Name: nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode
Uploaded: 2021-06-04T15:00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von iNEXT-Discovery, Projekt Nummer 871037, gefördert durch das Horizon 2020 Programm der Europäischen Kommission.

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Vielseitigkeit des NMR-basierten Fragment-/Wirkstoff-Screenings. Das BMRZ hat erfolgreich modernste automatisierte NMR-Instrumente sowie STD-NMR-, waterLOGSY- und Relaxationsexperimente implementiert, um Fragmente innerhalb eines breiten Affinitätsbereichs für die Wirkstoffforschung zu identifizieren. Die installierte Hardware umfasst einen Hochdurchsatz-Probenvorbereitungsroboter und eine Hochdurchsatz-Probenspeicher-, Wechsler- und Datenerfassungseinheit, die einem 600-MHz-Spektrometer zugeordnet sind. Eine kürzlich erworbene Kryosonde für 1 H, 19 F, 13C und 15 N gewährleistet die erforderliche Empfindlichkeit für die vorgeschlagenen Messungen und ermöglicht eine Entkopplung von 1 H (1) während der 19F-Detektion. Diese Sonde ist mit der neuesten Generation von NMR-Konsolen verbunden, die die Möglichkeit bieten, die fortschrittlichen Software-Tools von Bruker zu verwenden, einschließlich CMC-q, CMC-assist, CMC-se und FBS (in TopSpin enthalten). Das fragmentbasierte Screening-Tool (FBS) ist in der neuesten Version von TopSpin enthalten und hilft bei der Analyse der Hochdurchsatzdaten, die aus STD-, waterLOGSY- und T2/T 1-r-Relaxationsexperimenten bestehen. Die flüssige 1D-1H-Probenentnahme kann mit Hilfe des Probenfüllroboters automatisiert in die NMR-Röhrchen gefüllt werden. In der Regel wird ein Block von 96 Röhrchen (3 mm) in etwa zwei Stunden befüllt. Die 96-Well-Platten-Racks werden direkt im HT-Probenwechsler positioniert, der den Barcode des Blocks liest und die NMR-Röhrchen den von der Automatisierungssoftware (IconNMR) gesteuerten Experimenten zuordnet. Fünf 96-Well-Platten-Racks können gleichzeitig im HT-Probenwechsler gelagert und programmiert werden. Die Temperatur der einzelnen Racks kann separat gesteuert und geregelt werden. Zusätzlich kann jede einzelne Probe vor der Messung auf die gewünschte Temperatur vorkonditioniert werden (Vorwärmen und Röhrchentrocknung zur Entfernung von kondensierter Feuchtigkeit).
Eignung für ein breites Anwendungsspektrum. Eine der breiten Anwendungen dieses automatisierten NMR-basierten Screenings ist die Identifizierung und Entwicklung neuartiger Liganden, die an ein biomakromolekulares Ziel (DNA/RNA/Proteine) binden. Zu diesen Liganden können orthosterische und allosterische Inhibitoren gehören, die typischerweise nicht-kovalent binden. Darüber hinaus wird die FBDD mittels NMR in der Regel als erster Schritt zur Auswahl vielversprechender Verbindungen eingesetzt, wobei die zu erfüllenden Anforderungen die Verfügbarkeit des biomolekularen Targets in ausreichenden Mengen sind. Dieses Ziel gliedert sich in zwei Hauptaufgaben.
Aufgabe eins ist die Entwicklung und Charakterisierung einer internen Fragmentbibliothek aus folgenden Gründen: anfängliche und periodische Qualitätskontrolle, Charakterisierung und Quantifizierung von mehr als 1000 Fragmenten; Bestimmung der Löslichkeit der Fragmente in Puffern, die für jedes Target, insbesondere für Proteintargets, optimiert sind; und die Einrichtung mehrerer Bibliotheken, um verschiedene Gerüste unterzubringen und sich auf andere Makromolekülklassen auszudehnen. Aufgabe zwei ist die Integration von Arbeitsabläufen für das fragmentbasierte Wirkstoffdesign (FBDD) mittels NMR mit: automatisiertem 1D-Liganden-Beobachtungs-Screening (1H und 19F beobachtet); automatisierte Ersatzassays (Konkurrenzexperimente mit (natürlichen) Liganden) zur Unterscheidung von orthosterischer und allosterischer Bindung; automatisierte Sekundärscreenings mit mehreren Fragmenten; automatisiertes 2D-Protein-Screening und Sekundär-Screening einer Reihe von Derivaten um einen ersten Treffer unter Verwendung der EU-OPENSCREEN-Bibliothek oder einer anderen Bibliothek; und Re-Profiling-Screening der FDA-Bibliothek gegen die ausgewählten Ziele.
Darüber hinaus kann die Metabotypisierung verschiedener Zelllinien (krankheitsrelevant) durchgeführt werden, um die regulatorischen Mechanismen zu entschlüsseln, die die Kontrolle des Zellzyklus und den Stoffwechsel miteinander verbinden. Darüber hinaus gibt es eine funktionelle Charakterisierung von RNA/DNA/Protein-Regulationselementen in vivo und in vitro zur Optimierung der Konstrukt-/Domänenoptimierung (Stabilitätsoptimierung für strukturelle Untersuchungen (Puffer-, pH-, Temperatur- und Salzscreening) und eine Erweiterung des NMR-basierten Fragmentscreenings auf Membranproteine und intrinsisch ungeordnete Proteine, die für andere Techniken im Allgemeinen unzugänglich sind.
