Name: nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode
Uploaded: 2021-06-04T15:00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי iNEXT-Discovery, פרויקט מספר 871037, שמומן על ידי תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית.

<ol>
	<li>Yanamala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-Based+Screening+of+Membrane+Protein+Ligands.">NMR-Based Screening of Membrane Protein Ligands.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 75, 237-256 (2010).</li><li>Souers, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABT-199,+a+potent+and+selective+BCL-2+inhibitor,+achieves+antitumor+activity+while+sparing+platelets.">ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets.</a> Nature Medicine. 19, 202-208 (2013).</li><li>Su, M. C., Te Chang, C., Chu, C. H., Tsai, C. H., Chang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atypical+RNA+pseudoknot+stimulator+and+an+upstream+attenuation+signal+for+-1+ribosomal+frameshifting+of+SARS+coronavirus.">An atypical RNA pseudoknot stimulator and an upstream attenuation signal for -1 ribosomal frameshifting of SARS coronavirus.</a> Nucleic Acids Research. 33, 4265-4275 (2005).</li><li>Perera, T. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+&amp;+pharmacological+characterization+of+JNJ-42756493+(Erdafitinib),+a+functionally+selective+small-molecule+FGFR+family+inhibitor.">Discovery &amp; pharmacological characterization of JNJ-42756493 (Erdafitinib), a functionally selective small-molecule FGFR family inhibitor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16, 1010-1020 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+pharmacology+of+a+highly+specific+dual+FMS+and+KIT+kinase+inhibitor.">Design and pharmacology of a highly specific dual FMS and KIT kinase inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5689-5694 (2013).</li><li>Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., Feeney, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+computational+approaches+to+estimate+solubility+and+permeability+in+drug+discovery+and+development+settings.">Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 23, 3-25 (1997).</li><li>Congreve, M., Carr, R., Murray, C., Jhoti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+'Rule+of+Three'+for+fragment-based+lead+discovery.">A 'Rule of Three' for fragment-based lead discovery.</a> Drug Discovery Today. 8, 876-877 (2003).</li><li>Ch&#225;vez-Hern&#225;ndez, A. L., S&#225;nchez-Cruz, N., Medina-Franco, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+Library+of+Natural+Products+and+its+Comparative+Chemoinformatic+Characterization.">A Fragment Library of Natural Products and its Comparative Chemoinformatic Characterization.</a> Molecular Informatics. 39, 2000050 (2020).</li><li>Sreeramulu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+quality+control+of+fragment+libraries+for+screening.">NMR quality control of fragment libraries for screening.</a> Journal of Biomolecular NMR. , 00327-00329 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+NMR+Fragment+Based+Screening+Identified+a+Novel+Interface+Blocker+to+the+LARG/RhoA+Complex.">Automated NMR Fragment Based Screening Identified a Novel Interface Blocker to the LARG/RhoA Complex.</a> PLoS One. 9, 88098 (2014).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Efficient+Fragment-Based+Lead+Generation+by+Fully+Automated+Processing+and+Analysis+of+Ligand-Observed+NMR+Binding+Data.">Fast and Efficient Fragment-Based Lead Generation by Fully Automated Processing and Analysis of Ligand-Observed NMR Binding Data.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 3303-3310 (2016).</li><li>Cox, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP(2),+an+atypical+bromodomain.">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).</li><li>Hwang, T. L., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Suppression+That+Works.+Excitation+Sculpting+Using+Arbitrary+Wave-Forms+and+Pulsed-Field+Gradients.">Water Suppression That Works. Excitation Sculpting Using Arbitrary Wave-Forms and Pulsed-Field Gradients.