 6 هرتز هو القطع. كان على waterLOGSY إظهار تغيير كبير في الإشارة (من سلبي إلى إيجابي في هذه الحالة). إذا كان أي من هذه المعايير الثلاثة إيجابيا ، احتساب جزء على أنه ضربة. يمكن رؤية مثالين على ذلك في الشكل 6.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig06.jpg"> الشكل 6: فحص 1H الذي تم إجراؤه على الحمض النووي الريبي النموذجي ل SARS-CoV-2 الذي يظهر معايير تحديد الضربة. اكتساب ثلاث تجارب مختلفة (1 H T2 CPMG (5/100 مللي ثانية) ، waterLOGSY ، و 1D 1H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يظهر Hit-1 انخفاضا في T2 بنسبة ~ 50٪ و CSP ≥ 6 هرتز. لا يظهر waterLOGSY تغيرا كبيرا بما يكفي في الإشارة ليتم احتسابها أيضا على أنها إيجابية. نظرا لأن تجربتين من أصل ثلاث تجارب إيجابية ، يتم احتساب هذه القطعة على أنها ضربة. بالنسبة ل Hit-2 ، يظهر T2 انخفاضا بنسبة ~ 80٪ من شدة الإشارة ويمكن رؤية تغيير واضح في الإشارة ل waterLOGSY. لا يكفي CSP في هذه الحالة ، ولكن نظرا لأن المعيارين السابقين إيجابيان ، فلا يزال يتم احتسابه على أنه نجاح.

Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

يعد الفحص القائم على الشظايا بواسطة الرنين المغناطيسي النووي طريقة قوية لتحديد روابط الجزيئات الصغيرة للجزيئات الحيوية بسرعة (الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتينات). يتم تقديم البروتوكولات التي تصف إعداد العينات القائم على الأتمتة وتجارب الرنين المغناطيسي النووي وشروط الاستحواذ وسير عمل التحليل. تسمح هذه التقنية بالاستغلال الأمثل لكل من النوى النشطة 1H و 19F NMR للكشف.

فحص الأجزاء القائم على الرنين المغناطيسي النووي في الحد الأدنى من العينة ولكن وضع الأتمتة الأقصى

