Name: nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode
Uploaded: 2021-06-04T15:00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par iNEXT-Discovery, projet numéro 871037, financé par le programme Horizon 2020 de la Commission européenne.

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Polyvalence du dépistage des fragments / drogues basé sur la RMN. BMRZ a mis en œuvre avec succès des instruments RMN automatisés de pointe ainsi que des expériences de RMN-STD, waterLOGSY et de relaxation pour identifier des fragments dans un large éventail de régimes d’affinité pour la découverte de médicaments. Le matériel installé comprend un robot de préparation d’échantillons à haut débit et une unité de stockage d’échantillons à haut débit, de changeur et d’acquisition de données associée à un spectromètre de 600 MHz. Une sonde cryogénique récemment achetée pour 1 H, 19 F, 13C et 15 N assure la sensibilité requise pour les mesures proposées et permet un découplage de1 H (1) lors de la détection 19F. Cette sonde est connectée à la dernière génération de console RMN qui offre la possibilité d’utiliser les outils logiciels avancés de Bruker, notamment CMC-q, CMC-assist, CMC-se et FBS (inclus dans TopSpin). L’outil de criblage basé sur les fragments (FBS) est inclus dans la dernière version de TopSpin et aide à analyser les données à haut débit comprenant les expériences de relaxation RTS, waterLOGSY, T2 / T1. La collecte d’échantillons liquide 1D 1H peut être remplie dans les tubes RMN de manière automatisée à l’aide du robot de remplissage d’échantillons. En règle générale, un bloc de 96 tubes (3 mm) est rempli en environ deux heures. Les racks à plaques de 96 puits sont directement positionnés dans le changeur d’échantillons HT, qui lit le code-barres du bloc et attribue les tubes RMN aux expériences contrôlées par le logiciel d’automatisation (IconNMR). Cinq racks à plaques de 96 puits peuvent être stockés et programmés dans le changeur d’échantillons HT en même temps. La température de chacun des racks individuels peut être contrôlée et réglée séparément. De plus, chaque échantillon individuel peut être préconditionné (préchauffage et séchage du tube pour éliminer l’humidité condensée) à la température souhaitée avant la mesure.
Convient à une large gamme d’applications. L’une des vastes applications de ce criblage automatisé basé sur la RMN est d’identifier et de développer de nouveaux ligands se liant à une cible biomacromoléculaire (ADN / ARN / protéines). Ces ligands peuvent inclure des inhibiteurs orthostériques et allostériques qui se lient généralement de manière non covalente. De plus, le FBDD par RMN est généralement utilisé comme première étape pour sélectionner des composés prometteurs, les exigences à respecter sont la disponibilité de la cible biomoléculaire en quantités suffisantes. Cet objectif est divisé en deux tâches principales.
La première tâche consiste à développer et à caractériser une bibliothèque de fragments interne pour les raisons suivantes: contrôle initial et périodique de la qualité, caractérisation et quantification de plus de 1000 fragments; détermination de la solubilité des fragments dans des tampons optimisés pour chaque cible, en particulier pour les cibles protéiques; et la création de plusieurs bibliothèques pour accueillir divers échafaudages et s’étendre à d’autres classes de macromolécules. La deuxième tâche consiste à intégrer les flux de travail pour la conception de médicaments à base de fragments (FBDD) par RMN en utilisant: le dépistage automatisé observé par ligand 1D (1H et 19F observés); essais de remplacement automatisés (expériences de compétition avec un ligand (naturel)) pour différencier la liaison orthostérique et allostérique; criblages secondaires automatisés avec plusieurs fragments; criblage automatisé des protéines 2D et filtrage secondaire d’un ensemble de dérivés autour d’un résultat initial en utilisant la bibliothèque EU-OPENSCREEN ou toute autre bibliothèque; et le reprofilage de la bibliothèque de la FDA par rapport aux cibles choisies.
De plus, le métabotypage de diverses lignées cellulaires (pertinentes pour la maladie) peut être effectué afin de démêler les mécanismes de régulation qui relient le contrôle du cycle cellulaire et le métabolisme. En outre, il existe une caractérisation fonctionnelle des éléments de régulation de l’ARN / ADN / protéine in vivo et in vitro pour l’optimisation de la construction / du domaine (optimisation de la stabilité pour les études structurelles (tampon, pH, température et criblage de sel), et une extension du criblage de fragments basé sur la RMN aux protéines membranaires et aux protéines intrinsèquement désordonnées, qui sont généralement inaccessibles à d’autres techniques.