</a> Journal of Magnetic Resonance, Series A. 112, 275-279 (1995).</li><li>Gossert, A. D., Jahnke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+in+drug+discovery:+A+practical+guide+to+identification+and+validation+of+ligands+interacting+with+biological+macromolecules.">NMR in drug discovery: A practical guide to identification and validation of ligands interacting with biological macromolecules.</a> Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 97, 82-125 (2016).</li><li>Sklenar, V., Bax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+water+suppression+technique+for+generating+pure-phase+spectra+with+equal+excitation+over+a+wide+bandwidth.">A new water suppression technique for generating pure-phase spectra with equal excitation over a wide bandwidth.</a> Journal of Magnetic Resonance. 75, 378-383 (1987).</li><li>Binas, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=19F+NMR-Based+Fragment+Screening+for+14+Different+Biologically+Active+RNAs+and+10+DNA+and+Protein+Counter-Screens.">19F NMR-Based Fragment Screening for 14 Different Biologically Active RNAs and 10 DNA and Protein Counter-Screens.</a> ChemBioChem. , (2020).</li></ol>

רב-תכליתיות של מקטע מבוסס NMR / בדיקת תרופות. BMRZ יישמה בהצלחה מכשור NMR אוטומטי חדיש, כמו גם ניסויי STD-NMR, waterLOGSY והרפיה כדי לזהות מקטעים בתוך מגוון רחב של משטר זיקה לגילוי תרופות. החומרה המותקנת כוללת רובוט להכנת דגימות בתפוקה גבוהה ויחידת אחסון, מחליף ורכישת נתונים בתפוקה גבוהה המשויכת לספקטרומטר של 600 מגה-הרץ. בדיקה קריוגנית שנרכשה לאחרונה עבור 1 H, 19 F, 13C ו- 15N מבטיחה את הרגישות הנדרשת למדידות המוצעות ומאפשרת ניתוק של1 H (1) במהלך זיהוי 19F. בדיקה זו מחוברת לדור האחרון של קונסולת NMR המציעה את האפשרות להשתמש בכלי התוכנה המתקדמים של Bruker, כולל CMC-q, CMC-assist, CMC-se ו- FBS (כלולים ב- TopSpin). כלי הסינון מבוסס הפרגמנטים (FBS) כלול בגרסה האחרונה של TopSpin ומסייע לנתח את הנתונים בעלי התפוקה הגבוהה הכוללים ניסויי הרפיה STD, waterLOGSY, T2/T1r. ניתן למלא את אוסף הדגימות הנוזלי 1D 1H לתוך צינורות NMR באופן אוטומטי באמצעות רובוט מילוי הדגימה. בדרך כלל, בלוק של 96 צינורות (3 מ"מ) מלאים כשעתיים. מתלי 96 הלוחות ממוקמים ישירות במחליף הדגימות HT, אשר קורא את הברקוד של הבלוק ומקצה את צינורות ה- NMR לניסויים הנשלטים על ידי תוכנת האוטומציה (IconNMR). ניתן לאחסן ולתכנת חמישה ארונות תקשורת בעלי 96 בארות במחליף הדגימות HT בו זמנית. הטמפרטורה של כל אחד מהארונות הנפרדים ניתנת לשליטה ולוויסות בנפרד. בנוסף, ניתן להתנות מראש כל דגימה בודדת (חימום מקדים וייבוש צינורית להסרת לחות מעובה) לטמפרטורה הרצויה לפני המדידה.
התאמה למגוון רחב של יישומים. אחד היישומים הרחבים של סינון אוטומטי מבוסס NMR זה הוא לזהות ולפתח ליגנדות חדשות הנקשרות למטרה ביו-מקרומולקולרית (DNA/RNA/חלבונים). ליגנדות אלה יכולות לכלול מעכבים אורתוסטריים ואלוסטאריים שבדרך כלל נקשרים באופן לא קוולנטי. יתר על כן, FBDD על ידי NMR משמש בדרך כלל כצעד ראשון לבחירת תרכובות מבטיחות, הדרישות שיש לעמוד בהן הן זמינות המטרה הביומולקולרית בכמויות מספיקות. מטרה זו מחולקת לשתי משימות עיקריות.
המשימה הראשונה היא לפתח ולאפיין ספריית מקטעים פנימית מהסיבות הבאות: בקרת איכות ראשונית ותקופתית, אפיון וכימות של יותר מ-1000 מקטעים; קביעת מסיסות המקטעים במאגרים המותאמים לכל מטרה, במיוחד למטרות חלבון; והקמתן של מספר ספריות כדי להכיל פיגומים מגוונים ולהתרחב למחלקות מקרומולקולות אחרות. המשימה השנייה היא לשלב זרימות עבודה עבור תכנון תרופות מבוססות מקטעים (FBDD) על ידי NMR באמצעות: סריקה אוטומטית של ליגנד 1D שנצפה (1H ו-19F שנצפו); בדיקות החלפה אוטומטיות (ניסויי תחרות עם ליגנד (טבעי) כדי להבדיל בין קשירה אורתוסטרית לקשירה אלוסטרית; הקרנות משניות אוטומטיות עם קטעים מרובים; סינון אוטומטי של חלבון דו-ממדי, וסינון משני של קבוצה של נגזרות סביב להיט ראשוני תוך שימוש בספריית EU-OPENSCREEN או בכל ספרייה אחרת; ויצירת פרופיל מחדש של סינון ספריית ה-FDA כנגד המטרות שנבחרו.
בנוסף, ניתן לבצע מטבוליטיפ של קווי תאים שונים (רלוונטיים למחלות) על מנת לפענח את מנגנוני הבקרה המקשרים בין בקרת מחזור התא לבין חילוף החומרים. כמו כן, קיים אפיון פונקציונלי של רכיבי ויסות RNA/DNA/חלבונים in vivo ו-in vitro לאופטימיזציה של מבנה/תחום (אופטימיזציה של יציבות לחקירות מבניות (Buffer, pH, טמפרטורה וסינון מלחים), והרחבה של סינון מקטעים מבוסס NMR לחלבוני ממברנה וחלבונים בעלי אי-סדר פנימי, אשר בדרך כלל אינם נגישים לטכניקות אחרות.
