Name: nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode
Uploaded: 2021-06-04T15:00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

Dit werk is ondersteund door iNEXT-Discovery, projectnummer 871037, gefinancierd door het Horizon 2020-programma van de Europese Commissie.

<ol>
	<li>Yanamala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-Based+Screening+of+Membrane+Protein+Ligands.">NMR-Based Screening of Membrane Protein Ligands.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 75, 237-256 (2010).</li><li>Souers, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABT-199,+a+potent+and+selective+BCL-2+inhibitor,+achieves+antitumor+activity+while+sparing+platelets.">ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets.</a> Nature Medicine. 19, 202-208 (2013).</li><li>Su, M. C., Te Chang, C., Chu, C. H., Tsai, C. H., Chang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atypical+RNA+pseudoknot+stimulator+and+an+upstream+attenuation+signal+for+-1+ribosomal+frameshifting+of+SARS+coronavirus.">An atypical RNA pseudoknot stimulator and an upstream attenuation signal for -1 ribosomal frameshifting of SARS coronavirus.</a> Nucleic Acids Research. 33, 4265-4275 (2005).</li><li>Perera, T. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+&amp;+pharmacological+characterization+of+JNJ-42756493+(Erdafitinib),+a+functionally+selective+small-molecule+FGFR+family+inhibitor.">Discovery &amp; pharmacological characterization of JNJ-42756493 (Erdafitinib), a functionally selective small-molecule FGFR family inhibitor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16, 1010-1020 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+pharmacology+of+a+highly+specific+dual+FMS+and+KIT+kinase+inhibitor.">Design and pharmacology of a highly specific dual FMS and KIT kinase inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5689-5694 (2013).</li><li>Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., Feeney, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+computational+approaches+to+estimate+solubility+and+permeability+in+drug+discovery+and+development+settings.">Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 23, 3-25 (1997).</li><li>Congreve, M., Carr, R., Murray, C., Jhoti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+'Rule+of+Three'+for+fragment-based+lead+discovery.">A 'Rule of Three' for fragment-based lead discovery.</a> Drug Discovery Today. 8, 876-877 (2003).</li><li>Ch&#225;vez-Hern&#225;ndez, A. L., S&#225;nchez-Cruz, N., Medina-Franco, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+Library+of+Natural+Products+and+its+Comparative+Chemoinformatic+Characterization.">A Fragment Library of Natural Products and its Comparative Chemoinformatic Characterization.</a> Molecular Informatics. 39, 2000050 (2020).</li><li>Sreeramulu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+quality+control+of+fragment+libraries+for+screening.">NMR quality control of fragment libraries for screening.</a> Journal of Biomolecular NMR. , 00327-00329 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+NMR+Fragment+Based+Screening+Identified+a+Novel+Interface+Blocker+to+the+LARG/RhoA+Complex.">Automated NMR Fragment Based Screening Identified a Novel Interface Blocker to the LARG/RhoA Complex.</a> PLoS One. 9, 88098 (2014).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Efficient+Fragment-Based+Lead+Generation+by+Fully+Automated+Processing+and+Analysis+of+Ligand-Observed+NMR+Binding+Data.">Fast and Efficient Fragment-Based Lead Generation by Fully Automated Processing and Analysis of Ligand-Observed NMR Binding Data.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 3303-3310 (2016).</li><li>Cox, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP(2),+an+atypical+bromodomain.">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).</li><li>Hwang, T. L., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Suppression+That+Works.+Excitation+Sculpting+Using+Arbitrary+Wave-Forms+and+Pulsed-Field+Gradients.">Water Suppression That Works. Excitation Sculpting Using Arbitrary Wave-Forms and Pulsed-Field Gradients.</a> Journal of Magnetic Resonance, Series A. 112, 275-279 (1995).</li><li>Gossert, A. D., Jahnke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+in+drug+discovery:+A+practical+guide+to+identification+and+validation+of+ligands+interacting+with+biological+macromolecules.">NMR in drug discovery: A practical guide to identification and validation of ligands interacting with biological macromolecules.</a> Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 97, 82-125 (2016).</li><li>Sklenar, V., Bax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+water+suppression+technique+for+generating+pure-phase+spectra+with+equal+excitation+over+a+wide+bandwidth.">A new water suppression technique for generating pure-phase spectra with equal excitation over a wide bandwidth.</a> Journal of Magnetic Resonance. 75, 378-383 (1987).</li><li>Binas, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=19F+NMR-Based+Fragment+Screening+for+14+Different+Biologically+Active+RNAs+and+10+DNA+and+Protein+Counter-Screens.">19F NMR-Based Fragment Screening for 14 Different Biologically Active RNAs and 10 DNA and Protein Counter-Screens.</a> ChemBioChem. , (2020).</li></ol>