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

نجري دراسات الرنين المغناطيسي النووي. وهذا يسمح لنا بتحديد تراكيب البروتينات والحمض النووي الريبوزي (RNA) والحمض النووي (DNA) في المحلول. هذه الجزيئات الحيوية هي المكونات ، وهي مكونات خلايانا ، وبروتوكولاتنا التي نقدمها هنا تهتم بفحص الجزيئات الصغيرة وارتباطها بهذه الأهداف.من هذه الجزيئات ، يمكن للكيمياء الطبية والبيولوجيا الهيكلية لدينا أن تستمد أدوية جديدة تكافح الأمراض. الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أن لدينا سيطرة كاملة على جودة الأهداف الجزيئية ، مثل البروتينات ، ولدينا سيطرة كاملة على جودة شظايا الجزيئات الصغيرة والأدوية ، ويمكننا أيضا فحص البروتينات لربطها بمجموعة واسعة من الصلات ، وهي ميزة مقارنة بالمنهجيات الأخرى. لتحضير عينات غربال لقياس الرنين المغناطيسي النووي ، استخدم روبوت تحضير العينات لتوزيع 768 مركبا في ثمانية ألواح من 96 بئرا للحصول على 64 مخاليطا تحتوي على 12 قطعة بتركيز نهائي قدره 4.2 مليمول لكل خليط.انقل الهدف الجزيئي الحيوي محل الاهتمام ، المخفف في مخزن مؤقت مناسب للفحص ، إلى العدد المناسب من أنابيب مغير العينات عالية الإنتاجية NMR ذات الثلاثة ملليمترات المشفرة ، واستخدم الروبوت لنقل 10 ميكرولتر من كل خليط ليجند إلى كل أنبوب من الجزيء الحيوي المستهدف. بعد ذلك ، اطلب من الروبوت مزج الحلول جيدا. للحصول على الرنين المغناطيسي النووي ، قم بتحميل العينة في مقياس الطيف.افتح برنامج مقياس الطيف ، ثم حدد مجموعة المعلمات وتسلسل النبض للتجارب القائمة على الرباط. بالنسبة لجميع التجارب المدرجة ، حدد نحت الإثارة كقمع للمياه. لفحص الفلور -19 ، حدد كل من تجارب 1D و T2.حدد العرض الطيفي إلى 220 جزءا في المليون ، وتردد الإثارة إلى 140 جزءا في المليون ، ووقت التحليل بين ساعة إلى خمس ساعات. بالنسبة إلى T2 ، يجب أن يتناوب وقت CPMG بين 5 و 100 مللي ثانية. سجل تجارب T1r و T2.سجل فرق نقل التشبع ك2D زائف. لمعالجة اثنين من أطياف 1D واحدة ، استخدم وظيفة برنامج الاتحاد الأفريقي ProcStd ، مع أو بدون خيار الاسترخاء. WaterLOGSY هو 1D واحد يجب أن يكون على مراحل مع سلبية لإشارة المذيب.لتحليل بيانات فحص الهيدروجين ، اتبع التعليمات الخاصة بأداة الفحص القائمة على الشظايا لتخزين بيانات الرنين المغناطيسي المغناطيسي الجزيئي الحيوي من حملات الفحص ، بحيث يكون لكل خليط فحص دليله الذي يحتوي فيه دليل فرعي على التجارب المختلفة المقاسة على العينة. قم بتخزين الأطياف المرجعية ، مع حفظ جميع البيانات من العينات بدون الهدف الجزيئي الحيوي ، ولكن مع المخاليط والمركب الفردي في أدلة مختلفة. قم بإنشاء مسار مباشر إلى الدليل الذي يحتوي على البيانات المكتسبة ، وحدد دليل الرنين المغناطيسي النووي الذي يجب أن يكون فيه لجميع المخاليط دليل مميز.تأكد أيضا من نسخ ملفات CSV وشاشة الأجزاء ومستند XML وملفات BAC إلى دليل NMR للبيانات. لاستخدام أداة الغربلة المستندة إلى الأجزاء لعينة تم فحصها، اسحب رمز مشروع الفرز المستند إلى الأجزاء إلى منتصف نافذة التحليل. يجب أن يظهر الرمز إذا تم نسخ مجموعات البيانات المحفوظة مسبقا فيه.يجب أن تفتح نافذة خيارات الفحص المستندة إلى الأجزاء تلقائيا. حدد ملف كوكتيل CSV يحتوي على أسماء الخلطات وأسماء كل جزء وتقسيم كل جزء إلى المزيج. حدد مجلد أطياف ليجند مرجعي مع جميع الأطياف المقاسة للأجزاء الفردية ، وحدد مجلد تجربة فارغ مرجعي ، والذي يحتوي عادة على مجموعات بيانات الخلطات بدون الهدف الذي تم التحقيق فيه.لتحديد ألوان عرض الأطياف والأطياف التي تم فحصها، افتح علامة التبويب أنواع الأطياف وقم بتعيين نوع المواصفات وفقا لبيانات العملية. في علامة التبويب تخطيط العرض، حدد الأطياف التي ستتم مقارنتها وفقا لأنواع المواصفات. ثم انقر فوق موافق لبدء المشروع.