Begrenzungen. Die Verwendung von 19-F- und 1-H-Fragmentbibliotheken hat ihre Vor- und Nachteile, von denen im Folgenden einige erwähnt werden. Der größte Vorteil von 19F gegenüber 1H Messungen ist die Geschwindigkeit sowohl der eigentlichen Messzeit als auch der anschließenden Analyse, da die Mischungen fast doppelt so viele Fragmente enthalten und weniger Experimente durchgeführt werden müssen. Auch die Nachanalyse ist für das 19F-Screening einfacher, da es keine Interferenzen durch Puffer gibt und zusätzlich einen breiteren chemischen Verschiebungsbereich mit nahezu keiner Signalüberlappung für ein optimal ausgelegtes Fragmentgemisch bietet. Die Spektren selbst sind stark vereinfacht und haben in der Regel nur ein oder zwei Signale pro Fragment, abhängig von der Anzahl der Fluoratome. Die Analyse dieser Spektren kann so automatisiert werden, was wiederum Zeit spart. Dies geht auf Kosten der chemischen Vielfalt, zumindest für die in dieser Studie verwendete Bibliothek. Da nur ~13% der Bibliothek 19 F enthalten, aber natürlich alle im 1-H-Screening verwendbar sind, ist die Diversität der 19F-Screening-Fragmente geringer. Dies könnte durch die Verwendung speziell entwickelter 19-F-Bibliotheken mit mehr Fragmenten und größerer chemischer Vielfalt umgangen werden. Ein weiterer Nachteil des 19-F-Screenings ist die geringe Anzahl von Signalen pro Fragment. Fragmente bestehen in der Regel aus mehr als einem Wasserstoffatom. Daher können sich 1H beobachtete Screening-Experimente auf unterschiedliche Signale für dasselbe Fragment verlassen, um die Bindung zu erkennen. Dies führt zu einem höheren Maß an Sicherheit bei der Identifizierung von Treffern für das 1-H-Screening, während sich das 19-F-Screeningauf ein oder zwei Signale pro Fragment verlassen muss.
Es wurde ein detaillierter Bericht über die modernen, automatisierten NMR-basierten Fragment-Screening-Instrumente, die Software und die Analysemethoden und deren Protokolle vorgestellt. Die installierte Hardware umfasst einen Hochdurchsatz-Probenvorbereitungsroboter und eine Hochdurchsatz-Probenspeicher-, Wechsler- und Datenerfassungseinheit, die einem 600-MHz-Spektrometer zugeordnet ist. Ein kürzlich installierter kryogener Sondenkopf für 1 H, 19 F, 13C und 15N gewährleistet die erforderliche Empfindlichkeit für die vorgeschlagenen Messungen und ermöglicht eine1-H-Entkopplung bei 19F-Detektion. Darüber hinaus bietet die neueste Generation der NMR-Konsole die Möglichkeit, fortschrittliche Analysesoftware zur Unterstützung der Erfassung und On-the-Fly-Analyse zu verwenden. Die oben besprochene Technologie, die Arbeitsabläufe und die beschriebenen Protokolle sollten Anwendern, die FBS mittels NMR verfolgen, einen bemerkenswerten Erfolg bescheren.

Das fragmentbasierte Screening ist heute eine häufig verwendete Methode zur Identifizierung von relativ einfachen und niedermolekularen Molekülen (MW <250 Da), die eine schwache Bindung an makromolekulare Ziele wie Proteine, DNA und RNA aufweisen. Initiale Treffer von Primär-Screens dienen als Grundlage, um ein Sekundär-Screening von kommerziell erhältlichen größeren Analoga der Hits durchzuführen und dann chemiebasierte Fragmentwachstums- oder Verknüpfungsstrategien zu nutzen. Für eine erfolgreiche fragmentbasierte Wirkstoffentdeckungsplattform (FBDD) ist im Allgemeinen eine robuste biophysikalische Methode zum Nachweis und zur Charakterisierung schwacher Treffer, eine Fragmentbibliothek, ein biomolekulares Ziel und eine Strategie für die Follow-up-Chemie erforderlich. Vier häufig angewandte biophysikalische Methoden innerhalb der Wirkstoffforschungskampagnen sind thermische Verschiebungsassays, Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), Kristallographie und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR).