מגבלות. לשימוש בספריות שברי 19F ו- 1H יש יתרונות וחסרונות, שרק מעטים מהם יוזכרו להלן. היתרון הגדול ביותר של מדידות של 19F לעומת 1H הוא המהירות הן של זמן המדידה בפועל והן של הניתוח שלאחר מכן, מכיוון שהתערובות מכילות מספר כמעט כפול של מקטעים ויש לבצע פחות ניסויים. ניתוח המעקב הוא גם קל יותר עבור סינון 19F, מכיוון שאין הפרעה של מאגרים ובנוסף מציע טווח שינוי כימי רחב יותר כמעט ללא חפיפת אות עבור תערובת מקטעים שתוכננה בצורה אופטימלית. הספקטרום עצמו מפושט מאוד, בדרך כלל יש רק אות אחד או שניים לכל מקטע, בהתאם למספר אטומי פלואור. לפיכך, ניתוח הספקטרום הזה יכול להיות אוטומטי, ושוב לקצר את הזמן. זה בא על חשבון המגוון הכימי, לפחות עבור הספרייה ששימשה במחקר זה. מכיוון שרק ~13% מהספרייה מכילה 19 F, אך באופן טבעי כולם ניתנים לשימוש בהקרנה של 1 H, המגוון של קטעי ההקרנה של 19F יהיה נמוך יותר. ניתן לעקוף זאת באמצעות ספריות 19F שתוכננו במיוחד עם יותר מקטעים ומגוון כימי גדול יותר. חסרון נוסף להקרנת 19F הוא מספר האותות הנמוך לכל מקטע. מקטעים מורכבים בדרך כלל מיותר מאטום מימן אחד. לכן, ניסויי סינון שנצפו ב-1H יכולים להסתמך על אותות שונים עבור אותו מקטע לצורך זיהוי קשירה. זה נותן רמה גבוהה יותר של ביטחון בעת זיהוי פגיעות עבור הקרנת 1H, בעוד שהקרנת 19F חייבת להסתמך על אות אחד או שניים שניתנו לכל מקטע.
הוצג תיאור מפורט של המכשור המודרני האוטומטי לסינון מקטעים מבוסס NMR, תוכנות ושיטות ניתוח ופרוטוקולים שלהם. החומרה המותקנת כוללת רובוט להכנת דגימות בתפוקה גבוהה ויחידת אחסון, מחליף ורכישת נתונים בתפוקה גבוהה המשויכת לספקטרומטר של 600 מגה-הרץ. ראש בדיקה קריוגני שהותקן לאחרונה עבור 1 H, 19 F, 13 C ו- 15N מבטיח את הרגישות הנדרשת למדידות המוצעות ומאפשר ניתוק של 1H במהלך זיהוי 19F. יתר על כן, הדור האחרון של קונסולת NMR מציע את האפשרות להשתמש בתוכנה אנליטית מתקדמת לסיוע ברכישה וניתוח תוך כדי תנועה. הטכנולוגיה, זרימות העבודה והפרוטוקולים המתוארים לעיל צריכים לטפח הצלחה יוצאת דופן למשתמשים הרודפים אחר FBS על ידי NMR.

סינון מבוסס מקטעים הוא כיום שיטה נפוצה לזיהוי מולקולות פשוטות למדי ובעלות משקל מולקולרי נמוך (MW <250 Da) המראות קשירה חלשה למטרות מקרומולקולריות כולל חלבונים, DNA ו- RNA. פגיעות ראשוניות ממסכים ראשוניים משמשות כבסיס לביצוע מסך משני של אנלוגים גדולים יותר הזמינים מסחרית של הלהיטים, ולאחר מכן לשימוש באסטרטגיות גידול או קישור מקטעים מבוססות כימיה. עבור פלטפורמה מוצלחת לגילוי תרופות מבוססות פרגמנטים (FBDD), באופן כללי, נדרשת שיטה ביופיזיקלית חזקה לאיתור ואפיון פגיעות חלשות, ספריית מקטעים, מטרה ביומולקולרית ואסטרטגיה לכימיית המשך. ארבע שיטות ביופיזיקליות נפוצות המיושמות בקמפיינים לגילוי תרופות הן בדיקות שינוי תרמי, תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), קריסטלוגרפיה וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR).