Veelzijdigheid van de NMR-gebaseerde fragment/drug screening. BMRZ heeft met succes state-of-the-art geautomatiseerde NMR-instrumentatie geïmplementeerd, evenals STD-NMR, waterLOGSY en ontspanningsexperimenten om fragmenten te identificeren binnen een breed scala aan affiniteitsregimes voor het ontdekken van geneesmiddelen. De geïnstalleerde hardware omvat een high-throughput monstervoorbereidingsrobot en high-throughput monsteropslag, wisselaar en data-acquisitie-eenheid gekoppeld aan een 600 MHz spectrometer. Een recent aangeschafte cryogene sonde voor 1 H, 19 F, 13C en 15N zorgt voor de vereiste gevoeligheid voor de voorgestelde metingen en maakt 1H (1) ontkoppeling mogelijk tijdens 19F detectie. Deze sonde is aangesloten op de nieuwste generatie NMR-console die de mogelijkheid biedt om de geavanceerde softwaretools van Bruker te gebruiken, waaronder CMC-q, CMC-assist, CMC-se en FBS (inbegrepen in TopSpin). De fragment-based screening (FBS) tool is opgenomen in de nieuwste versie van TopSpin en helpt bij het analyseren van de high-throughput data bestaande uit STD, waterLOGSY, T2/T1r-relaxatie experimenten. De vloeibare 1D 1H monsterverzameling kan op geautomatiseerde wijze in de NMR-buizen worden gevuld met behulp van de monstervulrobot. Meestal wordt een blok van 96 buizen (3 mm) in ongeveer twee uur gevuld. De 96-well-plate-racks zijn direct geplaatst in de HT-monsterwisselaar, die de barcode van het blok leest en de NMR-buizen toewijst aan de experimenten die worden bestuurd door de automatiseringssoftware (IconNMR). Vijf 96-well-plate-racks kunnen tegelijkertijd in de HT-monsterwisselaar worden opgeslagen en geprogrammeerd. De temperatuur van elk van de afzonderlijke racks kan afzonderlijk worden geregeld en geregeld. Bovendien kan elk afzonderlijk monster vóór de meting worden voorgeconditioneerd (voorverwarmen en buisdrogen voor het verwijderen van gecondenseerde vochtigheid) tot de gewenste temperatuur.
Geschikt voor een breed scala aan toepassingen. Een van de brede toepassingen van deze geautomatiseerde NMR-gebaseerde screening is het identificeren en ontwikkelen van nieuwe liganden die binden aan een biomacromoleculair doelwit (DNA/RNA/Eiwitten). Deze liganden kunnen orthosterische en allosterische remmers bevatten die meestal niet-covalent binden. Verder wordt FBDD door NMR meestal gebruikt als een eerste stap om veelbelovende verbindingen te selecteren, de vereisten waaraan moet worden voldaan, zijn beschikbaarheid van het biomoleculaire doelwit in voldoende hoeveelheden. Deze doelstelling is verdeeld in twee grote taken.
Taak één is het ontwikkelen en karakteriseren van een interne fragmentenbibliotheek om de volgende redenen: initiële en periodieke kwaliteitscontrole, karakterisering en kwantificering van meer dan 1000 fragmenten; bepaling van de oplosbaarheid van de fragmenten in buffers die voor elk doelwit zijn geoptimaliseerd, met name voor eiwitdoelen; en de oprichting van verschillende bibliotheken om verschillende steigers te huisvesten en uit te breiden naar andere macromolecuulklassen. Taak twee is het integreren van workflows voor fragment-based drug design (FBDD) door NMR met behulp van: geautomatiseerde 1D-ligand geobserveerde screening (1H en 19F waargenomen); geautomatiseerde vervangingstesten (competitie-experimenten met (natuurlijk) ligand) om orthosterische en allosterische binding te onderscheiden; geautomatiseerde secundaire screenings met meerdere fragmenten; geautomatiseerde 2D-eiwitscreening en secundaire screening van een reeks derivaten rond een eerste treffer waarbij gebruik wordt gemaakt van de EU-OPENSCREEN-bibliotheek of een andere bibliotheek; en herprofilering screening van FDA-bibliotheek tegen de gekozen doelen.
Bovendien kan metabotypering van verschillende cellijnen (ziekterelevant) worden uitgevoerd om de regulerende mechanismen te ontrafelen die de controle van de celcyclus en het metabolisme met elkaar verbinden. Ook is er functionele karakterisering van RNA / DNA / eiwitregulatie-elementen in vivo en in vitro voor optimalisatie van construct / domeinoptimalisatie (stabiliteitsoptimalisatie voor structureel onderzoek (buffer-, pH-, temperatuur- en zoutscreening), en een uitbreiding van NMR-gebaseerde fragmentscreening naar membraaneiwitten en intrinsiek ongeordende eiwitten, die over het algemeen ontoegankelijk zijn voor andere technieken.