أثناء معالجة البيانات ، سيتم فتح نافذة منفصلة مع الجدول الذي يلخص جميع خلطات الكوكتيل وروابط كل مزيج. انقر نقرا مزدوجا فوق خلية لفتح مجموعات البيانات المعنية. قبل تعيين المجلدات ، تأكد من أن القمم المرجعية تتطابق مع بعضها البعض ولها نفس التحول الكيميائي.إذا لوحظت اختلافات ، فافتح علامة التبويب عملية ، واستخدم خيار المعالجة التسلسلية لتصحيحها. للتحليل الأول لمخاليط الفلور -19 ، افتح علامة التبويب تحليل وحدد وظيفة التكامل. تأكد من تحديد منطقة تكامل واضحة لإشارة الفلور -19 المقابلة لكل جزء في الخليط.احفظ مناطق تكامل التصدير لتصدير ملف التكامل للاستخدام في المستقبل، واحفظ أي ملفات تكامل مستخدمة في دليل التثبيت المناسب. بالنسبة لبيانات الفلور-19، افتح مجموعة بيانات مع أو بدون الهدف الذي تم التحقق منه، وضمن علامة التبويب تحليل، انقر فوق تكامل وقراءة مناطق تكامل الاستيراد لتحميل ملف التكامل المقابل في الطيف الحالي. ثم انقر فوق حفظ والعودة لتحديد موقع قائمة بالمناطق المتكاملة في علامة التبويب التكاملات، وانسخ هذه المعلومات إلى جدول بيانات لتحليل المصب.يتم تحليل التركيب الجزيئي أو تكوين الروابط في مكتبة الأجزاء باستخدام برنامج الثقة الجزيئية كما هو موضح ، ويتم تقديم النتائج كمخرجات رسومية. يشير اللون البرتقالي إلى أن الجزء يظهر عدم تناسق في البنية أو التركيز. تشير الآبار ذات اللون الأخضر إلى أن الجزء متسق.في هذا التحليل التمثيلي ، تم تقسيم 103 أجزاء تحتوي على مجموعة واحدة أو عدة مجموعات من الفلور من المكتبة الداخلية إلى خمسة خلطات من 20 إلى 21 جزءا لكل خليط. تم قياس تجارب الاسترخاء المستعرض للفلور -19 لكل خليط يطبق قطارات نبض CPMG. العتبات مفيدة لتعريف الموثق أو الرابط الضعيف أو غير الموثق في الخليط ، كما لوحظ في أطياف بروتين الثيامين التيروزين كيناز A و RNA النموذجية.في هذا التحليل التمثيلي ، أظهرت النتيجة الأولى انخفاضا في T2 بحوالي 50٪ وتحولا كيميائيا أكبر من أو يساوي ستة هرتز. لم يظهر WaterLOGSY تغييرا كبيرا في الإشارة ليتم احتسابها على أنها إيجابية. ومع ذلك ، نظرا لأن تجربتين من أصل ثلاث تجارب كانت إيجابية ، فقد تم احتساب هذه القطعة على أنها ضربة.بالنسبة للضربة الثانية ، أظهر T2 انخفاضا بنسبة 80٪ تقريبا في شدة الإشارة. كما لوحظ تغيير واضح في الإشارة ل WaterLOGSY. لم يكن التحول الكيميائي كافيا في هذه التجربة ، ولكن نظرا لأن المعيارين السابقين كانا إيجابيين ، فقد تم احتسابه على أنه نجاح.الهدف النهائي من هذه الأساليب هو تطوير عقاقير جديدة أو مثبطات عالية التقارب ، على سبيل المثال ، الإنزيمات ، وفي هذا ، تتولى الكيمياء الطبية وتوليف هذه الجزيئات الجديدة ، ولكن بيولوجيا البنية ، التقنيات التي تطبقها هنا يمكن أن توجه الكيمياء الطبية وتجعل هذا النهج أسرع.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

في الوقت الحقيقي تتبع فصل جزء من الحمض النووي عن طريق الهاتف الذكي

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

حامل عينة الكل في واحد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع الحد الأدنى من تشتت الخلفية

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

الفحص الحركي للنشاط النواسي باستخدام مجسات الحمض النووي

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

الفحص الخاص بمثبطات بيروفوسفاتاسي الغشائية المربوطة بغشاء الثموغا

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

سير العمل وأدوات لفحص الأجزاء البلورية في هيلمهولتز-زينتروم برلين

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...