ספקטרוסקופיית NMR הציגה תפקידים מגוונים בשלבים השונים של FBDD. מלבד הבטחת הטוהר הכימי והמסיסות של המקטעים בספריית מקטעים המומסת במערכת חיץ אופטימלית, ניסויי NMR שנצפו על ידי ליגנד יכולים לזהות קשירת מקטעים למטרה עם זיקה נמוכה וניסויי NMR שנצפו במטרה יכולים לשרטט את אפיטופ הקישור של המקטע, ובכך לאפשר מחקרי יחסי מבנה-פעילות מפורטים. במסגרת מיפוי אפיטופים, שינויי הזזה כימיים מבוססי NMR אינם יכולים לזהות רק את אתרי הקישור האורתוסטריים, אלא גם אתרים אלוסטריים שעשויים להיות מוצפנים ונגישים רק במה שמכונה מצבי קונפורמציה מעוררים של המטרה הביומולקולרית. אם המטרה הביומולקולרית כבר קושרת ליגנד אנדוגני, ניתן לסווג בקלות את פגיעות המקטע שזוהו כאלוסטריות או אורתוסטריות על ידי ביצוע ניסויי תחרות מבוססי NMR. קביעת קבוע הדיסוציאציה (KD) של אינטראקציית ליגנד-מטרה היא היבט חשוב בתהליך FBDD. ניתן לבצע בקלות טיטרציות הזזה כימיות מבוססות NMR, ליגנד או מטרה שנצפו כדי לקבוע את KD. יתרון מרכזי של NMR הוא שמחקרי האינטראקציה מבוצעים בתמיסה ובסמוך לתנאים פיזיולוגיים. לפיכך, ניתן לבחון את כל מצבי הקונפורמציה לניתוח אינטראקציית ליגנד/פרגמנט עם מטרתו. יתר על כן, גישות מבוססות NMR אינן מוגבלות רק לסינון של חלבונים מסיסים מקופלים היטב, אלא גם מיושמות כדי להתאים למרחב מטרה גדול יותר, כולל DNA, RNA, חלבונים הקשורים לממברנה וחלבונים בעלי הפרעה פנימית1.
ספריות פרגמנטים הן חלק חיוני בתהליך FBDD. באופן כללי, מקטעים פועלים כמבשרים ראשוניים אשר בסופו של דבר הופכים לחלק (תת-מבנה) של המעכב החדש שפותח עבור מטרה ביולוגית. מספר תרופות (Venetoclax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) דווחו כי החלו כשברים וכעת משתמשים בהן בהצלחה במרפאות. בדרך כלל, מקטעים הם מולקולות אורגניות בעלות משקל מולקולרי נמוך (<250 Da) עם מסיסות מימית גבוהה ויציבות. ספריית פרגמנטים מתוכננת בקפידה המכילה בדרך כלל כמה מאות פרגמנטים, יכולה כבר להבטיח חקירה יעילה של החלל הכימי. ההרכב הכללי של ספריות מקטעים התפתח במשך שעות ארוכות ולרוב נגזר על ידי ניתוח תרופות ידועות למקטעים קטנים יותר או שתוכננו באופן חישובי. ספריות פרגמנטים מגוונות אלה מכילות בעיקר ארומטים שטוחים או הטרואטומים ונצמדות לחוק ליפינסקי של 5 6, או למגמה המסחרית הנוכחית כלל 3 7, אך הימנעו מקבוצות תגובתיות. חלק מספריות המקטעים נגזרו או הורכבו גם ממטבוליטים מסיסים מאוד, מוצרים טבעיים או נגזרותיהם8. אתגר כללי שמציבות רוב ספריות המקטעים הוא קלות הכימיה במורד הזרם.
המרכז לתהודה מגנטית ביומולקולרית (BMRZ) באוניברסיטת גתה בפרנקפורט, שותף של iNEXT-Discovery (תשתית ל-NMR, EM וקרני רנטגן למחקר תרגומי-גילוי), קונסורציום לתשתיות מחקר מבניות לכל החוקרים האירופאים מכל תחומי המחקר הביוכימי והביו-רפואי. במסגרת היוזמה הקודמת של iNEXT שהסתיימה בשנת 2019, נוצרה ספריית מקטעים הכוללת 768 מקטעים במטרה "מינימום מקטעים וגיוון מקסימלי" המכסה חלל כימי גדול. יתר על כן, בניגוד לכל ספריית פרגמנטים אחרת, ספריית הפרגמנטים iNEXT תוכננה גם היא על בסיס הרעיון של "פרגמנטים מפויחים" במטרה להקל על סינתזה במורד הזרם של ליגנדות מורכבות בעלות זיקה גבוהה ומעתה ואילך תיקרא ספרייה פנימית (Diamond, Structural Genomic Consortium ו-iNEXT).