Beperkingen. Het gebruik van 19F- en 1H-fragmentenbibliotheken heeft zijn voor- en nadelen, waarvan er enkele in het volgende zullen worden genoemd. Het grootste voordeel van 19F versus 1H-metingen is de snelheid van zowel de werkelijke meettijd als de daaropvolgende analyse, omdat de mengsels bijna het dubbele aantal fragmenten bevatten en er minder experimenten hoeven te worden uitgevoerd. De vervolganalyse is ook eenvoudiger voor 19F-screening, omdat er geen interferentie van buffers is en bovendien een breder chemisch verschuivingsbereik biedt met bijna geen signaaloverlapping voor een optimaal ontworpen fragmentmengsel. De spectra zelf zijn sterk vereenvoudigd en hebben meestal slechts één of twee signalen per fragment, afhankelijk van het aantal fluoratomen. De analyse van deze spectra kan daarom worden geautomatiseerd, waardoor de tijd opnieuw wordt verkort. Dit gaat ten koste van de chemische diversiteit, althans voor de bibliotheek die in deze studie wordt gebruikt. Omdat slechts ~ 13% van de bibliotheek 19 F bevat, maar ze natuurlijk allemaal bruikbaar zijn in 1H-screening, zal de diversiteit van de 19F-screeningsfragmenten lager zijn. Dit kan worden omzeild met behulp van speciaal ontworpen 19F-bibliotheken met meer fragmenten en een grotere chemische diversiteit. Een ander nadeel voor 19F-screening is het lage aantal signalen per fragment. Fragmenten bestaan over het algemeen uit meer dan één waterstofatoom. Daarom kunnen 1H geobserveerde screeningsexperimenten vertrouwen op verschillende signalen voor hetzelfde fragment voor het detecteren van binding. Dit geeft een hogere mate van vertrouwen bij het identificeren van treffers voor de 1H-screening, terwijl de 19F-screening moet vertrouwen op de één of twee signalen die per fragment worden gegeven.
Een gedetailleerd verslag over de moderne geautomatiseerde NMR-gebaseerde fragmentscreening-instrumentatie, software en analysemethoden en protocollen daarvan is gepresenteerd. De geïnstalleerde hardware omvat een high-throughput monstervoorbereidingsrobot en een high-throughput monsteropslag, wisselaar en data-acquisitie-eenheid gekoppeld aan een 600 MHz spectrometer. Een recent geïnstalleerde cryogene sondekop voor 1 H, 19 F, 13C en 15N zorgt voor de vereiste gevoeligheid voor de voorgestelde metingen en maakt 1H ontkoppeling mogelijk tijdens 19F detectie. Verder biedt de nieuwste generatie NMR-console de mogelijkheid om geavanceerde analytische software te gebruiken voor het ondersteunen van acquisitie en on-the-fly analyse. De hierboven besproken technologie, workflows en de beschreven protocollen zouden opmerkelijk succes moeten bevorderen voor gebruikers die FBS door NMR nastreven.

Fragmentgebaseerde screening is nu een veelgebruikte methode voor het identificeren van vrij eenvoudige moleculen met een laag molecuulgewicht (MW <250 Da) die een zwakke binding vertonen aan macromoleculaire doelen, waaronder eiwitten, DNA en RNA. Initiële hits van primaire schermen dienen als basis om een secundair scherm van commercieel beschikbare grotere analogen van de hits uit te voeren en vervolgens op chemie gebaseerde fragmentgroei- of koppelingsstrategieën te gebruiken. Voor een succesvol platform voor het ontdekken van fragmenten (FBDD) is in het algemeen een robuuste biofysische methode nodig voor het detecteren en karakteriseren van zwakke treffers, een fragmentbibliotheek, een biomoleculair doelwit en een strategie voor vervolgchemie. Vier veelgebruikte biofysische methoden binnen de campagnes voor het ontdekken van geneesmiddelen zijn thermische verschuivingstests, oppervlakteplasmonresonantie (SPR), kristallografie en kernspinresonantiespectroscopie (NMR).
NMR-spectroscopie heeft verschillende rollen laten zien binnen de verschillende stadia van de FBDD. Afgezien van het waarborgen van de chemische zuiverheid en oplosbaarheid van de fragmenten in een fragmentbibliotheek opgelost in een geoptimaliseerd buffersysteem, kunnen ligand-geobserveerde NMR-experimenten fragmentbinding aan een doelwit met lage affiniteit detecteren en kunnen de doelgeobserveerde NMR-experimenten de bindende epitoop van het fragment afbakenen, waardoor gedetailleerde structuur-activiteitsrelatiestudies mogelijk worden. Binnen epitoopkartering kunnen op NMR gebaseerde chemische verschuivingsveranderingen niet alleen de orthosterische bindingsplaatsen identificeren, maar ook allosterische plaatsen die mogelijk cryptisch zijn en alleen toegankelijk in zogenaamde aangeslagen conformatietoestanden van het biomoleculaire doelwit. Als het biomoleculaire doelwit al een endogene ligand bindt, kunnen de geïdentificeerde fragmenttreffers gemakkelijk worden geclassificeerd als allosterisch of orthosterisch door NMR-gebaseerde competitie-experimenten uit te voeren. Het bepalen van de dissociatieconstante (KD) van de ligand-target interactie is een belangrijk aspect in het FBDD-proces. NMR-gebaseerde chemische verschuivingstitraties, ligand of doel waargenomen, kunnen gemakkelijk worden uitgevoerd om de KD te bepalen. Een groot voordeel van NMR is dat de interactiestudies worden uitgevoerd in oplossing en in de buurt van fysiologische omstandigheden. Zo kunnen alle conformatietoestanden voor de analyse van ligand/fragmentinteractie met zijn doelwit worden onderzocht. Verder zijn NMR-gebaseerde benaderingen niet alleen beperkt tot screening van goed gevouwen oplosbare eiwitten, maar worden ze ook toegepast om grotere doelruimte te accommoderen, waaronder DNA, RNA, membraangebonden en intrinsiek ongeordende eiwitten1.