Die NMR-Spektroskopie hat in den verschiedenen Stadien der FBDD unterschiedliche Rollen gespielt. Neben der Sicherstellung der chemischen Reinheit und Löslichkeit der Fragmente in einer Fragmentbibliothek, die in einem optimierten Puffersystem gelöst sind, können Liganden-beobachtete NMR-Experimente die Bindung von Fragmenten an ein Target mit geringer Affinität nachweisen, und die Target-beobachteten NMR-Experimente können das Bindungsepitop des Fragments abgrenzen, wodurch detaillierte Struktur-Aktivitäts-Beziehungsstudien möglich sind. Innerhalb der Epitopkartierung können NMR-basierte chemische Verschiebungsänderungen nicht nur die orthosterischen Bindungsstellen identifizieren, sondern auch allosterische Stellen, die kryptisch und nur in sogenannten angeregten Konformationszuständen des biomolekularen Ziels zugänglich sein könnten. Wenn das biomolekulare Target bereits an einen endogenen Liganden bindet, können die identifizierten Fragmenttreffer durch NMR-basierte Konkurrenzexperimente leicht als allosterisch oder orthosterisch klassifiziert werden. Die Bestimmung der Dissoziationskonstante (KD) der Ligand-Target-Wechselwirkung ist ein wichtiger Aspekt im FBDD-Prozess. NMR-basierte chemische Shift-Titrationen, entweder Liganden- oder Target-Titrationen, können problemlos durchgeführt werden, um den KD zu bestimmen. Ein großer Vorteil der NMR besteht darin, dass die Interaktionsstudien in Lösung und in der Nähe physiologischer Bedingungen durchgeführt werden. Somit können alle Konformationszustände für die Analyse der Ligand/Fragment-Wechselwirkung mit seinem Target untersucht werden. Darüber hinaus sind NMR-basierte Ansätze nicht nur auf das Screening gut gefalteter löslicher Proteine beschränkt, sondern werden auch auf größere Zielräume wie DNA, RNA, membrangebundene und intrinsisch ungeordneteProteine angewendet 1.
Fragmentbibliotheken sind ein unverzichtbarer Bestandteil des FBDD-Prozesses. Im Allgemeinen fungieren Fragmente als erste Vorläufer, die schließlich Teil (Substruktur) des neuen Inhibitors werden, der für ein biologisches Ziel entwickelt wurde. Es wurde berichtet, dass mehrere Medikamente (Venetoclax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) als Fragmente begonnen haben und nun erfolgreich in den Kliniken eingesetzt werden. Typischerweise handelt es sich bei Fragmenten um organische Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht (<250 Da) und einer hohen wässrigen Löslichkeit und Stabilität. Eine sorgfältig ausgearbeitete Fragmentbibliothek, die in der Regel einige hundert Fragmente enthält, kann bereits eine effiziente Erkundung des chemischen Raums versprechen. Die allgemeine Zusammensetzung von Fragmentbibliotheken hat sich im Laufe der Zeit weiterentwickelt und wurde meist durch das Zerlegen bekannter Medikamente in kleinere Fragmente abgeleitet oder rechnerisch entworfen. Diese verschiedenen Fragmentbibliotheken enthalten hauptsächlich flache aromatische oder Heteroatome und halten sich an die Lipinski-Regel von 5 6 oder an die aktuelle kommerzielle Trendregel von 3 7, vermeiden jedoch reaktive Gruppen. Einige Fragmentbibliotheken wurden auch von hochlöslichen Metaboliten, Naturstoffen und/oder deren Derivaten abgeleitet oder zusammengesetzt8. Eine allgemeine Herausforderung, die von den meisten Fragmentbibliotheken gestellt wird, ist die Einfachheit der nachgelagerten Chemie.
Das Zentrum für Biomolekulare Magnetresonanz (BMRZ) der Goethe-Universität Frankfurt ist Partner von iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), einem Konsortium für strukturelle Forschungsinfrastrukturen für alle europäischen Forschenden aus allen Bereichen der biochemischen und biomedizinischen Forschung. Im Rahmen der vorherigen Initiative von iNEXT, die 2019 endete, wurde eine Fragmentbibliothek mit 768 Fragmenten erstellt, mit dem Ziel, "minimale Fragmente und maximale Vielfalt" zu erreichen, die einen großen chemischen Raum abdeckt. Darüber hinaus wurde die iNEXT-Fragmentbibliothek im Gegensatz zu allen anderen Fragmentbibliotheken auch auf der Grundlage des Konzepts der "ausgeglichenen Fragmente" entwickelt, mit dem Ziel, die nachgelagerte Synthese komplexer Liganden mit hoher Affinität zu erleichtern, und von nun an als Inhouse-Bibliothek (Diamond, Structural Genomic Consortium und iNEXT) bezeichnet.