הקמת FBDD על ידי תמ"ג דורשת כוח אדם, ידע ומכשור . ב- BMRZ פותחו זרימות עבודה ממוטבות לתמיכה בסיוע טכני לסינון מקטעים על ידי NMR. אלה כוללים בקרת איכות והערכת מסיסות של ספריית המקטעים 9, אופטימיזציה של חיץ עבור המטרות שנבחרו, 1 H או 19F- נצפה 1D ליגנד מבוסס הקרנה, ניסויי תחרות כדי להבדיל בין קשירה אורתוסטרית ו allosteric, מטרות מבוססות 2D נצפו ניסויי NMR עבור מיפוי אפיטופים,ולאפיון האינטראקציה עם קבוצה משנית של נגזרות של פגיעות השבר הראשוני. BMRZ קבעה שגרות אוטומטיות לניתוח, כפי שנדון בעבר גם בספרות 10,11, של אינטראקציות מולקולות קטנות וחלבונים ויש לה את כל התשתית האוטומטית הדרושה לסינון מקטעים מבוסס NMR. היא יישמה הפרשי העברת רוויה NMR (STD-NMR), ליגנד מים שנצפה באמצעות ספקטרוסקופיית שיפוע (waterLOGSY), וניסויי הרפיה מבוססי Carr-Purcell-Meiboom-Gill (מבוססי CPMG) כדי לזהות מקטעים בתוך מגוון רחב של משטרי זיקה, כמו גם מכשור NMR אוטומטי מתקדם ותוכנה לגילוי תרופות. בעוד שסינון מקטעים מבוסס NMR מבוסס היטב עבור חלבונים, גישה זו פחות נפוצה למציאת ליגנדות חדשות המקיימות אינטראקציה עם RNA ו- DNA. BMRZ ביססה הוכחת היתכנות לפרוטוקולים חדשים המאפשרים זיהוי אינטראקציות מולקולה-רנ"א/דנ"א קטנות. בסעיפים הבאים של תרומה זו, יישום של שגרות סינון על דגימות חלבון ורנ"א מדווח כדי ליידע את הפרוטוקולים שנקבעו עבור בסיס משתמשים רחב במחקר ביומקרומולקולרי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Avance III HD</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>600 MHz NMR Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes</td>
			<td>3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Barcoded Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix SepraSeal und DuraSeal&#38;</td>
			<td>4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SampleJet</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>HT Sample Changer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SamplePro Tube</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Pipetting Robot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode

סינון מבוסס פרגמנטים (FBS) הוא מושג מאומת ומקובל בתהליך גילוי התרופות הן באקדמיה והן בתעשייה. היתרון הגדול ביותר של סינון מקטעים מבוסס NMR הוא היכולת שלו לא רק לזהות קלסרים מעל 7-8 סדרי גודל של אהדה, אלא גם לפקח על טוהר ואיכות כימית של השברים ובכך לייצר להיטים באיכות גבוהה ומינימום תוצאות חיוביות שגויות או שליליות כוזבות. תנאי מוקדם בתוך FBS הוא לבצע בקרת איכות ראשונית ותקופתית של ספריית המקטעים, קביעת מסיסות ושלמות כימית של המקטעים במאגרים רלוונטיים, והקמת ספריות מרובות כדי לכסות פיגומים מגוונים כדי להתאים למחלקות מטרה מקרומולקולות שונות (חלבונים/RNA/DNA). יתר על כן, נדרשת אופטימיזציה נרחבת של פרוטוקול סינון מבוסס NMR ביחס לכמויות הדגימה, מהירות הרכישה והניתוח ברמת המבנה הביולוגי / מרחב מקטעים, במרחב התנאים (חיץ, תוספים, יונים, pH וטמפרטורה) ובמרחב ליגנד (אנלוגים של ליגנדים, ריכוז ליגנד). לפחות באקדמיה, מאמצי סינון אלה נעשו עד כה באופן ידני באופן מוגבל מאוד, מה שהוביל לזמינות מוגבלת של תשתיות סינון לא רק בתהליך פיתוח התרופות אלא גם בהקשר של פיתוח בדיקות כימיות. על מנת לעמוד בדרישות מבחינה כלכלית, מוצגים תהליכי עבודה מתקדמים. הם מנצלים את החומרה המתקדמת העדכנית ביותר, שבעזרתה ניתן למלא את אוסף הדגימות הנוזליות בצורה מבוקרת טמפרטורה לתוך צינורות NMR באופן אוטומטי. 1ספקטרום מבוסס ליגנד H/19F NMR נאסף לאחר מכן בטמפרטורה נתונה. מחליף דגימות בתפוקה גבוהה (מחליף דגימות HT) יכול לטפל ביותר מ-500 דגימות בבלוקים מבוקרי טמפרטורה. זה יחד עם כלי תוכנה מתקדמים מאיץ את איסוף הנתונים וניתוחם. יתר על כן, יישום של שגרות סינון על דגימות חלבון ורנ"א מתוארים כדי להיות מודעים לפרוטוקולים שנקבעו עבור בסיס משתמשים רחב במחקר ביומקרומולקולרי.