Fragmentbibliotheken zijn een onmisbaar onderdeel van het FBDD-proces. Over het algemeen fungeren fragmenten als de eerste voorlopers die uiteindelijk deel gaan uitmaken (onderbouw) van de nieuwe remmer die is ontwikkeld voor een biologisch doelwit. Van verschillende geneesmiddelen (Venetoclax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) is gemeld dat ze als fragmenten zijn begonnen en nu met succes in de klinieken worden gebruikt. Typisch, fragmenten zijn lage molecuulgewicht (<250 Da) organische moleculen met een hoge waterige oplosbaarheid en stabiliteit. Een zorgvuldig samengestelde fragmentenbibliotheek met meestal een paar honderd fragmenten, kan al een efficiënte verkenning van de chemische ruimte beloven. De algemene samenstelling van fragmentbibliotheken is in de loop van de tijd geëvolueerd en werd meestal afgeleid door bekende medicijnen in kleinere fragmenten te ontleden of computationeel te ontwerpen. Deze diverse fragmentbibliotheken bevatten voornamelijk platte aromatische of heteroatomen en houden zich aan de Lipinski-regel van 5 6, of aan de huidige commerciële trendregel van 3 7, maar vermijden reactieve groepen. Sommige fragmentbibliotheken waren ook afgeleid van of samengesteld uit sterk oplosbare metabolieten, natuurlijke producten en of derivaten daarvan8. Een algemene uitdaging van de meeste fragmentbibliotheken is het gemak van downstream-chemie.
Het Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ) aan de Goethe-Universiteit Frankfurt is partner van de iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), een consortium voor structurele onderzoeksinfrastructuren voor alle Europese onderzoekers uit alle domeinen van biochemisch en biomedisch onderzoek. Binnen het vorige initiatief van iNEXT dat in 2019 eindigde, werd een fragmentenbibliotheek bestaande uit 768 fragmenten gemaakt met als doel "minimale fragmenten en maximale diversiteit" die een grote chemische ruimte beslaan. Verder is de iNEXT-fragmentbibliotheek, in tegenstelling tot elke andere fragmentbibliotheek, ook ontworpen op basis van het concept van "gepokte fragmenten" met als doel de downstream-synthese van complexe liganden met hoge affiniteit te vergemakkelijken en voortaan bekend te staan als in-house bibliotheek (Diamond, Structural Genomic Consortium en iNEXT).
Het opzetten van FBDD door NMR vereist mankracht, kennis en instrumentatie. Bij de BMRZ zijn geoptimaliseerde workflows ontwikkeld ter ondersteuning van technische assistentie bij fragmentscreening door NMR. Deze omvatten kwaliteitscontrole en oplosbaarheidsbeoordeling van de fragmentbibliotheek 9, bufferoptimalisatie voor de gekozen doelen, 1H of 19F- waargenomen 1D-ligandgebaseerde screening, competitie-experimenten om onderscheid te maken tussen orthosterische en allosterische binding, 2D-gebaseerde doelgeobserveerde NMR-experimenten voor epitoopkartering en voor het karakteriseren van de interactie met secundaire set derivaten van de initiële fragmenttreffers. BMRZ heeft geautomatiseerde routines opgezet voor de analyse, zoals ook eerder besproken in de literatuur 10,11, van kleine molecuul-eiwitinteracties en heeft alle benodigde geautomatiseerde infrastructuur voor NMR-gebaseerde fragmentscreening. Het heeft verzadigingsoverdrachtsverschil NMR (STD-NMR), waterligand waargenomen via gradiëntspectroscopie (waterLOGSY) en Carr-Purcell-Meiboom-Gill-gebaseerde (CPMG-gebaseerde) relaxatie-experimenten geïmplementeerd om fragmenten te identificeren binnen een breed scala aan affiniteitsregimes, evenals state-of-the-art geautomatiseerde NMR-instrumentatie en software voor het ontdekken van geneesmiddelen. Hoewel NMR-gebaseerde fragmentscreening goed ingeburgerd is voor eiwitten, wordt deze aanpak minder vaak gebruikt voor het vinden van nieuwe liganden die interageren met RNA en DNA. BMRZ heeft een proof of concept opgesteld voor nieuwe protocollen die de identificatie van kleine molecuul-RNA / DNA-interacties mogelijk maken. In de volgende secties van deze bijdrage wordt gerapporteerd dat de toepassing van screeningsroutines op eiwit- en RNA-monsters zich bewust maakt van de gevestigde protocollen voor een brede gebruikersbasis in biomacromoleculair onderzoek.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Avance III HD</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>600 MHz NMR Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes</td>
			<td>3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Barcoded Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix SepraSeal und DuraSeal&#38;</td>
			<td>4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SampleJet</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>HT Sample Changer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SamplePro Tube</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Pipetting Robot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode

Fragment-based screening (FBS) is een goed gevalideerd en geaccepteerd concept binnen het proces van geneesmiddelenontdekking, zowel in de academische wereld als in de industrie. Het grootste voordeel van NMR-gebaseerde fragmentscreening is het vermogen om niet alleen bindmiddelen van meer dan 7-8 ordes van grootte van affiniteit te detecteren, maar ook om de zuiverheid en chemische kwaliteit van de fragmenten te bewaken en zo hits van hoge kwaliteit en minimale valse positieven of valse negatieven te produceren. Een vereiste binnen de FBS is het uitvoeren van initiële en periodieke kwaliteitscontrole van de fragmentbibliotheek, het bepalen van de oplosbaarheid en chemische integriteit van de fragmenten in relevante buffers en het opzetten van meerdere bibliotheken om verschillende steigers te bedekken om verschillende macromolecuuldoelklassen (eiwitten / RNA / DNA) te huisvesten. Verder is een uitgebreide NMR-gebaseerde screeningsprotocoloptimalisatie met betrekking tot monsterhoeveelheden, snelheid van acquisitie en analyse op het niveau van biologische constructie / fragmentruimte, in conditieruimte (buffer, additieven, ionen, pH en temperatuur) en in ligandruimte (ligandanalogen, ligandconcentratie) vereist. Althans in de academische wereld zijn deze screeninginspanningen tot nu toe handmatig en op een zeer beperkte manier uitgevoerd, wat heeft geleid tot een beperkte beschikbaarheid van screeninginfrastructuur, niet alleen in het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen, maar ook in de context van de ontwikkeling van chemische sondes. Om economisch aan de eisen te voldoen, worden geavanceerde workflows gepresenteerd. Ze maken gebruik van de nieuwste state-of-the-art geavanceerde hardware, waarmee de vloeistofmonsterverzameling op een geconditioneerde manier in de NMR-buizen kan worden gevuld. 1H/19F NMR op ligand gebaseerde spectra worden vervolgens verzameld bij een bepaalde temperatuur. High-throughput sample changer (HT sample changer) kan meer dan 500 samples verwerken in temperatuurgecontroleerde blokken. Dit samen met geavanceerde softwaretools versnelt data-acquisitie en -analyse. Verder wordt de toepassing van screeningsroutines op eiwit- en RNA-monsters beschreven om bewust te worden van de gevestigde protocollen voor een brede gebruikersbasis in biomacromoleculair onderzoek.

Kwaliteitscontrole van fragmentenbibliotheek De fragmenten uit de eigen bibliotheek werden geleverd als 50 mM stockoplossingen in 90% d6-DMSO en 10% D 2 O (10% van D2O zorgt voor minimalisering van de afbraak van verbindingen als gevolg van herhaalde vries-dooicycli14). Enkelvoudige samengestelde monsters bestonden uit 1 mM ligand in 50 mM fosfaatbuffer (25 mM KPi pH 6,2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl 2), pH 6,0 in 90% H 2 O/9% D2O/1% d6-DMSO. 1H-NMR experimenten van fragmenten uit de iNEXT bibliotheek werden gemeten op een 500/600 MHz NMR spectrometer. Deze gegevens werden verder gebruikt voor het identificeren van de afzonderlijke verbindingen in 1H-screeningscampagnes met behulp van de CMC-q-software waarmee de gebruiker op een geautomatiseerde manier spectra volledig kan verwerven en de analyse-addon CMC-a de kwaliteit (oplosbaarheid en integriteit) van fragmenten werd beoordeeld. De resultaten van de geautomatiseerde analyse van CMC-a worden weergegeven als een grafische uitvoer die vergelijkbaar is met wat wordt weergegeven in figuur 3. De grafische uitvoer toont een weergave van een 96-well plaat. Een rood gekleurde cirkel betekent dat dit fragment inconsistentie in structuur of concentratie vertoont. Groen gekleurde putjes geven aan dat het fragment consistent is.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig03.jpg"> Figuur 3: Kwaliteitscontrole van fragmentbibliotheek. Schematische weergave van CMC-a gebaseerde geautomatiseerde uitvoer. Fragmenteigenschappen zoals concentratie en structurele integriteit worden beoordeeld. Groen staat voor consistent, oranje staat in dit geval voor inconsistent. Inconsistente fragmenten worden handmatig herzien volgens de weergegeven workflow. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Ongeveer 65% en 35% van de fragmenten werden geclassificeerd als respectievelijk consistent en inconsistent, in zowel DMSO als buffer. Verder werd 30% van de inconsistente geclassificeerde liganden consistent na een zorgvuldige handmatige inspectie van de spectra9.
19F Mengsel ontwerp 103 fragmenten met een of meerdere fluorgroepen uit de eigen bibliotheek werden verdeeld in 5 mixen (A, B, C, D, E). Elke mix heeft 20 tot 21 fragmenten. In dit geval moesten de mengsels zorgvuldig worden ontworpen om signaaloverlapping te voorkomen. 19F transversale relaxatie-experimenten werden gemeten voor elk mengsel dat CPMG-pulstreinen toepast. Deze experimenten kunnen worden aangepast door de ontspanningsvertragingen te variëren. De chemische verschuiving van 19F van mengsels A-E is te zien in figuur 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig04.jpg"> Figuur 4: 19F 1D-NMR spectra van mengselmonsters uit de eigen bibliotheek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Monstervoorbereiding De monstervoorbereiding in de 19F-screeningsprocedure werd handmatig uitgevoerd of met geautomatiseerd pipetteren met behulp van een pipetteerrobot. De fragmenten in elk mengsel hadden een concentratie van 2,5 mM in 90% d6-DMSO en 10% D2O. Het uiteindelijke volume van een zeefmonster was 170 μL met 5% D2O als vergrendelingsmiddel. Elk mengsel werd twee keer gepipetteerd, één in een bufferhoudende oplossing (zonder doel) en één in een doelhoudende bufferoplossing. De verhouding tussen doel en fragment werd ingesteld op 1:1, wat resulteerde in een uiteindelijke doel/ligandconcentratie van 50 μM. Bovendien zijn controlemonsters het doelbiomolecuul in de screeningsbuffer zonder mengsel om de doelintegriteit te waarborgen, evenals een controlemonster met alleen buffer en D2O om de bufferkwaliteit te waarborgen.
