Name: nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode
Uploaded: 2021-06-04T15:00:00
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这项工作得到了iNEXT-Discovery的支持，项目编号为871037，由欧盟委员会的地平线2020计划资助。

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基于 NMR 的片段/药物筛选的多功能性。BMRZ已成功实施了最先进的自动化核磁共振仪器以及STD-NMR，waterLOGSY和松弛实验，以鉴定药物发现的各种亲和力范围内的片段。安装的硬件包括一个高通量样品制备机器人和与 600 MHz 光谱仪相关的高通量样品存储、更换器和数据采集单元。最近购买的用于 1H、19F、13C 和 15N 的低温探头可确保建议测量所需的灵敏度，并允许在 19F 检测期间进行 1 H （1） 去耦。该探头连接到最新一代的核磁共振控制台，可以使用布鲁克的高级软件工具，包括CMC-q、CMC-assist、CMC-se和FBS（包含在TopSpin中）。基于片段的筛选（FBS）工具包含在最新版本的TopSpin中，有助于分析高通量数据，包括STD，waterLOGSY，T2 / T1r-弛豫实验。液体1D 1H样品收集可以通过使用样品填充机器人以自动方式填充到NMR管中。 通常，在大约两个小时内填充96个管（3毫米）的块。96孔板架直接放置在HT自动进样器中，该自动进样器读取模块的条形码并将NMR管分配给由自动化软件（IconNMR）控制的实验。五个 96 孔板架可以同时在 HT 自动进样器中存储和编程。每个机架的温度可以单独控制和调节。此外，在测量前，可以将每个单独的样品预处理（预热和管干燥以去除冷凝湿度）到所需的温度。
适用于广泛的应用。 这种基于核磁共振的自动化筛选的广泛应用之一是鉴定和开发与生物大分子靶标（DNA/RNA/蛋白质）结合的新型配体。这些配体可以包括通常非共价结合的正位和变构抑制剂。此外，通过核磁共振进行的FBDD通常用作选择有前途的化合物的第一步，要满足的要求是足够数量的生物分子靶标的可用性。这一目标分为两个主要任务。
任务一是开发和表征内部片段库，原因如下：1000多个片段的初始和定期质量控制、表征和定量;测定片段在针对每个靶标优化的缓冲液中的溶解度，特别是针对蛋白质靶标;以及建立几个文库以容纳不同的支架并扩展到其他大分子类别。任务二是通过核磁共振整合基于片段的药物设计（FBDD）的工作流程，使用：自动1D配体观察筛选（观察到1H和 19F）;自动替代测定（与（天然）配体竞争实验）以区分正位和变构结合;具有多个片段的自动二次筛选;自动2D蛋白筛选，以及利用EU-OPENSCREEN文库或任何其他文库围绕初始命中对一组衍生物进行二次筛选;以及针对所选靶标对FDA图书馆进行重新剖析筛选。
此外，可以进行各种细胞系（疾病相关）的代谢分型，以揭示连接细胞周期控制和代谢的调节机制。此外，还可以在 体内 和体外对RNA/DNA/蛋白质调控元件进行功能表征，以优化构建 体 /结构域优化（结构研究的稳定性优化（缓冲液、pH、温度和盐筛选），并将基于NMR的片段筛选扩展到膜蛋白和固有无序蛋白，这通常是其他技术无法实现的。
局限性。 使用 19F 和 1H 片段库有其优点和缺点，下文将很少提及。与 1H 相比，19F 测量的最大优势是实际测量时间和后续分析的速度，因为混合物包含的片段数量几乎是其两倍，并且必须进行的实验更少。后续分析对于19F筛选也更容易，因为没有缓冲液的干扰，此外，对于最佳设计的片段混合物，提供了更宽的化学位移范围，几乎没有信号重叠。光谱本身大大简化，通常每个片段只有一个或两个信号，具体取决于氟原子的数量。因此，这些光谱的分析可以自动化，再次减少时间。这是以化学多样性为代价的，至少对于本研究中使用的图书馆而言。由于只有~13%的文库包含19 F，但自然所有这些都可用于1H筛选，因此19F筛选片段的多样性会更低。这可以通过专门设计的19F文库来规避，这些文库具有更多的片段和更大的化学多样性。19F筛选的另一个缺点是每个片段的信号数量少。片段通常由一个以上的氢原子组成。因此，1H观察到的筛选实验可以依靠同一片段的不同信号来检测结合。这在识别1H筛选的命中时提供了更高的置信度，而19F筛选必须依赖于每个片段给出的一个或两个信号。
本文详细介绍了基于核磁共振的现代自动化片段筛选仪器、软件和分析方法及其协议。安装的硬件包括一个高通量样品制备机器人和一个与 600 MHz 光谱仪相关的高通量样品存储、更换器和数据采集单元。最近安装的 1 H、19F、13C 和 15N 低温探头可确保建议测量所需的灵敏度，并允许在 19F 检测期间进行 1H 去耦。此外，最新一代的核磁共振控制台提供了使用高级分析软件辅助采集和动态分析的可能性。上面讨论的技术、工作流程和所描述的协议应该会为追求核磁共振FBS的用户带来显著的成功。