Die Etablierung von FBDD mittels NMR erfordert Arbeitskräfte, Wissen und Instrumente. Am BMRZ wurden optimierte Arbeitsabläufe entwickelt, um die technische Unterstützung beim Fragment-Screening mittels NMR zu unterstützen. Dazu gehören Qualitätskontrolle und Löslichkeitsbewertung der Fragmentbibliothek 9, Pufferoptimierung für die ausgewählten Targets, 1H oder 19F- beobachtetes 1D-Liganden-basiertes Screening, Konkurrenzexperimente zur Unterscheidung zwischen orthosterischer und allosterischer Bindung, 2D-basierte Target-beobachtete NMR-Experimente zur Epitopkartierung und zur Charakterisierung der Wechselwirkung mit sekundären Derivaten der ursprünglichen Fragmenttreffer. Das BMRZ hat automatisierte Routinen für die Analyse von Kleinmolekül-Protein-Wechselwirkungen etabliert, wie auch bereits in der Literatur 10,11 diskutiert, und verfügt über die notwendige automatisierte Infrastruktur für das NMR-basierte Fragmentscreening. Es hat Sättigungstransferdifferenz-NMR (STD-NMR), Wasser-Liganden-Spektroskopie (waterLOGSY) und Carr-Purcell-Meiboom-Gill-basierte (CPMG-basierte) Relaxationsexperimente implementiert, um Fragmente innerhalb eines breiten Spektrums von Affinitätsregimen zu identifizieren, sowie modernste automatisierte NMR-Instrumente und Software für die Wirkstoffforschung. Während das NMR-basierte Fragment-Screening für Proteine gut etabliert ist, wird dieser Ansatz weniger häufig verwendet, um neue Liganden zu finden, die mit RNA und DNA interagieren. Das BMRZ hat den Proof-of-Concept für neue Protokolle etabliert, die die Identifizierung von niedermolekularen RNA/DNA-Wechselwirkungen ermöglichen. In den folgenden Abschnitten dieses Beitrags wird über die Anwendung von Screening-Routinen auf Protein- und RNA-Proben berichtet, um die etablierten Protokolle für eine breite Anwenderbasis in der biomakromolekularen Forschung bekannt zu machen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Avance III HD</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>600 MHz NMR Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes</td>
			<td>3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Barcoded Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix SepraSeal und DuraSeal&#38;</td>
			<td>4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SampleJet</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>HT Sample Changer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SamplePro Tube</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Pipetting Robot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode

Das fragmentbasierte Screening (FBS) ist ein gut validiertes und akzeptiertes Konzept innerhalb des Wirkstoffforschungsprozesses sowohl in der Wissenschaft als auch in der Industrie. Der größte Vorteil des NMR-basierten Fragmentscreenings ist seine Fähigkeit, nicht nur Bindemittel über 7-8 Größenordnungen der Affinität zu detektieren, sondern auch die Reinheit und chemische Qualität der Fragmente zu überwachen und so qualitativ hochwertige Treffer und minimale falsch positive oder falsch negative Ergebnisse zu erzeugen. Eine Voraussetzung innerhalb des FBS ist die Durchführung einer anfänglichen und periodischen Qualitätskontrolle der Fragmentbibliothek, die Bestimmung der Löslichkeit und chemischen Integrität der Fragmente in relevanten Puffern und die Einrichtung mehrerer Bibliotheken, um verschiedene Gerüste abzudecken, um verschiedene Makromolekül-Zielklassen (Proteine/RNA/DNA) aufzunehmen. Darüber hinaus ist eine umfassende NMR-basierte Optimierung des Screening-Protokolls in Bezug auf Probenmengen, Geschwindigkeit der Erfassung und Analyse auf der Ebene des biologischen Konstrukts/Fragmentraums, im Zustandsraum (Puffer, Additive, Ionen, pH und Temperatur) und im Ligandenraum (Ligandenanaloga, Ligandenkonzentration) erforderlich. Zumindest in der akademischen Welt wurden diese Screening-Bemühungen bisher nur in sehr begrenztem Umfang manuell durchgeführt, was zu einer begrenzten Verfügbarkeit der Screening-Infrastruktur nicht nur im Arzneimittelentwicklungsprozess, sondern auch im Zusammenhang mit der Entwicklung chemischer Sonden führte. Um den Anforderungen wirtschaftlich gerecht zu werden, werden fortschrittliche Workflows vorgestellt. Sie nutzen die Vorteile der neuesten hochmodernen Hardware, mit der die flüssige Probenentnahme auf temperaturkontrollierte Weise automatisiert in die NMR-Röhrchen gefüllt werden kann. 1H/19F NMR-Liganden-basierte Spektren werden dann bei einer bestimmten Temperatur aufgenommen. Der Probenwechsler mit hohem Durchsatz (HT-Probenwechsler) kann mehr als 500 Proben in temperaturgesteuerten Blöcken verarbeiten. Zusammen mit fortschrittlichen Softwaretools beschleunigt dies die Datenerfassung und -analyse. Des Weiteren wird die Anwendung von Screening-Routinen auf Protein- und RNA-Proben beschrieben, um die etablierten Protokolle für eine breite Anwenderbasis in der biomakromolekularen Forschung bekannt zu machen.