Limitations. L’utilisation de bibliothèques de fragments 19F et 1H a ses avantages et ses inconvénients, dont peu seront mentionnés ci-dessous. Le plus grand avantage des mesures 19F par rapport à 1H est la rapidité du temps de mesure réel et de l’analyse ultérieure, car les mélanges contiennent presque le double du nombre de fragments et moins d’expériences doivent être menées. L’analyse de suivi est également plus facile pour le criblage 19F, car il n’y a pas d’interférence des tampons et offre en outre une plage de décalage chimique plus large avec presque aucun chevauchement de signal pour un mélange de fragments conçu de manière optimale. Les spectres eux-mêmes sont grandement simplifiés, n’ayant généralement qu’un ou deux signaux par fragment, en fonction du nombre d’atomes de fluor. L’analyse de ces spectres peut donc être automatisée, ce qui réduit encore le temps. Cela se fait au détriment de la diversité chimique, du moins pour la bibliothèque utilisée dans cette étude. Comme seulement ~13% de la bibliothèque contient 19 F, mais naturellement tous sont utilisables en criblage 1H, la diversité des fragments de criblage 19F sera plus faible. Cela pourrait être contourné en utilisant des bibliothèques 19F spécialement conçues avec plus de fragments et une plus grande diversité chimique. Un autre inconvénient du criblage 19F est le faible nombre de signaux par fragment. Les fragments sont généralement composés de plus d’un atome d’hydrogène. Par conséquent, les expériences de criblage observées à 1H peuvent s’appuyer sur différents signaux pour le même fragment afin de détecter la liaison. Cela donne un degré de confiance plus élevé lors de l’identification des résultats positifs pour le criblage de 1H, alors que le dépistage 19F doit s’appuyer sur un ou deux signaux donnés par fragment.
Un compte rendu détaillé de l’instrumentation moderne automatisée de criblage de fragments, des logiciels et des méthodes et protocoles d’analyse correspondants a été présenté. Le matériel installé comprend un robot de préparation d’échantillons à haut débit et une unité de stockage d’échantillons à haut débit, un changeur et une unité d’acquisition de données associés à un spectromètre de 600 MHz. Une tête de sonde cryogénique récemment installée pour 1 H, 19 F, 13C et 15 N assure la sensibilité requise pour les mesures proposées et permet un découplage de 1H lors dela détection 19F. De plus, la dernière génération de console RMN offre la possibilité d’utiliser un logiciel analytique avancé pour faciliter l’acquisition et l’analyse à la volée. La technologie, les flux de travail et les protocoles décrits ci-dessus devraient favoriser un succès remarquable pour les utilisateurs qui poursuivent FBS par RMN.

Le criblage par fragments est maintenant une méthode couramment utilisée pour identifier des molécules plutôt simples et de faible poids moléculaire (MW <250 Da) qui montrent une faible liaison aux cibles macromoléculaires, y compris les protéines, l’ADN et l’ARN. Les résultats initiaux des criblages primaires servent de base pour effectuer un criblage secondaire des analogues plus importants des résultats disponibles dans le commerce, puis pour utiliser des stratégies de croissance ou de liaison de fragments basées sur la chimie. Pour une plate-forme de découverte de médicaments basée sur des fragments (FBDD), en général, une méthode biophysique robuste est nécessaire pour détecter et caractériser les résultats faibles, une bibliothèque de fragments, une cible biomoléculaire et une stratégie de chimie de suivi. Quatre méthodes biophysiques couramment appliquées dans les campagnes de découverte de médicaments sont les tests de décalage thermique, la résonance plasmonique de surface (SPR), la cristallographie et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN).