基于片段的筛选现在是一种常用的方法，用于鉴定相当简单和低分子量的分子（MW <250 Da），这些分子与包括蛋白质，DNA和RNA在内的大分子靶标的结合较弱。来自主筛选的初始命中作为对市售的较大命中类似物进行二次筛选的基础，然后利用基于化学的片段生长或连接策略。对于成功的基于片段的药物发现（FBDD）平台，通常需要一种强大的生物物理方法来检测和表征弱命中，片段库，生物分子靶标和后续化学策略。药物发现活动中常用的四种生物物理方法是热位移测定、表面等离子体共振（SPR）、晶体学和核磁共振波谱（NMR）。
核磁共振波谱在FBDD的不同阶段显示出不同的作用。除了确保溶解在优化缓冲液系统中的片段库中片段的化学纯度和溶解度外，配体观察的NMR实验还可以检测片段与低亲和力靶标的结合，并且靶标观察到的NMR实验可以描绘片段的结合表位，从而实现详细的构效关系研究。在表位作图中，基于NMR的化学位移变化不仅可以识别正位结合位点，还可以识别可能神秘的变构位点，并且只能在生物分子靶标的所谓激发构象状态下才能访问。如果生物分子靶标已经结合内源性配体，则通过执行基于NMR的竞争实验，可以很容易地将鉴定的片段命中分为变构或正位。确定配体-靶点相互作用的解离常数（KD）是FBDD过程中的一个重要方面。基于NMR的化学位移滴定，无论是配体还是靶标，都可以很容易地进行，以确定 KD。核磁共振的一个主要优点是相互作用研究是在溶液中和接近生理条件进行的。因此，可以探测用于分析配体/片段与其靶标相互作用的所有构象状态。此外，基于核磁共振的方法不仅仅限于筛选折叠良好的可溶性蛋白质，而且还被用于适应更大的靶标空间，包括DNA、RNA、膜结合和固有无序蛋白质1。
片段库是 FBDD 流程中不可或缺的一部分。通常，片段充当初始前体，最终成为为生物靶标开发的新抑制剂的一部分（亚结构）。据报道，几种药物（维奈托克2，维莫非尼3，艾达非替尼4，Pexidartnib5）已以片段形式开始，现已成功用于临床。通常，片段是具有高水溶性和稳定性的低分子量（<250Da）有机分子。一个精心制作的片段库通常包含几百个片段，已经可以保证对化学空间的有效探索。片段库的一般组成随着时间的推移而发展，通常是通过将已知药物解剖成更小的片段或计算设计得出的。这些不同的片段库主要包含扁平芳烃或杂原子，并遵循Lipinski规则5 6或当前商业趋势规则 3 7，但避免反应性基团。一些片段库也衍生或由高度可溶的代谢物、天然产物和/或其衍生物组成8。大多数片段库带来的一个普遍挑战是易于下游化学。
法兰克福歌德大学生物分子磁共振中心（BMRZ）是iNEXT-Discovery（用于转化研究发现的核磁共振，EM和X射线基础设施）的合作伙伴，iNEXT-Discovery是一个为来自所有生物化学和生物医学研究领域的所有欧洲研究人员提供结构研究基础设施的联盟。在iNEXT于2019年结束的先前计划中，制作了一个由768个片段组成的片段库，旨在覆盖广阔的化学空间，以实现“最小片段和最大多样性”。此外，与任何其他片段库不同，iNEXT片段库也是基于“准备片段”的概念设计的，旨在简化复杂、高亲和力配体的下游合成，此后称为内部文库（Diamond、Structural Genomic Consortium和iNEXT）。
通过核磁共振建立FBDD需要人力、知识和仪器。在BMRZ，已经开发了优化的工作流程，以支持通过NMR进行片段筛选的技术援助。这些包括片段库 9的质量控制和溶解度评估，所选靶标的缓冲液优化，基于 1H或19 F-观察的 1D配体筛选，区分正位和变构结合的竞争实验，基于2D的靶标观察NMR实验用于表位定位，以及表征与初始片段命中的二级衍生物集的相互作用。BMRZ已经建立了用于分析小分子-蛋白质相互作用的自动化程序，正如之前在文献 10，11中所讨论的那样，并为基于NMR的片段筛选提供了所有必要的自动化基础设施。它已经实施了饱和转移差核磁共振（STD-NMR），通过梯度光谱（waterLOGSY）观察的水配体，以及基于Carr-Purcell-Meiboom-Gill（基于CPMG）的弛豫实验，以鉴定各种亲和力范围内的片段，以及最先进的自动化核磁共振仪器和用于药物发现的软件。虽然基于NMR的片段筛选已经很好地用于蛋白质，但这种方法不太常用于寻找与RNA和DNA相互作用的新配体。BMRZ已经为能够识别小分子RNA/DNA相互作用的新方案建立了概念验证。在本贡献的以下部分中，报告了蛋白质和RNA样品筛选程序的应用，以了解生物大分子研究中广泛用户群的既定方案。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Avance III HD</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>600 MHz NMR Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes</td>
			<td>3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Barcoded Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix SepraSeal und DuraSeal&#38;</td>
			<td>4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SampleJet</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>HT Sample Changer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SamplePro Tube</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Pipetting Robot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode

基于片段的筛选（FBS）在学术界和工业界的药物发现过程中都是一个经过充分验证和接受的概念。基于核磁共振的片段筛选的最大优势在于它不仅能够检测超过7-8个数量级亲和力的结合剂，而且还能够监测片段的纯度和化学质量，从而产生高质量的命中率和最小的假阳性或假阴性。FBS的先决条件是对片段库进行初始和定期质量控制，确定片段在相关缓冲液中的溶解度和化学完整性，并建立多个文库以覆盖不同的支架以适应各种大分子靶标类别（蛋白质/RNA/DNA）。此外，需要在生物构建/片段空间、条件空间（缓冲液、添加剂、离子、pH 和温度）和配体空间（配体类似物、配体浓度）水平上对样品数量、采集和分析速度进行广泛的基于 NMR 的筛选方案优化。至少在学术界，到目前为止，这些筛选工作是以非常有限的方式手动进行的，导致筛选基础设施的可用性有限，不仅在药物开发过程中，而且在化学探针开发的背景下。为了经济地满足要求，提出了先进的工作流程。它们利用最新的先进硬件，通过这些硬件，液体样品收集可以以温控方式自动填充到NMR管中。 1然后在给定温度下收集基于H / 19F NMR配体的光谱。高通量自动进样器（HT 自动进样器）可在温控块中处理 500 多个样品。这与先进的软件工具相结合，加快了数据采集和分析的速度。此外，还描述了在蛋白质和RNA样品上应用筛选程序，以了解生物大分子研究中广泛用户群的既定方案。