Qualitätskontrolle der Fragmentbibliothek Die Fragmente aus der hauseigenen Bibliothek wurden als 50 mM Stammlösungen in 90 % d6-DMSO und 10 % D2 O geliefert (10 %D2O sorgen für eineMinimierung des Verbindungsabbaus durch wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen14). Die Einzelproben bestanden aus 1 mM Ligand in 50 mM Phosphatpuffer (25 mM KPi pH 6,2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl2), pH 6,0 in 90%H2O/9% D2O/1% d6-DMSO. 1H-NMR-Experimente von Fragmenten aus der iNEXT-Bibliothek wurden mit einem 500/600 MHz NMR-Spektrometer gemessen. Diese Daten wurden weiter verwendet, um die einzelnen Verbindungen in 1-H-Screening-Kampagnen mit der CMC-q-Software zu identifizieren, die es dem Benutzer ermöglicht, Spektren vollständig und automatisiert zu erfassen, und mit dem Analyse-Addon CMC-a wurde die Qualität (Löslichkeit und Integrität) von Fragmenten bewertet. Die Ergebnisse der automatisierten Analyse von CMC-a werden ähnlich wie in Abbildung 3 dargestellt als grafische Ausgabe dargestellt. Die grafische Ausgabe zeigt eine Darstellung einer 96-Well-Platte. Ein rot gefärbter Kreis bedeutet, dass dieses Fragment eine Inkonsistenz in der Struktur oder Konzentration aufweist. Grün eingefärbte Vertiefungen zeigen an, dass das Fragment konsistent ist.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig03.jpg"> Abbildung 3: Qualitätskontrolle der Fragmentbibliothek. Schematische Darstellung der CMC-a-basierten automatisierten Ausgabe. Fragmenteigenschaften wie Konzentration und strukturelle Integrität werden bewertet. Grün steht für konsistent, Orange steht in diesem Fall für inkonsistent. Inkonsistente Fragmente werden gemäß dem gezeigten Workflow manuell überarbeitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ungefähr 65 % bzw. 35 % der Fragmente wurden sowohl im DMSO als auch im Puffer als konsistent bzw. inkonsistent klassifiziert. Darüber hinaus wurden 30% der inkonsistent klassifizierten Liganden nach einer sorgfältigen manuellen Inspektion der Spektren konsistent9.
19F Gemischausführung 103 Fragmente, die eine oder mehrere Fluorgruppen aus der hauseigenen Bibliothek enthielten, wurden in 5 Mischungen (A, B, C, D, E) aufgeteilt. Jede Mischung besteht aus 20 bis 21 Fragmenten. In diesem Fall mussten die Mischungen sorgfältig ausgelegt werden, um Signalüberlappungen zu vermeiden. 19F-transversale Relaxationsexperimente wurden für jedes Gemisch gemessen, das CPMG-Pulsfolgen anwendete. Diese Experimente können durch Variation der Relaxationsverzögerungen modifiziert werden. Die chemische Verschiebung der Mischungen A-E um 19F ist in Abbildung 4 zu sehen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig04.jpg"> Abbildung 4: 19F 1D-NMR-Spektren von Mischungsproben aus der hauseigenen Bibliothek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Probenvorbereitung Die Probenvorbereitung im 19F-Screening-Verfahren erfolgte entweder manuell oder mit automatisiertem Pipettieren mittels Pipettierroboter. Die Fragmente in jeder Mischung wiesen eine Konzentration von 2,5 mM in 90 % d6-DMSO und 10 %D2O auf. Das Endvolumen einer Screening-Probe betrug 170 μL mit 5 %D2Oals Lockmittel. Jedes Gemisch wurde zweimal pipettiert, einmal in eine pufferhaltige Lösung (ohne Target) und einmal in eine Target-haltige Pufferlösung. Das Verhältnis von Target und Fragment wurde auf 1:1 eingestellt, was zu einer endgültigen Target/Ligand-Konzentration von 50 μM führte. Zusätzlich sind Kontrollproben das Zielbiomolekül im Screening-Puffer ohne Mischung, um die Target-Integrität zu gewährleisten, sowie eine Kontrollprobe nur mit Puffer undD2O,um die Pufferqualität zu gewährleisten.
Bei den NMR-Screening-Daten von 19 F-1D und 19F-CPMG-T2 handelte es sich um Messungen gemäß Abschnitt 3.1. Im Falle von RNA wurde beispielsweise eine Jump-Return-Echosequenz (pp = zggpjrse,15) für die einzelne Zielprobe im Puffer erfasst.