בקרת איכות של ספריית פרגמנטים השברים מהספרייה הפנימית נמסרו כתמיסות מלאי של 50 מילימטר ב-90% d6-DMSO ו-10%D 2 O (10% מ-D2O מבטיח מזעור של התפרקות תרכובת עקב מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים14). דגימות תרכובת בודדות כללו ליגנד 1 mM במאגר פוספט של 50 mM (25 mM KPi pH 6.2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl 2), pH 6.0 ב-90% H 2 O/9% D2O/1% d6-DMSO. 1ניסויי H-NMR של מקטעים מספריית iNEXT נמדדו על ספקטרומטר NMR של 500/600 MHz. נתונים אלה שימשו גם לזיהוי התרכובות הבודדות במסעות סינון של 1 H באמצעות תוכנת CMC-q המאפשרת למשתמש לרכוש ספקטרום באופן אוטומטי באופן אוטומטי, ותוסף הניתוח CMC-a הוערך האיכות (מסיסות ושלמות) שלהמקטעים. התוצאות מהניתוח האוטומטי של CMC-a מוצגות כפלט גרפי דומה למה שמיוצג באיור 3. הפלט הגרפי מציג ייצוג של לוח 96 בארות. עיגול בצבע אדום פירושו שקטע זה מראה חוסר עקביות במבנה או בריכוז. בארות בצבע ירוק מעידות על עקביות השבר.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig03.jpg"> איור 3: בקרת איכות של ספריית פרגמנטים. ייצוג סכמטי של פלט אוטומטי מבוסס CMC-a. תכונות פרגמנט כגון ריכוז ושלמות מבנית מוערכות. ירוק מייצג עקבי, כתום במקרה זה מייצג לא עקבי. מקטעים לא עקביים משתנים באופן ידני בהתאם לזרימת העבודה המוצגת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כ-65% ו-35% מהשברים סווגו כעקביים ולא עקביים, בהתאמה, הן ב-DMSO והן בחיץ. יתר על כן, 30% מהליגנדות המסווגות הלא עקביות הפכו עקביות לאחר בדיקה ידנית קפדנית של ספקטרום9.
עיצוב תערובת 19 F 103 קטעים שהכילו קבוצת פלואור אחת או יותר מספריית הבית חולקו ל-5 תערובות (A, B, C, D, E). בכל תערובת יש 20 עד 21 שברים. במקרה זה, התערובות היו צריכות להיות מתוכננות בקפידה כדי למנוע חפיפת אותות. 19F ניסויי הרפיה רוחביים נמדדו עבור כל תערובת המפעילה רכבות דופק CPMG. ניסויים אלה יכולים להשתנות על ידי שינוי עיכובי הרפיה. ניתן לראות את השינוי הכימי 19F של תערובות A-E באיור 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig04.jpg"> איור 4: ספקטרום 19F 1D-NMR של דגימות תערובת מהספרייה הביתית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הכנת דוגמאות הכנת הדגימה בהליך סינון 19F נעשתה באופן ידני או באמצעות פיפטינג אוטומטי באמצעות רובוט פיפטינג. השברים בכל תערובת היו בעלי ריכוז של 2.5 מילימטר ב-90% d6-DMSO ו-10% D2O. הנפח הסופי של דגימת הסינון היה 170 μL עם 5% D2O כסוכן נעילה. כל תערובת הותקפה פעמיים, אחת בחיץ המכיל תמיסה (ללא מטרה) ואחת למטרה המכילה תמיסת חיץ. היחס בין המטרה לשבר נקבע ל-1:1, והתוצאה הייתה ריכוז מטרה/ליגנד סופי של 50 מיקרומטר. בנוסף, דגימות בקרה הן ביומולקולת המטרה במאגר סינון ללא תערובת כדי להבטיח את שלמות המטרה, כמו גם דגימת בקרה עם חיץ בלבד ו-D2O כדי להבטיח את איכות החיץ.
נתוני סינון NMR של 19 F-1D ו-19F-CPMG-T2 היו מדידות כמתואר בסעיף 3.1. לדוגמה, במקרה של RNA נרכש רצף הד קפיצה-חזרה (pp = zggpjrse,15) עבור דגימת המטרה היחידה בחיץ.