片段库的质量控制 来自内部文库的片段以 50 mM 储备溶液的形式在 90% d6-DMSO 和 10% D 2 O 中交付（10% 的 D2O 可确保由于重复冻融循环而导致的化合物降解最小化14）。单个化合物样品由 1 mM 配体在 50 mM 磷酸盐缓冲液（25 mM KPi pH 6.2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl 2）、pH 6.0 在 90% H 2 O/9% D2O/1% d6-DMSO 中组成。1在500/600 MHz核磁共振波谱仪上测量iNEXT文库中片段的H-NMR实验。该数据进一步用于使用CMC-q软件在1H筛选活动中鉴定单个化合物，该软件允许用户以自动方式完全获取光谱，并评估分析插件CMC-a片段的质量（溶解度和完整性）。CMC-a 的自动分析结果显示为图形输出，类似于图 3 所示。图形输出显示了 96 孔板的表示。红色圆圈表示该片段在结构或浓度上显示不一致。绿色孔表示片段一致。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig03.jpg"> 图 3：片段库的质量控制。 基于 CMC-a 的自动输出的示意图。评估碎片特性，如浓度和结构完整性。绿色代表一致，在这种情况下橙色代表不一致。不一致的片段按照所示的工作流程手动修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
在DMSO和缓冲液中，大约65%和35%的片段分别被归类为一致和不一致。此外，30%的不一致分类配体在仔细手动检查光谱9后变得一致。
19F 混合料设计 来自内部库中的103个含有一个或多个氟基团的片段被分成5种混合物（A，B，C，D，E）。每个混合物有 20 到 21 个片段。在这种情况下，必须仔细设计混合物以避免信号重叠。 19测量施加CPMG脉冲序列的每种混合物的F横向弛豫实验。这些实验可以通过改变弛豫延迟来修改。混合物A-E的 19F化学位移如图 4所示。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig04.jpg"> 图 4：来自内部库中混合物样品的 19F 1D-NMR 波谱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
样品制备 19F筛选程序中的样品制备既可以手动完成，也可以使用移液机器人进行自动移液。每种混合物中的片段在90%d6-DMSO和10%D 2 O中的浓度为2.5mM。筛选样品的最终体积为 170 μL，含 5% D2O 作为锁定剂。将每种混合物移液两次，一次在含有溶液（无靶标）的缓冲液中，一次移入含有靶标的缓冲溶液中。将靶标和片段的比例设置为1：1，最终靶标/配体浓度为50μM。 此外，对照样品是筛选缓冲液中不含混合物的靶标生物分子，以确保靶标完整性，以及仅使用缓冲液和D2O的对照样品，以确保缓冲液质量。
19 架 F-1D和 19架 F-CPMG-T2 的核磁共振筛选数据是第 3.1 节中所述的测量值。例如，在RNA的情况下，为缓冲液中的单个目标样品采集了跳回波序列（pp = zggpjrse，15）。