Datenanalyse Das 19F-Screening-Verfahren wurde unter anderem auf den TPP-Riboswitch thiM aus E. coli und die Protein-Tyrosinkinase (PtkA) aus M. tuberculosis angewendet16. Die 19F Screening-Bibliothek enthält 103 Fragmente, die in 5 Mischungen unterteilt sind, die von Mix A bis E beschriftet sind. Die Vorbereitung von Screening-Proben kann manuell ohne den Einsatz eines Probenpipettierroboters durchgeführt werden. 40 μM thiM RNA enthaltende Lösung (Pufferbedingungen) wurde mit 3,2 μL aus den Mischungen gemischt. Weitere Kontrollproben wurden aus reinem Puffer, Puffer mit 5% DMSO (zuvor die Stabilität des Biomakromoleküls in Gegenwart der gewünschten DMSO-Konzentration sichergestellt) und Puffer mit RNA hergestellt. Diese 13 Screening-Proben wurden präpariert und in 3 mm NMR-Röhrchen überführt. Barcodes von NMR-Röhrchen werden gescannt und jede Mischung in An- und Abwesenheit von RNA sowie Kontrollproben wurden gemäß den oben genannten 19F-NMR-Experimenten gemessen, die bei 298 K durchgeführt wurden. Das Screening der thiM-RNA gegen die hauseigene Bibliothek wurde durch Durchführung vonT2-Messungen mit CPMGs von 0 ms und 200 ms für jede unterschiedliche Probe durchgeführt. Das korrekte Shimming und die Wasserunterdrückung wurden nach Abschluss der Messungen durch den Vergleich aller DMSO-Peaks in Bezug auf Linienverbreiterung und Intensitätsverlust der zusätzlich gemessenen 1H 1D-Experimente für alle Proben überwacht. Die Verarbeitung der erhaltenen CPMG T219F Relaxationsspektren erfolgte mit Hilfe eines zuvor vorbereiteten bzw. automatisierten Makros in TopSpin. Die Datenanalyse wurde gemäß den Anweisungen im Protokollabschnitt durchgeführt. Die von TopSpin erhaltenen integralen Daten (gemäß den Anweisungen im Protokoll) können schnell und einfach mit einer vorgefertigten Tabelle oder einem ähnlichen Programm ausgewertet werden, indem die richtigen Bedingungen und Schwellenwerte festgelegt werden. Wie bereits beschrieben, sind Schwellenwerte nützlich, um Bindemittel, schwache Bindemittel oder Nicht-Bindemittel zu definieren. Abbildung 5 zeigt typische Ergebnisse von CPMG-Spektren von thiM-RNA bzw. PtkA. In einigen Fällen war eine weitere fachliche Überarbeitung erforderlich. 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig05.jpg"> Abbildung 5: Ausschnitt aus 19 F CPMG NMR-Spektren, die die Intensitätsänderungen zeigen, die durch verschiedene Verzögerungszeiten von CPMG-basierten Experimenten erzielt wurden . (A) Darstellung eines Binders (Hit) und eines Nicht-Binders in einem 19F-Fragment-basierten Screening, das auf TPP-Riboswitch-thiM-RNA aus E. coli durchgeführt wurde. (B) Darstellung eines Bindemittels und eines Nicht-Bindemittels im 19F Fragment-basierten Screening, das auf PtkA von M. tuberculosis durchgeführt wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
1h Screening
Mischungsdesign Die verwendete hauseigene Bibliothek ist so vielfältig, dass für die1-Stunden-Siebung kein Mischungsdesign durchgeführt wurde. Das bedeutet, dass 64 Mischungen hergestellt wurden, indem 12 nach dem Zufallsprinzip ausgewählt wurden, um sie in einer Mischung zu mischen.
Probenvorbereitung Für das 1-Stunden-Screening einer exemplarischen SARS-CoV-2-RNA wurde ein automatisiertes Pipettieren mit einem Pipettierroboter durchgeführt, um die Proben vorzubereiten. Die Fragmente in jeder Mischung wiesen eine Konzentration von 4,2 mM in 90 % d6-DMSO und 10 %D2O auf. Das Endvolumen einer Screening-Probe betrug 200 μL mit 5 %D2Oals Lockmittel. 64 Proben, die jeweils eine andere Mischung in 25 mM KPi, 50 mM KCl bei pH 6,2 enthielten, wurden ohne Ziel-RNA pipettiert. Jeweils wurden 64 Proben mit Ziel-RNA pipettiert, die jeweils eine andere Mischung enthielten. Das RNA:Ligand-Verhältnis wurde auf 1:20 eingestellt, woraus sich eine RNA-Konzentration von 10 μM und eine Ligandenkonzentration von 200 μM ergibt.
Datenanalyse Für die 1-Stunden-Analyse wurde das FBS-Tool in TopSpin verwendet. Um festzustellen, ob es sich bei einem Fragment um einen Treffer handelt, wurden 1D-Chemikalienverschiebungs-, waterLOGSY- und T2-Relaxationsexperimente durchgeführt. Für dieT2-Relaxation wurde eine Intensitätsabnahme von mehr als 30 % als Treffer gewertet, während für die chemische Verschiebung eine Verschiebung von mehr als 6 Hz als Cut-off gewertet wurde. Der waterLOGSY musste eine signifikante Signaländerung aufweisen (in diesem Fall von negativ zu positiv). Wenn zwei dieser drei Kriterien positiv waren, wurde ein Fragment als Treffer gewertet. Zwei Beispiele hierfür sind in Abbildung 6 zu sehen.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig06.jpg"> Abbildung 6: 1-H-Screening an einer beispielhaften SARS-CoV-2-RNA mit Trefferbestimmungskriterien. Erfassung von drei verschiedenen Experimenten (1 H T2 CPMG (5/100 ms), waterLOGSY und 1D 1H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Hit-1 zeigt eineT2-Abnahme von ~50% und einen CSP ≥ 6 Hz. Der waterLOGSY zeigt keine ausreichend signifikante Signaländerung, um ebenfalls als positiv gewertet zu werden. Da zwei von drei Experimenten positiv verlaufen, wird dieses Fragment als Treffer gewertet. Für Hit-2 zeigt der T2 eine Abnahme der Signalintensität von ~80% und für den waterLOGSY ist eine deutliche Signaländerung zu erkennen. Der CSP reicht in diesem Fall nicht aus, aber da die beiden vorherigen Kriterien positiv sind, wird er dennoch als Treffer gezählt.