NMR-screeningsgegevens van 19 F-1D en 19F-CPMG-T2 waren metingen zoals beschreven in rubriek 3.1. In het geval van RNA werd bijvoorbeeld een jump-return echosequentie (pp = zggpjrse,15) verkregen voor het enkele doelmonster in buffer.
Data-analyse De 19F-screeningsprocedure werd toegepast op de TPP-riboswitch thiM van E. coli en eiwittyrosinekinase (PtkA) van M. tuberculosis onder verschillende andere doelen16. De 19F-zeefbibliotheek heeft 103 fragmenten die zijn verdeeld in 5 mixen met het label van Mix A tot E. Voorbereiding van zeefmonsters kan handmatig worden uitgevoerd zonder het gebruik van een monsterpipetteerrobot. 40 μM thiM RNA bevattende oplossing (buffercondities) werd gemengd met 3,2 μL uit de mengsels. Verdere controlemonsters werden bereid bestaande uit alleen buffer, buffer met 5% DMSO (voorheen zorgen voor de stabiliteit van het biomacromolecuul in aanwezigheid van de gewenste DMSO-concentratie) en buffer met RNA. Deze 13 zeefmonsters werden voorbereid en overgebracht naar 3 mm NMR-buizen. Barcodes van NMR-buizen worden gescand en elk mengsel in de aan- en afwezigheid van RNA, evenals controlemonsters werden gemeten volgens de bovengenoemde 19F NMR-experimenten uitgevoerd bij 298 K. Screening van thiM-RNA tegen de interne bibliotheek werd uitgevoerd door T2-metingen uit te voeren met CPMG's van 0 ms en 200 ms voor elk verschillend monster. De juiste shimming en wateronderdrukking werden na het voltooien van de metingen gecontroleerd door alle DMSO-pieken te vergelijken in termen van lijnverbreding en intensiteitsverlies van aanvullend gemeten 1H 1D-experimenten voor alle monsters. De verwerking van verkregen CPMG T219F relaxatiespectra werd uitgevoerd met behulp van respectievelijk een eerder voorbereide en geautomatiseerde macro in TopSpin. De gegevensanalyse werd uitgevoerd volgens de instructies in de protocolsectie. De integrale gegevens verkregen van TopSpin (volgens de instructies in het protocol) kunnen snel en eenvoudig worden geëvalueerd met behulp van een vooraf gemaakte spreadsheet of een vergelijkbaar programma, door de juiste voorwaarden en drempels in te stellen. Zoals eerder beschreven, zijn drempelwaarden nuttig bij het definiëren van bindmiddel, zwak bindmiddel of niet-bindmiddel. Figuur 5 toont typische resultaten van CPMG-spectra van respectievelijk thiM-RNA en PtkA. In sommige gevallen was verdere herziening door deskundigen nodig. 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig05.jpg"> Figuur 5: Uitgesneden uit 19F CPMG NMR-spectra die de intensiteitsveranderingen laten zien die zijn verkregen uit verschillende vertragingstijden van CPMG-gebaseerde experimenten . (A) Representatie van een bindmiddel (hit) en een niet-bindmiddel in 19F fragment-gebaseerde screening uitgevoerd op TPP riboswitch thiM RNA van E. coli. (B) Weergave van een bindmiddel en een niet-bindmiddel in 19F fragment-gebaseerde screening uitgevoerd op PtkA van M. tuberculosis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
1uur screening
Mengsel ontwerp De gebruikte in-house bibliotheek is zo divers dat voor 1H screening doeleinden geen mengsel ontwerp werd uitgevoerd. Dit betekent dat 64 mixen werden bereid door willekeurig 12 te kiezen om in één mengsel te mengen.
Monstervoorbereiding Voor de 1H-screening van een voorbeeldig SARS-CoV-2 RNA werd geautomatiseerd pipetteren met behulp van een pipetteerrobot uitgevoerd om de monsters voor te bereiden. De fragmenten in elk mengsel hadden een concentratie van 4,2 mM in 90% d6-DMSO en 10% D2O. Het uiteindelijke volume van een zeefmonster was 200 μL met 5% D2O als vergrendelingsmiddel. 64 monsters die elk een ander mengsel bevatten in 25 mM KPi, 50 mM KCl bij pH 6,2 werden gepipetteerd zonder doel-RNA. Respectievelijk werden 64 monsters gepipetteerd met doel-RNA, elk met een ander mengsel. De RNA:Ligand verhouding werd ingesteld op 1:20, wat resulteerde in een RNA-concentratie van 10 μM en een ligandconcentratie van 200 μM.