数据分析 19F筛选程序应用于来自大肠杆菌的TPP核糖开关thiM和来自结核分枝杆菌的蛋白酪氨酸激酶（PtkA）以及其他几个靶点16。19F 筛选文库有 103 个片段，分为 5 个混合物，从混合物 A 到 E 标记，筛选样品的制备可以手动进行，无需使用样品移液机器人。将含有40μM thiM RNA的溶液（缓冲条件）与混合物中的3.2μL混合。制备进一步的对照样品，仅由缓冲液、含有5%DMSO的缓冲液（先前确保生物大分子在所需DMSO浓度存在下的稳定性）和RNA缓冲液组成。制备这13个筛选样品并将其转移到3 mm NMR管中。扫描NMR管的条形码，并根据上述在298 K下进行的19F NMR实验测量存在和不存在RNA的每种混合物以及对照样品。完成测量后，通过比较所有样品额外测量的1H 1D实验中所有DMSO峰的线展宽和强度损失，监测适当的匀场和水抑制。分别使用TopSpin中先前制备的自动化宏对获得的CPMG T219F弛豫谱进行处理。按照协议部分中的说明进行数据分析。通过设置正确的条件和阈值，可以使用预制电子表格或任何类似程序快速轻松地评估从 TopSpin 获得的积分数据（按照协议中的说明）。如前所述，阈值在定义绑定器、弱绑定器或非绑定器时很有用。图5分别显示了ThM RNA和PtkA的CPMG光谱的典型结果。在有些情况下，需要进一步的专家修订。 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig05.jpg"> 图 5：从 19F CPMG NMR 波谱中切出，显示了基于 CPMG 的实验的不同延迟时间获得的强度变化。 （A）在对来自大肠杆菌的TPP核糖开关thiM RNA进行的基于19F片段的筛选中粘合剂（命中）和非粘合剂的表示。（B）在对结核分枝杆菌的PtkA进行的基于19F片段的筛选中粘合剂和非粘合剂的表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
1小时筛选
混合料设计 使用的内部文库非常多样化，以至于在 1H筛选目的中没有进行混合物设计。这意味着通过随机选择12种混合物混合在一个混合物中来制备64种混合物。
样品制备 对于示例性SARS-CoV-2 RNA的 1H筛选，使用移液机器人进行自动移液以制备样品。每种混合物中的片段在90%d6-DMSO和10%D 2 O中的浓度为4.2mM。筛选样品的最终体积为 200 μL，含 5% D2O 作为锁定剂。在pH 6.2下移取64个样品，每个样品在25 mM KPi，50 mM KCl中含有不同的混合物，不含目标RNA。分别用靶RNA移液64个样品，每个样品含有不同的混合物。将RNA：配体比例设置为1：20，导致RNA浓度为10μM，配体浓度为200μM。
数据分析 对于 1H分析，使用了TopSpin中的FBS工具。为了确定片段是否被击中，进行了一维化学位移，waterLOGSY和T2 弛豫实验。对于T2 松弛，强度降低超过30%被视为命中，而对于化学位移，大于6 Hz的偏移是截止值。waterLOGSY必须显示显着的信号变化（在这种情况下从负到正）。如果这三个标准中的任何两个是肯定的，则片段被视为命中。 图 6 中可以看到两个示例。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig06.jpg"> 图 6：对显示命中确定标准的示例性 SARS-CoV-2 RNA 进行 1小时筛选。 采集三种不同的实验（1H T2 CPMG （5/100 ms）、waterLOGSY 和 1D 1H）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
Hit-1显示T2 降低~50%，CSP≥6 Hz。waterLOGSY没有显示出足够显着的信号变化，也不能算作阳性。由于三分之二的实验是阳性的，因此此片段被视为命中。对于Hit-2，T2 显示出~80%的信号强度下降，并且可以看到waterLOGSY的明显信号变化。在这种情况下，CSP 是不够的，但由于前两个标准是肯定的，它仍然被视为命中。