La spectroscopie RMN a montré des rôles variés au sein des différentes étapes du FBDD. En plus d’assurer la pureté chimique et la solubilité des fragments dans une bibliothèque de fragments dissoute dans un système tampon optimisé, les expériences RMN observées par ligand peuvent détecter la liaison de fragments à une cible à faible affinité et les expériences RMN observées sur la cible peuvent délimiter l’épitope de liaison du fragment, permettant ainsi des études détaillées de la relation structure-activité. Dans la cartographie des épitopes, les changements de déplacement chimique basés sur la RMN permettent non seulement d’identifier les sites de liaison orthostériques, mais aussi les sites allostériques qui pourraient être cryptiques et accessibles uniquement dans les états conformationnels dits excités de la cible biomoléculaire. Si la cible biomoléculaire se lie déjà à un ligand endogène, les fragments identifiés peuvent être facilement classés comme allostériques ou orthostériques en effectuant des expériences de compétition basées sur la RMN. La détermination de la constante de dissociation (KD) de l’interaction ligand-cible est un aspect important du processus FBDD. Les titrages de décalage chimique basés sur la RMN, que ce soit le ligand ou la cible observée, peuvent être facilement effectués pour déterminer le KD. Un avantage majeur de la RMN est que les études d’interaction sont réalisées en solution et à proximité de conditions physiologiques. Ainsi, tous les états conformationnels pour l’analyse de l’interaction ligand/fragment avec sa cible peuvent être sondés. De plus, les approches basées sur la RMN ne se limitent pas seulement au criblage de protéines solubles bien repliées, mais sont également appliquées pour s’adapter à un espace cible plus large, y compris l’ADN, l’ARN, les protéines liées à la membrane et les protéines intrinsèquement désordonnées1.
Les bibliothèques de fragments sont une partie indispensable du processus FBDD. En général, les fragments agissent comme les précurseurs initiaux qui finissent par faire partie (sous-structure) du nouvel inhibiteur développé pour une cible biologique. Plusieurs médicaments (Vénétoclax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) ont commencé sous forme de fragments et sont maintenant utilisés avec succès dans les cliniques. Typiquement, les fragments sont des molécules organiques de faible poids moléculaire (<250 Da) avec une solubilité et une stabilité aqueuses élevées. Une bibliothèque de fragments soigneusement conçue contenant généralement quelques centaines de fragments peut déjà promettre une exploration efficace de l’espace chimique. La composition générale des bibliothèques de fragments a évolué au fil du temps et a le plus souvent été dérivée en disséquant des médicaments connus en fragments plus petits ou conçus par calcul. Ces diverses bibliothèques de fragments contiennent principalement des aromatiques plats ou des hétéroatomes et adhèrent à la règle de Lipinski de 5 6, ou à la règle de tendance commerciale actuelle de 3 à 7, mais évitent les groupes réactifs. Certaines banques de fragments ont également été dérivées ou composées de métabolites hautement solubles, de produits naturels et/ou de leurs dérivés8. Un défi général posé par la plupart des bibliothèques de fragments est la facilité de la chimie en aval.
Le Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ) de l’Université Goethe de Francfort est partenaire de iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), un consortium d’infrastructures de recherche structurelle pour tous les chercheurs européens de tous les domaines de la recherche biochimique et biomédicale. Dans le cadre de la précédente initiative d’iNEXT qui s’est achevée en 2019, une bibliothèque de fragments comprenant 768 fragments a été conçue dans le but de « fragments minimum et diversité maximale » couvrant un grand espace chimique. En outre, contrairement à toute autre bibliothèque de fragments, la bibliothèque de fragments iNEXT a également été conçue sur la base du concept de « fragments posés » dans le but de faciliter la synthèse en aval de ligands complexes de haute affinité et désormais connue sous le nom de bibliothèque interne (Diamond, Structural Genomic Consortium et iNEXT).