Data-analyse Voor de 1H-analyse is gebruik gemaakt van de FBS-tool in TopSpin. Om te bepalen of een fragment een hit is, werden 1D chemische verschuiving, waterLOGSY en T2 relaxatie-experimenten uitgevoerd. Voor T2-relaxatie werd een afname van de intensiteit groter dan 30% als een hit geteld, terwijl voor de chemische verschuiving een verschuiving van meer dan 6 Hz de cut-off was. De waterLOGSY moest een significante signaalverandering laten zien (van negatief naar positief in dit geval). Als twee van deze drie criteria positief waren, werd een fragment als een hit geteld. Twee voorbeelden hiervan zijn te zien in figuur 6.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig06.jpg"> Figuur 6: 1H-screening uitgevoerd op een voorbeeldig SARS-CoV-2 RNA met hitbepalingscriteria. Acquisitie van drie verschillende experimenten (1 H T2 CPMG (5/100 ms), waterLOGSY en 1D 1H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Hit-1 toont een T2 afname van ~50% en een CSP ≥ 6 Hz. De waterLOGSY vertoont niet significant genoeg verandering in signaal om ook als positief te worden geteld. Omdat twee van de drie experimenten positief zijn, wordt dit fragment als een hit geteld. Voor Hit-2 vertoont de T2 een afname van ~80% signaalintensiteit en is er een duidelijke signaalverandering te zien voor de waterLOGSY. De CSP is in dit geval niet voldoende, maar omdat de twee voorgaande criteria positief zijn, wordt deze nog steeds als een hit geteld.

Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Fragmentgebaseerde screening door NMR is een robuuste methode om snel kleine molecuulbinders voor biomacromoleculen (DNA, RNA of eiwitten) te identificeren. Protocollen die op automatisering gebaseerde monstervoorbereiding, NMR-experimenten en acquisitievoorwaarden en analyseworkflows beschrijven, worden gepresenteerd. De techniek maakt een optimale benutting van zowel 1H als 19F NMR-actieve kernen mogelijk voor detectie.

NMR-gebaseerde fragmentscreening in een minimale steekproef maar maximale automatiseringsmodus

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

We voeren kernspinresonantiestudies uit. Dit stelt ons in staat om de structuren van eiwitten, RNA en DNA in oplossing te bepalen. Deze biomoleculen zijn de bestanddelen, zijn de componenten van onze cellen, en onze protocollen die we hier presenteren houden zich bezig met het screenen van kleine moleculen en hun binding aan deze doelen.Uit deze moleculen kunnen onze medicinale chemie en structuurbiologie nieuwe medicijnen afleiden die ziekten bestrijden. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat we volledige controle hebben over de kwaliteit van de moleculaire doelen, zoals de eiwitten, en we hebben volledige controle over de kwaliteit van de fragmenten en medicijnen van kleine moleculen, en we kunnen ook eiwitten screenen op binding van een breed scala aan affiniteiten, wat een voordeel is in vergelijking met andere methodologieën. Om zeefmonsters voor NMR-meting voor te bereiden, gebruikt u een monstervoorbereidingsrobot om 768 verbindingen in acht 96-putplaten te verdelen om 64 mengsels met 12 fragmenten te verkrijgen tot een uiteindelijke concentratie van 4,2 millimolar per mengsel.Breng het biomoleculaire doelwit van belang, verdund in een geschikte screeningbuffer, over in het juiste aantal barcode-drie millimeter NMR-monsterwisselaarbuizen met hoge doorvoer en gebruik de robot om 10 microliter van elk ligandmengsel over te brengen in elke buis van het doelbiomolecuul. Laat de robot vervolgens de oplossingen grondig mengen. Voor NMR-acquisitie laadt u het monster in de spectrometer.Open de spectrometersoftware en selecteer vervolgens de parameterset en pulssequenties voor op ligand gebaseerde experimenten. Voor alle vermelde experimenten selecteert u excitatiesculptuur als de wateronderdrukking. Voor fluor-19-screening selecteert u zowel 1D- als T2-experimenten.Selecteer de spectrale breedte tot 220 delen per miljoen, de excitatiefrequentie tot 140 delen per miljoen en de analysetijd tussen één en vijf uur. Voor T2 moet de CPMG-tijd afwisselend tussen 5 en 100 milliseconden liggen. Neem de T1r- en T2-experimenten op.Noteer het verschil in verzadigingsoverdracht als een pseudo-2D. Om de twee afzonderlijke 1D-spectra te verwerken, gebruikt u de AU-programma ProcStd-functie, met of zonder de relaxoptie. De WaterLOGSY is een enkele 1D die gefaseerd moet worden met een negatief voor het oplosmiddelsignaal.Om de waterstofscreeninggegevens te analyseren, volgt u de instructies voor de op fragmenten gebaseerde screeningstool om de biomoleculaire magnetische resonantie NMR-gegevens van screeningcampagnes op te slaan, zodat elk screeningsmengsel zijn directory heeft waarin een subdirectory de verschillende experimenten bevat die op het monster zijn gemeten. Sla de referentiespectra op, waarbij alle gegevens van de monsters zijn opgeslagen zonder het biomoleculaire doelwit, maar met de mengsels en de enkele verbinding in verschillende mappen. Maak een direct pad