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NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Das fragmentbasierte Screening mittels NMR ist eine robuste Methode zur schnellen Identifizierung von niedermolekularen Bindemitteln an Biomakromoleküle (DNA, RNA oder Proteine). Es werden Protokolle vorgestellt, die die automatisierungsbasierte Probenvorbereitung, NMR-Experimente und Aufnahmebedingungen sowie Analyse-Workflows beschreiben. Die Technik ermöglicht die optimale Nutzung von 1H und 19F NMR-aktiven Kernen für den Nachweis.

NMR-basiertes Fragment-Screening mit minimaler Probe, aber maximalem Automatisierungsmodus

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Wir führen Kernspinresonanzuntersuchungen durch. So können wir die Strukturen von Proteinen, RNA und DNA in Lösung bestimmen. Diese Biomoleküle sind die Bestandteile, sind die Bestandteile unserer Zellen, und unsere Protokolle, die wir hier vorstellen, befassen sich mit dem Screening kleiner Moleküle und ihrer Bindung an diese Ziele.Aus diesen Molekülen können unsere medizinische Chemie und Strukturbiologie neue Medikamente gegen Krankheiten ableiten. Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass wir die volle Kontrolle über die Qualität der molekularen Ziele, wie z.B. der Proteine, haben, und wir haben die volle Kontrolle über die Qualität der niedermolekularen Fragmente und Medikamente, und wir können auch Proteine auf die Bindung eines breiten Spektrums von Affinitäten untersuchen, was im Vergleich zu anderen Methoden ein Vorteil ist. Um Siebproben für die NMR-Messung vorzubereiten, verwenden Sie einen Probenvorbereitungsroboter, um 768 Verbindungen auf acht 96-Well-Platten zu verteilen, um 64 Mischungen mit 12 Fragmenten bis zu einer Endkonzentration von 4,2 Millimolar pro Mischung zu erhalten.Übertragen Sie das zu untersuchende biomolekulare Zielmolekül, das in einem geeigneten Screening-Puffer verdünnt ist, in die entsprechende Anzahl von Barcode-Drei-Millimeter-NMR-Hochdurchsatz-Probenwechslöhrchen, und verwenden Sie den Roboter, um 10 Mikroliter jeder Ligandenmischung in jedes Röhrchen des Zielbiomoleküls zu übertragen. Lassen Sie den Roboter dann die Lösungen gründlich mischen. Für die NMR-Erfassung wird die Probe in das Spektrometer geladen.Öffnen Sie die Spektrometer-Software und wählen Sie dann den Parametersatz und die Pulssequenzen für ligandenbasierte Experimente aus. Wählen Sie für alle aufgeführten Experimente die Anregungsformung als Wasserunterdrückung aus. Wählen Sie für das Fluor-19-Screening sowohl 1D- als auch T2-Experimente aus.Wählen Sie die spektrale Breite auf 220 Teile pro Million, die Anregungsfrequenz auf 140 Teile pro Million und die Analysezeit zwischen einer und fünf Stunden. Für T2 sollte die CPMG-Zeit zwischen 5 und 100 Millisekunden liegen. Zeichnen Sie die T1r- und T2-Experimente auf.Zeichnen Sie die Sättigungsübertragungsdifferenz als Pseudo-2D auf. Um die beiden einzelnen 1D-Spektren zu verarbeiten, verwenden Sie die Funktion ProcStd des AU-Programms, mit oder ohne die Relax-Option. Der WaterLOGSY ist ein einzelner 1D, der mit einem negativen Signal für das Lösungsmittelsignal phasengesteuert werden sollte.Um die Wasserstoff-Screening-Daten zu analysieren, befolgen Sie die Anweisungen für das fragmentbasierte Screening-Tool, um die biomolekularen Magnetresonanz-NMR-Daten aus Screening-Kampagnen zu speichern, so dass jedes Screening-Gemisch sein eigenes Verzeichnis hat, in dem ein Unterverzeichnis die verschiedenen an der Probe gemessenen Experimente enthält. Speichern Sie die Referenzspektren, wobei alle Daten aus den Proben ohne das biomolekulare Ziel, aber mit den Mischungen und der einzelnen Verbindung in verschiedenen Verzeichnissen gespeichert sind. Erstellen Sie einen direkten Pfad zu dem Verzeichnis, das die erfassten Daten enthält, und wählen Sie das NMR-Verzeichnis aus, in dem alle Gemische ein eigenes Verzeichnis haben sollen.Stellen Sie sicher, dass die CSV-, Fragment-, XML-Dokument- und BAC-Dateien auch in das NMR-Verzeichnis der Daten kopiert werden. Um das fragmentbasierte Raster für eine gerasterte Probe zu verwenden, ziehen Sie das Symbol für das fragmentbasierte Raster in die Mitte des Analysefensters. Das Symbol sollte angezeigt werden, wenn die zuvor gespeicherten Datensätze in das Symbol kopiert wurden.Das Fenster mit den Optionen für das fragmentbasierte Screening sollte automatisch geöffnet werden. Wählen Sie eine CSV-Cocktaildatei aus, die die Namen der Mixe, die Namen der einzelnen Fragmente und die Aufteilung jedes Fragments in die Mixe enthält. Definieren Sie einen Referenz-Ligandenspektrenordner mit allen gemessenen Spektren der