L’établissement de la DFDD par RMN nécessite de la main-d’œuvre, des connaissances et de l’instrumentation. Au BMRZ, des flux de travail optimisés pour soutenir l’assistance technique au criblage des fragments par RMN ont été développés. Il s’agit notamment du contrôle de la qualité et de l’évaluation de la solubilité de la bibliothèque de fragments 9, de l’optimisation du tampon pour les cibles choisies, du criblage basé sur le ligand 1D observé 1 H ou 19F, des expériences de compétition pour différencier la liaison orthostérique et allostérique, desexpériences de RMN observées sur des cibles 2D pour la cartographie des épitopes et pour caractériser l’interaction avec un ensemble secondaire de dérivés des impacts initiaux du fragment. BMRZ a établi des routines automatisées pour l’analyse, comme indiqué précédemment dans la littérature 10,11, des interactions petites molécules-protéines et a mis en place toute l’infrastructure automatisée nécessaire pour le criblage de fragments basé sur la RMN. Il a mis en œuvre la RMN par différence de transfert de saturation (STD-RMN), les ligands de l’eau observés par spectroscopie de gradient (waterLOGSY) et les expériences de relaxation basées sur Carr-Purcell-Meiboom-Gill (basées sur CPMG) pour identifier des fragments dans un large éventail de régimes d’affinité ainsi que des instruments RMN automatisés de pointe et des logiciels pour la découverte de médicaments. Bien que le criblage de fragments basé sur la RMN soit bien établi pour les protéines, cette approche est moins couramment utilisée pour trouver de nouveaux ligands interagissant avec l’ARN et l’ADN. BMRZ a établi une preuve de concept pour de nouveaux protocoles permettant l’identification des interactions petites molécules-ARN/ADN. Dans les sections suivantes de cette contribution, l’application de routines de dépistage sur des échantillons de protéines et d’ARN est signalée pour faire connaître les protocoles établis pour une vaste base d’utilisateurs dans la recherche biomacromoléculaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Avance III HD</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>600 MHz NMR Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes</td>
			<td>3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Barcoded Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix SepraSeal und DuraSeal&#38;</td>
			<td>4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SampleJet</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>HT Sample Changer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SamplePro Tube</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Pipetting Robot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode

Le dépistage par fragments (FBS) est un concept bien validé et accepté dans le processus de découverte de médicaments, tant dans le milieu universitaire que dans l’industrie. Le plus grand avantage du criblage de fragments basé sur la RMN est sa capacité non seulement à détecter des liants de plus de 7 à 8 ordres de grandeur d’affinité, mais aussi à surveiller la pureté et la qualité chimique des fragments et donc à produire des résultats positifs de haute qualité et un minimum de faux positifs ou de faux négatifs. Une condition préalable au sein du FBS est d’effectuer un contrôle de qualité initial et périodique de la bibliothèque de fragments, de déterminer la solubilité et l’intégrité chimique des fragments dans les tampons pertinents et d’établir plusieurs bibliothèques pour couvrir divers échafaudages afin d’accueillir diverses classes cibles de macromolécules (protéines / ARN / ADN). En outre, une optimisation approfondie du protocole de criblage basée sur la RMN en ce qui concerne les quantités d’échantillons, la vitesse d’acquisition et d’analyse au niveau de la construction biologique / espace fragmentaire, dans l’espace des conditions (tampon, additifs, ions, pH et température) et dans l’espace des ligands (analogues du ligand, concentration du ligand) est nécessaire. Au moins dans le milieu universitaire, ces efforts de dépistage ont jusqu’à présent été entrepris manuellement de manière très limitée, ce qui a limité la disponibilité de l’infrastructure de dépistage non seulement dans le processus de développement de médicaments, mais aussi dans le contexte du développement de sondes chimiques. Afin de répondre aux exigences de manière économique, des flux de travail avancés sont présentés. Ils tirent parti du dernier matériel avancé de pointe, avec lequel la collecte d’échantillons liquides peut être remplie de manière automatisée dans les tubes RMN de manière contrôlée. 1Les spectres basés sur les ligands RMN H/19F sont ensuite collectés à une température donnée. Le changeur d’échantillons à haut débit (changeur d’échantillons HT) peut traiter plus de 500 échantillons dans des blocs à température contrôlée. Ceci, associé à des outils logiciels avancés, accélère l’acquisition et l’analyse des données. De plus, l’application de routines de dépistage sur des échantillons de protéines et d’ARN est décrite pour faire connaître les protocoles établis pour une vaste base d’utilisateurs dans la recherche biomacromoléculaire.