ניתוח נתונים הליך הסינון של 19F הוחל על TPP riboswitch thiM מ E. coli וחלבון טירוזין קינאז (PtkA) מ M. tuberculosis בין מספר מטרות אחרות16. בספריית הסינון 19F יש 103 קטעים המחולקים ל-5 מיקסים המסומנים ממיקס A עד E. הכנת דגימות הסינון יכולה להתבצע באופן ידני ללא שימוש ברובוט צנרת דגימה. 40 μM thiM RNA המכיל תמיסה (תנאי חיץ) עורבב עם 3.2 μL מהתערובות. הוכנו דגימות בקרה נוספות המורכבות מחיץ בלבד, חיץ עם 5% של DMSO (בעבר להבטיח את יציבות הביומקרומולקולה בנוכחות ריכוז DMSO הרצוי) וחיץ עם RNA. 13 דגימות הסינון הללו הוכנו והועברו לצינורות NMR בקוטר 3 מ"מ. ברקודים של צינורות NMR נסרקים וכל תערובת בנוכחות והיעדר RNA, כמו גם דגימות בקרה נמדדו על פי 19ניסויי F NMR שהוזכרו לעיל שבוצעו ב 298 K. סינון של thiM RNA מול הספרייה הפנימית בוצע על ידי ביצוע מדידות T2 עם CPMG של 0 ms ו 200 ms עבור כל דגימה שונה. שימינג תקין ודיכוי מים נוטרו לאחר סיום המדידות על ידי השוואת כל שיאי DMSO במונחים של הרחבת קווים ואובדן עוצמה של ניסויי 1 H1D שנמדדו בנוסף עבור כל הדגימות. עיבוד ספקטרום הרפיה CPMGT 2 19F המתקבל בוצע באמצעות מאקרו שהוכן בעבר ואוטומטי ב- TopSpin, בהתאמה. ניתוח הנתונים בוצע בהתאם להוראות בסעיף הפרוטוקול. הנתונים האינטגרליים המתקבלים מ- TopSpin (בהתאם להוראות בפרוטוקול) ניתנים להערכה במהירות ובקלות באמצעות גיליון אלקטרוני מוכן מראש או כל תוכנית דומה, על ידי הגדרת התנאים והספים הנכונים. כפי שתואר קודם לכן, ערכי סף שימושיים בהגדרת קלסר, קלסר חלש או לא קלסר. איור 5 מראה תוצאות אופייניות של ספקטרום CPMG של thiM RNA ו-PtkA, בהתאמה. במקרים מסוימים, היה צורך בתיקון מומחה נוסף.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig05.jpg"> איור 5: חתך מתוך 19F CPMG NMR SPECTRA המראה את שינויי העוצמה המתקבלים מזמני עיכוב שונים של ניסויים מבוססי CPMG . (A) ייצוג של קלסר (מכה) ואי-קלסר בסינון מבוסס מקטע 19F המבוצע על RNA TPP riboswitch thiM מ-E. coli. (B) ייצוג של קלסר ואי-קלסר בהקרנה מבוססת שבר 19F שבוצעה ב-PtkA מ-M. tuberculosis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הקרנה של 1שעות
עיצוב תערובת הספרייה המשומשת בתוך הבית כל כך מגוונת שלמטרות הקרנה של 1H לא בוצע עיצוב תערובת. משמעות הדבר היא כי 64 תערובות הוכנו על ידי בחירה אקראית 12 להיות ערבוב בתערובת אחת.
הכנת דוגמאות עבור הקרנה של 1 H שלRNA מופתי של SARS-CoV-2, בוצעה פיפטינג אוטומטי באמצעות רובוט פיפטינג להכנת הדגימות. השברים בכל תערובת היו בעלי ריכוז של 4.2 mM ב-90% d6-DMSO ו-10% D2O. הנפח הסופי של דגימת הסינון היה 200 μL עם 5% D2O כסוכן נעילה. 64 דגימות שכל אחת מהן הכילה תערובת שונה ב-25 mM KPi, 50 mM KCl ב-pH 6.2 נלקחו ללא RNA מטרה. בהתאמה, 64 דגימות היו pipeted עם RNA מטרה, כל אחד הכיל תערובת שונה. יחס RNA:Ligand נקבע ל-1:20, וכתוצאה מכך ריכוז RNA של 10 מיקרומטר וריכוז ליגנד של 200 מיקרומטר.
ניתוח נתונים עבור ניתוח 1H, הכלי FBS ב TopSpin שימש. כדי לקבוע אם שבר הוא פגיעה, נערכו ניסויי הרפיה 1D Chemical Shift, waterLOGSY ו-T2 . עבור הרפיה T2 , ירידה בעוצמה גדולה מ -30% נחשבה להיט, בעוד עבור השינוי הכימי שינוי של יותר מ 6 הרץ היה החתך. waterLOGSY היה צריך להראות שינוי אות משמעותי (מ שלילי חיובי במקרה זה). אם אחד משלושת הקריטריונים הללו היה חיובי, רסיס נחשב למכה. שתי דוגמאות לכך ניתן לראות באיור 6.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig06.jpg"> איור 6: בדיקת סקר של 1H שבוצעה על RNA לדוגמה של SARS-CoV-2 המראה קריטריונים לקביעת פגיעה. רכישת שלושה ניסויים שונים (1 H T2 CPMG (5/100 ms), waterLOGSY, ו- 1D 1H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
Hit-1 מראה ירידה של T2 של ~50% ו- CSP ≥ 6 הרץ. waterLOGSY אינו מראה שינוי משמעותי מספיק באות כדי להיחשב גם חיובי. מכיוון ששניים מתוך שלושה ניסויים הם חיוביים, קטע זה נחשב להיט. עבור Hit-2, T2 מראה ירידה של ~ 80% עוצמת האות וניתן לראות שינוי אות ברור עבור waterLOGSY. CSP אינו מספיק במקרה זה, אבל כמו שני הקריטריונים הקודמים הם חיוביים זה עדיין נחשב להיט.

Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

סינון מבוסס מקטעים על ידי NMR הוא שיטה חזקה לזיהוי מהיר של קושרי מולקולות קטנות לביומקרומולקולות (DNA, RNA או חלבונים). מוצגים פרוטוקולים המתארים הכנת דגימות מבוססת אוטומציה, ניסויי NMR ותנאי רכישה ותהליכי עבודה של ניתוח. הטכניקה מאפשרת ניצול אופטימלי של גרעינים פעילים של 1H ו-19F NMR לצורך גילוי.