einzelnen Fragmente und definieren Sie einen Referenz-Blanko-Experimentordner, der in der Regel die Datensätze der Mischungen ohne das untersuchte Target enthält.Um die untersuchten Spektren und Spektrendarstellungsfarben zu definieren, öffnen Sie den Reiter Spektrentypen und stellen Sie den Spezifikationstyp entsprechend den Prozessdaten ein. Definieren Sie auf der Registerkarte Anzeigelayout die Spektren, die entsprechend den Spezifikationstypen verglichen werden sollen. Klicken Sie dann auf OK, um das Projekt zu starten.Während die Daten verarbeitet werden, öffnet sich ein separates Fenster mit der Tabelle, in der alle Cocktailmischungen und die Liganden jeder Mischung zusammengefasst sind. Doppelklicken Sie auf eine Zelle, um die entsprechenden Datensätze zu öffnen. Stellen Sie vor der Zuweisung von Bindemitteln sicher, dass die Referenzpeaks miteinander übereinstimmen und die gleiche chemische Verschiebung aufweisen.Wenn Unterschiede festgestellt werden, öffnen Sie die Registerkarte Prozess, und verwenden Sie die Option serielle Verarbeitung, um diese zu korrigieren. Für die erste Analyse der Fluor-19-Gemische öffnen Sie die Registerkarte Analysieren und wählen Sie die Funktion integrieren aus. Stellen Sie sicher, dass für jedes Fragment im Gemisch ein eindeutiger Integrationsbereich für das entsprechende Fluor-19-Signal definiert ist.Exportintegrationsbereiche speichern, um die Integrationsdatei für die zukünftige Verwendung zu exportieren, und alle verwendeten Integrationsdateien im entsprechenden Installationsverzeichnis speichern. Öffnen Sie für Fluor-19-Daten einen Datensatz mit oder ohne das untersuchte Ziel, und klicken Sie auf der Registerkarte "Analysieren" auf "Integrationsbereiche importieren und lesen", um die entsprechende Integrationsdatei in das aktuelle Spektrum zu laden. Klicken Sie dann auf Speichern und zurück, um eine Liste der integrierten Regionen auf der Registerkarte Integrale zu suchen, und kopieren Sie diese Informationen in eine Tabelle für die nachgelagerte Analyse.Die molekulare Struktur oder Konstitution der Liganden in der Fragmentbibliothek wird wie demonstriert mit Hilfe einer Molecular Confidence Software analysiert und die Ergebnisse werden als grafische Ausgabe dargestellt. Eine orange Farbe zeigt an, dass das Fragment eine Inkonsistenz in der Struktur oder Konzentration aufweist. Grün eingefärbte Vertiefungen zeigen an, dass das Fragment konsistent ist.In dieser repräsentativen Analyse wurden 103 Fragmente, die eine oder mehrere Fluorgruppen aus der hauseigenen Bibliothek enthielten, in fünf Mischungen zu je 20 bis 21 Fragmenten aufgeteilt. Fluor-19-Transversalrelaxationsexperimente wurden für jedes Gemisch gemessen, das CPMG-Pulsfolgen anwendete. Schwellenwerte sind nützlich, um Bindemittel, schwache Bindemittel oder Nicht-Bindemittel in der Mischung zu definieren, wie sie in diesen typischen Thiaminprotein-Tyrosinkinase-A- und RNA-Spektren beobachtet werden.In dieser repräsentativen Analyse zeigte der erste Treffer eine T2-Abnahme von etwa 50 % und eine chemische Verschiebung von mindestens sechs Hertz. Der WaterLOGSY zeigte keine signifikante Veränderung des Signals, um als positiv gewertet zu werden. Da jedoch zwei von drei Experimenten positiv verliefen, wurde dieses Fragment als Treffer gewertet.Für den zweiten Treffer zeigte der T2 eine Abnahme der Signalintensität um etwa 80 %. Auch für den WaterLOGSY wurde eine deutliche Signaländerung beobachtet. Die chemische Verschiebung reichte in diesem Experiment nicht aus, aber da die beiden vorherigen Kriterien positiv waren, wurde sie dennoch als Treffer gewertet.Das Endziel solcher Methoden ist es, neue Medikamente oder hochaffine Inhibitoren von beispielsweise Enzymen zu entwickeln, und dabei übernimmt die medizinische Chemie und synthetisiert diese neuen Moleküle, aber die Strukturbiologie, die Techniken, die Sie hier anwenden, können die medizinische Chemie leiten und diesen Ansatz viel schneller machen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Forschung

Biochemie

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Echtzeit-Tracking der DNA-Fragment-Trennung durch Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Ein All-in-One-Probenhalter für makromolekulare Röntgenkristallographie mit minimaler Hintergrundstreuung

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening auf Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitoren

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

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Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Workflow und Tools für das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...