Contrôle qualité de la bibliothèque de fragments Les fragments de la bibliothèque interne ont été livrés sous forme de solutions mères de 50 mM dans 90% de d6-DMSO et 10% deD2O(10% de D2O assure la minimisation de la dégradation des composés due aux cycles répétés de gel-dégel14). Les échantillons composés uniques étaient constitués de 1 mM de ligand dans un tampon phosphate de 50 mM (25 mM KPi pH 6,2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl2), pH 6,0 dans 90% H 2 O/9% D2O/1% d6-DMSO. 1Des expériences de RMN-H de fragments de la bibliothèque iNEXT ont été mesurées sur un spectromètre RMN 500/600 MHz. Ces données ont ensuite été utilisées pour identifier les composés individuels dans les campagnes de criblage de 1 H à l’aide du logiciel CMC-q qui permet à l’utilisateur d’acquérir pleinement des spectres demanière automatisée et l’addon d’analyse CMC-a la qualité (solubilité et intégrité) des fragments a été évaluée. Les résultats de l’analyse automatisée de CMC-a sont présentés sous forme de sortie graphique similaire à ce qui est représenté à la figure 3. La sortie graphique montre une représentation d’une plaque de 96 puits. Un cercle de couleur rouge signifie que ce fragment présente une incohérence dans la structure ou la concentration. Les puits de couleur verte indiquent que le fragment est cohérent.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig03.jpg"> Figure 3 : Contrôle de la qualité de la bibliothèque de fragments. Représentation schématique de la sortie automatisée basée sur CMC-a. Les propriétés des fragments telles que la concentration et l’intégrité structurelle sont évaluées. Le vert signifie cohérent, l’orange dans ce cas signifie incohérent. Les fragments incohérents sont révisés manuellement en suivant le flux de travail affiché. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Environ 65 % et 35 % des fragments ont été classés comme cohérents et incohérents, respectivement, dans le DMSO et le tampon. De plus, 30 % des ligands classifiés incohérents sont devenus cohérents après une inspection manuelle minutieuse des spectres9.
19F Conception du mélange 103 fragments contenant un ou plusieurs groupes fluorés de la bibliothèque interne ont été divisés en 5 mélanges (A, B, C, D, E). Chaque mélange contient de 20 à 21 fragments. Dans ce cas, les mélanges devaient être soigneusement conçus pour éviter le chevauchement des signaux. 19Des expériences de relaxation transversale F ont été mesurées pour chaque mélange qui applique des trains d’impulsions CPMG. Ces expériences peuvent être modifiées en variant les délais de relaxation. Le décalage chimique de 19F des mélanges A-E peut être vu sur la figure 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig04.jpg"> Figure 4 : 19spectres RMN F 1D-RMN d’échantillons de mélange provenant de la bibliothèque interne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Préparation des échantillons La préparation de l’échantillon dans la procédure de criblage 19F a été effectuée manuellement ou avec un pipetage automatisé à l’aide d’un robot de pipetage. Les fragments de chaque mélange avaient une concentration de 2,5 mM dans 90% de d6-DMSO et 10% deD2O. Le volume final d’un échantillon de dépistage était de 170 μL avec 5 % deD2Ocomme agent de verrouillage. Chaque mélange a été pipeté deux fois, l’une dans une solution tampon contenant (sans cible) et l’autre dans une solution tampon contenant une cible. Le rapport entre la cible et le fragment a été fixé à 1:1, ce qui a donné une concentration finale cible/ligand de 50 μM. De plus, les échantillons témoins sont la biomolécule cible dans le tampon de criblage sans mélange pour assurer l’intégrité de la cible ainsi qu’un échantillon témoin avec seulement un tampon et D2O pour assurer la qualité du tampon.
Les données de dépistage RMN de 19 F-1Det 19F-CPMG-T2 ont été mesurées comme décrit à la section 3.1. Par exemple, dans le cas de l’ARN, une séquence d’écho de saut-retour (pp = zggpjrse,15) a été acquise pour l’échantillon cible unique en tampon.