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NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

核磁共振基于片段的筛选是快速鉴定生物大分子（DNA、RNA或蛋白质）的小分子结合剂的可靠方法。介绍了描述基于自动化的样品制备、NMR 实验和采集条件以及分析工作流程的协议。该技术允许对 1H和 19F NMR活性细胞核进行最佳利用以进行检测。

基于核磁共振的片段筛选，样品最少，自动化程度最高

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

我们进行核磁共振研究。这使我们能够确定溶液中蛋白质、RNA 和 DNA 的结构。这些生物分子是成分，是我们细胞的组成部分，我们在这里介绍的协议涉及小分子的筛选及其与这些靶标的结合。从这些分子中，我们的药物化学和结构生物学可以衍生出对抗疾病的新药。我们技术的主要优点是我们可以完全控制分子靶标的质量，如蛋白质，我们可以完全控制小分子片段和药物的质量，我们还可以筛选蛋白质以结合广泛的亲和力，与其他方法相比，这是一个优势。要制备用于 NMR 测量的筛选样品，请使用样品制备机器人将 768 种化合物分配到 8 个 96 孔板中，以获得包含 12 个片段的 64 种混合物，每种混合物的最终浓度为 4.2 毫摩尔。将感兴趣的生物分子靶标（在适当的筛选缓冲液中稀释）转移到适当数量的条形码三毫米NMR高通量进样器管中，并使用机器人将10微升每种配体混合物转移到目标生物分子的每个管中。然后，让机器人彻底混合溶液。对于核磁共振采集，将样品装入波谱仪。打开光谱仪软件，然后选择基于配体的实验的参数集和脉冲序列。对于所有列出的实验，选择激发雕刻作为水抑制。对于氟-19筛选，请选择1D和T2实验。选择光谱宽度为百万分之220，激励频率为百万分之140，分析时间在1到5小时之间。对于 T2，CPMG 时间应在 5 到 100 毫秒之间交替。记录 T1r 和 T2 实验。将饱和度传递差记录为伪 2D。要处理两个单一的一维光谱，请使用 AU 程序 ProcStd 函数，带或不带松弛选项。WaterLOGSY是单个1D，应与溶剂信号的负值进行相位。要分析氢筛选数据，请按照基于片段的筛选工具的说明存储来自筛选活动的生物分子磁共振NMR数据，以便每个筛选混合物都有其目录，其中子目录包含对样品测量的不同实验。存储参考光谱，保存从样品中保存的所有数据，没有生物分子靶标，但混合物和单一化合物位于不同的目录中。创建包含采集数据的目录的直接路径，并选择所有混合物都应具有不同目录的NMR目录。确保 CSV、片段屏幕、XML 文档和 BAC 文件也复制到数据的 NMR 目录中。要对筛选样品使用基于片段的筛选工具，请将基于片段的筛选项目符号拖动到分析窗口的中间。如果将以前保存的数据集复制到其中，则应显示该符号。基于片段的筛选选项窗口应自动打开。选择一个 CSV 鸡尾酒文件，其中包含混合物的名称、每个片段的名称以及每个片段在混合物中的划分。定义一个参考配体谱图文件夹，其中包含单个片段的所有测量谱图，并定义一个参考空白实验文件夹，该文件夹通常包含没有研究靶标的混合物数据集。要定义所调查的光谱和光谱显示颜色，请打开〖光谱类型〗选项卡并根据过程数据设置等级库类型。在“显示布局”选项卡中，定义将根据等级库类型进行比较的光谱。然后，单击“确定”启动项目。在处理数据时，将打开一个单独的窗口，其中的表格汇总了所有鸡尾酒混合物和每种混合物的配体。双击单元格以打开相应的数据集。在分配粘合剂之前，请确保参比峰相互匹配并具有相同的化学位移。如果观察到差异，请打开“进程”选项卡，然后使用串行处理选项进行更正。要对氟-19混合物进行首次分析，请打开“分析”选项卡并选择积分函数。确保为混合物中的每个片段定义相应的氟-19信号的清晰积分区域。保存导出集成区域以导出集成文件以供将来使用，并将所有已使用的集成文件保存在相应的安装目录中。对于氟-19数据，打开有或没有被调查目标的数据集，然后在分析选项卡下，单击积分并读取导入积分区域，将相应的积分文件加载到当前光谱中。然后，单击保存并返回以在积分选项卡中找到集成区域的列表，并将此信息复制到电子表格中以进行下游分析。如图所示，使用分子置信度软件分析片段库中配体的分子结构或组成，并将结果显示为图形输出。橙色表示片段在结构或浓度上表现出不一致。绿色孔表明碎片是一致的。在这项代表性分析中，来自内部库中的 103 个含有一个或多个氟基团的片段被分成 5 个混合物，每种混合物 20 至 21 个片段。对施加CPMG脉冲序列的每种混合物测量氟-19横向弛豫实验。阈值可用于定义混合物中的结合剂、弱结合剂或非结合剂，如在这些典型的硫胺素蛋白酪氨酸激酶 A 和 RNA 谱图中观察到的那样。在这项代表性分析中，命中一显示T2降低约50%，化学位移大于或等于6赫兹。WaterLOGSY在信号上没有表现出显着变化，可以算作阳性。然而，由于三分之二的实验是阳性的，这个片段被算作命中。对于第二次命中，T2的信号强度降低了约80%。在WaterLOGSY上也观察到了明显的信号变化。在这个实验中，化学转变是不够的，但由于前两个标准是积极的，它仍然算作一个命中。这些方法的最终目标是开发新药或高亲和力抑制剂，例如酶，在这种情况下，药物化学接管并合成这些新分子，但结构生物学，你在这里应用的技术可以指导药物化学并使这种方法更快。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

自动声胶肽受体激动剂的效价测定测定的连续稀释

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

科研

生物化学

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

通过智能手机实时跟踪DNA片段分离

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

RNA 结合区质量谱鉴定的样品制备

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

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一种简单的高通量化学筛选方法在秀丽线虫中的应用

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

用于大分子 X 射线晶体学的一体式样品支架,具有最小的背景散射

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

使用核酸探针进行核酸活性的动力学筛选

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Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

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热通菌膜-双磷酶抑制剂的筛选

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

蛋白质组学设施提交和后续数据分析的TMT样品制备

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

赫尔姆霍尔茨-曾特鲁姆柏林水晶碎片筛选工作流程和工具

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm 光束线微晶样品制备管道

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...