naar de map met de verkregen gegevens en selecteer de NMR-map waarin alle mengsels een afzonderlijke map moeten hebben.Zorg ervoor dat het CSV-, fragmentscherm, XML-document en BAC-bestanden ook worden gekopieerd naar de NMR-map van de gegevens. Als u het op fragmenten gebaseerde screeningsgereedschap voor een gescreend monster wilt gebruiken, sleept u het op fragmenten gebaseerde screeningsprojectsymbool naar het midden van het analysevenster. Het symbool moet worden weergegeven als de eerder opgeslagen gegevenssets erin zijn gekopieerd.Het venster met op fragmenten gebaseerde screeningopties wordt automatisch geopend. Selecteer een CSV-cocktailbestand met de namen van de mixen, de namen van elk fragment en de verdeling van elk fragment in de mixen. Definieer een referentie ligand spectra map met alle gemeten spectra van de afzonderlijke fragmenten, en definieer een referentie lege experiment map, die meestal de datasets van de mixen zonder het onderzochte doel bevat.Als u de onderzochte spectra en spectraweergavekleuren wilt definiëren, opent u het tabblad Spectratypen en stelt u het specificatietype in op basis van de procesgegevens. Definieer op het tabblad Weergave-indeling de spectra die worden vergeleken op basis van de specificatietypen. Klik vervolgens op OK om het project te starten.Terwijl de gegevens worden verwerkt, wordt een apart venster geopend met de tabel met een samenvatting van alle cocktailmixen en de liganden van elke mix. Dubbelklik op een cel om de respectievelijke gegevenssets te openen. Voordat u bindmiddelen toewijst, moet u ervoor zorgen dat de referentiepieken overeenkomen met elkaar en dezelfde chemische verschuiving hebben.Als er verschillen worden waargenomen, opent u het tabblad Proces en gebruikt u de optie voor seriële verwerking om deze te corrigeren. Voor de eerste analyse van de fluor-19-mengsels opent u het tabblad Analyseren en selecteert u de integratiefunctie. Zorg ervoor dat voor elk fragment in het mengsel een duidelijk integratiegebied voor het overeenkomstige fluor-19-signaal is gedefinieerd.Sla exportintegratiegebieden op om het integratiebestand te exporteren voor toekomstig gebruik en sla alle gebruikte integratiebestanden op in de juiste installatiemap. Voor fluor-19-gegevens opent u een gegevensset met of zonder het onderzochte doel en klikt u op het tabblad Analyseren op Integratiegebieden integreren en lezen om het bijbehorende integratiebestand in het huidige spectrum te laden. Klik vervolgens op Opslaan en terugkeren om een lijst met de geïntegreerde gebieden op het tabblad Integralen te zoeken en kopieer deze informatie naar een spreadsheet voor downstream-analyse.De moleculaire structuur of samenstelling van de liganden in de fragmentbibliotheek wordt geanalyseerd met behulp van moleculaire betrouwbaarheidssoftware zoals gedemonstreerd, en de resultaten worden gepresenteerd als een grafische uitvoer. Een oranje kleur geeft aan dat het fragment een inconsistentie in structuur of concentratie vertoont. Groengekleurde putjes geven aan dat het fragment consistent is.In deze representatieve analyse werden 103 fragmenten met een of meerdere fluorgroepen uit de eigen bibliotheek verdeeld in vijf mengsels van 20 tot 21 fragmenten per mengsel. Fluor-19 transversale relaxatie-experimenten werden gemeten voor elk mengsel dat CPMG-pulstreinen toepaste. Drempelwaarden zijn nuttig voor het definiëren van bindmiddel, zwak bindmiddel of niet-bindmiddel in het mengsel, zoals waargenomen in deze typische thiamine-eiwit tyrosinekinase A- en RNA-spectra.In deze representatieve analyse toonde hit één een T2-afname van ongeveer 50% en een chemische verschuiving groter dan of gelijk aan zes hertz. De WaterLOGSY vertoonde geen significante verandering in het signaal om als positief te worden geteld. Omdat twee van de drie experimenten echter positief waren, werd dit fragment als een hit geteld.Voor hit twee vertoonde de T2 een afname van ongeveer 80% in signaalintensiteit. Ook voor de WaterLOGSY werd een duidelijke signaalverandering waargenomen. De chemische verschuiving was niet genoeg in dit experiment, maar omdat de twee vorige criteria positief waren, werd het nog steeds als een hit geteld.Het uiteindelijke doel van dergelijke methoden is om nieuwe medicijnen of hoog-affiniteitsremmers van bijvoorbeeld enzymen te ontwikkelen, en hierin neemt medicinale chemie deze nieuwe moleculen over en synthetiseert deze, maar structuurbiologie, de technieken die je hier toepast, kunnen de medicinale chemie begeleiden en die aanpak veel sneller maken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Real-time Tracking van DNA-fragment scheiding via Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Een alles-in-een monsterhouder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie met minimale achtergrond verstrooiing

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Workflow en tools voor kristallografische fragmentscreening in het Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...