Analyse des données La procédure de dépistage 19 F a été appliquée au riboswitch TPP thiM d’E. coli et à la protéine tyrosine kinase (PtkA) de M. tuberculosis parmi plusieurs autres cibles 16. La bibliothèque de criblage 19F comprend 103 fragments qui sont divisés en 5 mélanges étiquetés du mélange A au mélange. La préparation des échantillons de criblage peut être effectuée manuellement sans l’utilisation d’un robot de pipetage d’échantillons. Une solution contenant 40 μM d’ARN thiM (conditions tampons) a été mélangée avec 3,2 μL provenant des mélanges. D’autres échantillons témoins ont été préparés comprenant uniquement un tampon, un tampon contenant 5 % de DMSO (garantissant auparavant la stabilité de la biomacromolécule en présence de la concentration souhaitée de DMSO) et un tampon contenant de l’ARN. Ces 13 échantillons de dépistage ont été préparés et transférés dans des tubes RMN de 3 mm. Les codes-barres des tubes RMN sont scannés et chaque mélange en présence et en l’absence d’ARN, ainsi que les échantillons témoins, ont été mesurés conformément aux 19expériences RMN F susmentionnées effectuées à 298 K. Le criblage de l’ARN thiM par rapport à la bibliothèque interne a été effectué en effectuant des mesures T2 avec des CPMG de 0 ms et 200 ms pour chaque échantillon différent. Le calage et la suppression de l’eau ont été surveillés après avoir terminé les mesures en comparant tous les pics de DMSO en termes d’élargissement de la ligne et de perte d’intensité d’expériences 1H 1D mesurées supplémentaires pour tous les échantillons. Le traitement des spectres de relaxation CPMG T219F obtenus a été effectué à l’aide d’une macro préalablement préparée et automatisée dans TopSpin, respectivement. L’analyse des données a été effectuée en suivant les instructions de la section protocole. Les données intégrales obtenues à partir de TopSpin (en suivant les instructions du protocole) peuvent être évaluées rapidement et facilement à l’aide d’une feuille de calcul prédéfinie ou de tout programme similaire, en définissant les conditions et les seuils corrects. Comme décrit précédemment, les seuils sont utiles pour définir le classeur, le classeur faible ou le non-classeur. La figure 5 montre les résultats typiques des spectres CPMG de thiM ARN et PtkA, respectivement. Dans certains cas, une révision plus poussée par des experts a été nécessaire. 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig05.jpg"> Figure 5 : Coupe de 19 spectres RMN CPMG montrant les changements d’intensité obtenus à partir de différents temps de retard d’expériences basées sur CPMG . (A) Représentation d’un liant (hit) et d’un non-liant dans le criblage à base de fragments 19F effectué sur l’ARN TPP riboswitch thiM d’E. coli. (B) Représentation d’un liant et d’un non-liant dans le criblage à base de fragments 19F effectué sur PtkA de M. tuberculosis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
1h de dépistage
Conception du mélange La bibliothèque interne utilisée est si diversifiée que pendant 1H, aucune conception de mélange n’a été réalisée. Cela signifie que 64 mélanges ont été préparés en choisissant au hasard 12 mélanges à mélanger dans un mélange.
Préparation des échantillons Pour le criblage 1H d’un ARN SARS-CoV-2 exemplaire, un pipetage automatisé à l’aide d’un robot de pipetage a été effectué pour préparer les échantillons. Les fragments de chaque mélange présentaient une concentration de 4,2 mM dans 90 % de d6-DMSO et 10 % deD2O. Le volume final d’un échantillon de dépistage était de 200 μL avec 5 % deD2Ocomme agent de verrouillage. 64 échantillons contenant chacun un mélange différent dans 25 mM KPi, 50 mM KCl à pH 6,2 ont été pipetés sans ARN cible. Respectivement, 64 échantillons ont été pipetés avec de l’ARN cible, chacun contenant un mélange différent. Le rapport ARN:ligand a été fixé à 1:20, ce qui a donné une concentration d’ARN de 10 μM et une concentration de ligand de 200 μM.
Analyse des données Pour l’analyse 1H, l’outil FBS de TopSpin a été utilisé. Pour déterminer si un fragment est un hit, des expériences de décalage chimique 1D, waterLOGSY et relaxation T2 ont été menées. Pour la relaxation T2 , une diminution de l’intensité supérieure à 30% a été considérée comme un résultat, tandis que pour le décalage chimique, un décalage supérieur à 6 Hz était le seuil. Le waterLOGSY devait montrer un changement de signal significatif (de négatif à positif dans ce cas). Si deux de ces trois critères étaient positifs, un fragment était compté comme un résultat. La figure 6 en donne deux exemples.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig06.jpg"> Figure 6 : 1H de dépistage réalisé sur un ARN exemplaire du SARS-CoV-2 présentant des critères de détermination des coups. Acquisition de trois expériences différentes (1 H T2 CPMG (5/100 ms), waterLOGSY, et 1D 1H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Hit-1 montre une diminution de T2 de ~50% et un CSP ≥ 6 Hz. Le waterLOGSY ne montre pas un changement de signal suffisamment significatif pour être également considéré comme positif. Comme deux expériences sur trois sont positives, ce fragment est compté comme un succès. Pour Hit-2, le T2 montre une diminution de ~80% de l’intensité du signal et un changement de signal clair peut être vu pour le waterLOGSY. Le CSP n’est pas suffisant dans ce cas, mais comme les deux critères précédents sont positifs, il est toujours considéré comme un succès.

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NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Le criblage par fragments par RMN est une méthode robuste pour identifier rapidement les liants de petites molécules aux biomacromolécules (ADN, ARN ou protéines). Des protocoles décrivant la préparation des échantillons basée sur l’automatisation, les expériences RMN et les conditions d’acquisition, ainsi que les flux de travail d’analyse sont présentés. La technique permet une exploitation optimale des noyaux actifs RMN 1H et 19F pour la détection.

Criblage de fragments basé sur la RMN dans un échantillon minimum mais un mode d’automatisation maximal

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Nous menons des études de résonance magnétique nucléaire. Cela nous permet de déterminer les structures des protéines, de l’ARN et de l’ADN en solution. Ces biomolécules sont les constituants, sont les composants de nos cellules, et nos protocoles que nous présentons ici concernent le criblage de petites molécules et leur liaison à ces cibles.De ces molécules, notre chimie médicinale et notre biologie structurale peuvent dériver de nouveaux médicaments qui combattent les maladies. Le principal avantage de notre technique est que nous avons un contrôle total sur la qualité des cibles moléculaires, comme les protéines, et nous avons un contrôle total sur la qualité des fragments de petites molécules et des médicaments, et nous pouvons également cribler les protéines pour la liaison d’un large éventail d’affinités, ce qui est un avantage par rapport à d’autres méthodologies. Pour préparer des échantillons de criblage pour la mesure RMN, utilisez un robot de préparation d’échantillons pour distribuer 768 composés dans huit plaques de 96 puits afin d’obtenir 64 mélanges contenant 12 fragments à une concentration finale de 4,2 millimolaires par mélange.Transférer la cible biomoléculaire d’intérêt, diluée dans un tampon de criblage approprié, dans le nombre approprié de tubes changeurs d’échantillons RMN à haut débit à code à barres de trois millimètres, et utiliser le robot pour transférer 10 microlitres de chaque mélange de ligands dans chaque tube de biomolécule cible. Ensuite, demandez au robot de bien mélanger les solutions. Pour l’acquisition RMN, chargez l’échantillon dans le spectromètre.Ouvrez le logiciel du spectromètre, puis sélectionnez le jeu de paramètres et les séquences d’impulsions pour les expériences basées sur les ligands. Pour toutes les expériences répertoriées, sélectionnez la sculpture d’excitation comme suppression de l’eau. Pour le criblage du fluor 19, sélectionnez les expériences 1D et T2.Sélectionnez la largeur spectrale à 220 parties par million, la fréquence d’excitation à 140 parties par million et le temps d’analyse entre une et cinq heures. Pour T2, le temps CPMG devrait alterner entre 5 et 100 millisecondes. Enregistrez les expériences T1r et T2.Enregistrez la différence de transfert de saturation sous forme de pseudo 2D. Pour traiter les deux spectres 1D simples, utilisez la fonction ProcStd du programme AU, avec ou sans l’option relax. Le WaterLOGSY est un 1D unique qui doit être phasé avec un signal négatif pour le solvant.Pour analyser les données de criblage de l’hydrogène, suivez les instructions de l’outil de criblage à base de fragments pour stocker les données RMN par résonance magnétique biomoléculaire des campagnes de criblage, de sorte que chaque mélange de criblage ait son répertoire dans lequel un sous-répertoire contient les différentes expériences mesurées sur l’échantillon. Stockez les spectres de référence, en ayant toutes les données enregistrées à partir des échantillons sans la cible biomoléculaire, mais avec les mélanges et le composé unique dans des répertoires différents. Créez un chemin direct vers le répertoire contenant les données acquises et sélectionnez le répertoire RMN dans lequel tous les mélanges doivent avoir un répertoire distinct.Assurez-vous que le fichier CSV, l’écran de fragments, le document XML et les fichiers BAC sont également copiés dans le répertoire RMN des données. Pour utiliser l’outil de filtrage basé sur des fragments pour un échantillon filtré, faites glisser le symbole du projet de filtrage basé sur des fragments au milieu de la fenêtre d’analyse. Le symbole doit apparaître si les jeux de données précédemment enregistrés y ont été copiés.La fenêtre des options de filtrage basées sur les fragments devrait s’ouvrir automatiquement. Sélectionnez un fichier cocktail CSV contenant les noms des mélanges, les noms de chaque fragment et la division de chaque fragment en mélanges. Définissez un dossier de spectres de ligand de référence avec tous les spectres mesurés des fragments individuels et définissez un dossier d’expérience de référence vierge, qui contient généralement les jeux de données des mélanges sans la cible étudiée.Pour définir les spectres étudiés et les couleurs d’affichage des spectres, ouvrez l’onglet Types de spectres et définissez le type de spécification en fonction des données de processus. Dans l’onglet Disposition de l’affichage, définissez les spectres qui seront comparés en fonction des types de spécifications. Ensuite, cliquez sur OK pour démarrer le projet.Pendant le traitement des données, une fenêtre séparée avec le tableau résumant tous les mélanges de cocktails et les ligands de chaque mélange s’ouvrira. Double-cliquez sur une cellule pour ouvrir les jeux de données respectifs. Avant d’attribuer des liants, assurez-vous que les pics de référence correspondent les uns aux autres et ont le même décalage chimique.Si des différences sont observées, ouvrez l’onglet Processus et utilisez l’option de traitement série pour les corriger. Pour la première analyse sur les mélanges de fluor 19, ouvrez l’onglet Analyser et sélectionnez la fonction d’intégration. Assurez-vous qu’une zone d’intégration claire pour le signal de fluor 19 correspondant est définie pour chaque fragment du mélange.Enregistrez les régions d’intégration d’exportation pour exporter le fichier d’intégration pour une utilisation ultérieure et enregistrez tous les fichiers d’intégration utilisés dans le répertoire d’installation approprié. Pour les données sur le fluor 19, ouvrez un jeu de données avec ou sans la cible étudiée et, sous l’onglet Analyser, cliquez sur Intégrer et lire les régions d’intégration d’importation pour charger le fichier d’intégration correspondant dans le spectre actuel. Cliquez ensuite sur Enregistrer et revenir pour rechercher une liste des régions intégrées dans l’onglet Intégrales, puis copiez ces informations dans une feuille de calcul pour une analyse en aval.La structure moléculaire ou la constitution des ligands dans la bibliothèque de fragments est analysée à l’aide d’un logiciel de confiance moléculaire tel que démontré, et les résultats sont présentés sous forme de sortie graphique. Une couleur orange indique que le fragment présente une incohérence dans la structure ou la concentration. Les puits de couleur verte indiquent que le fragment est cohérent.Dans cette analyse représentative, 103 fragments contenant un ou plusieurs groupes fluorés de la bibliothèque interne ont été divisés en cinq mélanges de 20 à 21 fragments par mélange. Des expériences de relaxation transversale au fluor 19 ont été mesurées pour chaque mélange appliquant des trains d’impulsions CPMG. Les seuils sont utiles pour définir le liant, le liant faible ou le non-liant dans le mélange, comme observé dans ces spectres typiques de tyrosine kinase A et d’ARN de la protéine thiamine.Dans cette analyse représentative, le premier coup a montré une diminution de T2 d’environ 50% et un décalage chimique supérieur ou égal à six hertz. Le WaterLOGSY n’a pas montré de changement significatif dans le signal pour être compté comme positif. Cependant, comme deux expériences sur trois étaient positives, ce fragment a été compté comme un succès.Pour le deuxième coup, le T2 a montré une diminution d’environ 80% de l’intensité du signal. Un changement de signal clair a également été observé pour le WaterLOGSY. Le changement chimique n’était pas suffisant dans cette expérience, mais comme les deux critères précédents étaient positifs, il a quand même été compté comme un succès.L’objectif final de ces méthodes est de développer de nouveaux médicaments ou des inhibiteurs de haute affinité, par exemple, des enzymes, et en cela, la chimie médicinale prend le relais et synthétise ces nouvelles molécules, mais la biologie de la structure, les techniques que vous appliquez ici peuvent guider la chimie médicinale et rendre cette approche beaucoup plus rapide.

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