סינון מקטעים מבוסס NMR במדגם מינימלי אך במצב אוטומציה מקסימלי

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

אנו עורכים מחקרי תהודה מגנטית גרעינית. זה מאפשר לנו לקבוע את המבנים של חלבונים, רנ"א ודנ"א בתמיסה. ביומולקולות אלה הן המרכיבים, הן המרכיבים של התאים שלנו, והפרוטוקולים שאנו מציגים כאן עוסקים בסינון של מולקולות קטנות וקשירתן למטרות אלה.ממולקולות אלה, הכימיה הרפואית והביולוגיה המבנית שלנו יכולות להפיק תרופות חדשות הנלחמות במחלות. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שיש לנו שליטה מלאה על איכות המטרות המולקולריות, כמו החלבונים, ויש לנו שליטה מלאה על איכות מקטעי המולקולות הקטנות והתרופות, ואנחנו יכולים גם לסנן חלבונים לקשירה של מגוון רחב של זיקות, וזה יתרון בהשוואה למתודולוגיות אחרות. כדי להכין דגימות מסך למדידת NMR, השתמשו ברובוט להכנת דגימות כדי לפזר 768 תרכובות לשמונה צלחות של 96 בארות כדי לקבל 64 תערובות המכילות 12 מקטעים לריכוז סופי של 4.2 מילימולר לתערובת.העבר את המטרה הביומולקולרית המעניינת, מדוללת במאגר סינון מתאים, למספר המתאים של צינורות מחליפי דגימות NMR בתפוקה גבוהה של שלושה מילימטר ברקוד, והשתמש ברובוט כדי להעביר 10 מיקרוליטר מכל תערובת ליגנד לכל צינור של ביומולקולת המטרה. לאחר מכן, בקש מהרובוט לערבב את הפתרונות ביסודיות. עבור רכישת NMR, טען את הדגימה לתוך הספקטרומטר.פתח את תוכנת הספקטרומטר, ולאחר מכן, בחר את ערכת הפרמטרים ואת רצפי הפולסים עבור ניסויים מבוססי ליגנד. עבור כל הניסויים המפורטים, בחר פיסול עירור כדיכוי מים. לבדיקת פלואור-19, בחר הן ניסויי 1D והן ניסויי T2.בחר את הרוחב הספקטרלי ל -220 חלקים למיליון, את תדירות העירור ל -140 חלקים למיליון, ואת זמן הניתוח בין שעה לחמש שעות. עבור T2, זמן CPMG צריך לסירוגין בין 5 ל 100 אלפיות השנייה. הקלט את ניסויי T1r ו- T2.רשום את הפרש העברת הרוויה כפסאודו דו-ממדי. כדי לעבד את שני ספקטרום 1D יחיד, השתמש בתוכנית AU ProcStd פונקציה, עם או בלי אפשרות הרפיה. WaterLOGSY הוא 1D יחיד כי צריך להיות פאזי עם שלילי עבור אות ממס.כדי לנתח את נתוני סינון המימן, עקוב אחר ההוראות עבור כלי הסינון מבוסס המקטעים לאחסון נתוני NMR בתהודה מגנטית ביומולקולרית ממסעות סינון, כך שלכל תערובת סינון יש ספרייה משלה שבה תת-ספרייה מכילה את הניסויים השונים שנמדדו על הדגימה. אחסן את ספקטרום הייחוס, עם כל הנתונים שנשמרו מהדגימות ללא המטרה הביומולקולרית, אלא עם התערובות והתרכובת היחידה בספריות שונות. צור נתיב ישיר לספרייה המכילה את הנתונים שנרכשו, ובחר בספריית NMR שבה לכל התערובות צריכה להיות ספרייה נפרדת.ודא שה- CSV, מסך הפרגמנט, מסמך XML וקבצי BAC מועתקים גם לספריית NMR של הנתונים. כדי להשתמש בכלי סינון מבוסס מקטע עבור דגימה שהוקרנה, גרור את סמל פרויקט הסינון המבוסס על מקטע למרכז חלון הניתוח. הסמל אמור להופיע אם ערכות הנתונים שנשמרו בעבר הועתקו לתוכו.חלון אפשרויות הסינון המבוסס על מקטע אמור להיפתח אוטומטית. בחר קובץ קוקטייל CSV המכיל את שמות התערובות, את שמות כל קטע ואת החלוקה של כל קטע לתערובות. הגדר תיקיית ספקטרום ליגנד ייחוס עם כל הספקטרום הנמדד של המקטעים הבודדים, והגדר תיקיית ניסוי ריקה של ייחוס, המכילה בדרך כלל את ערכות הנתונים של התערובות ללא היעד הנחקר.להגדרת צבעי התצוגה של הספקטרום והספקטרום שנחקרו, פתחו את הכרטיסיה 'סוגי ספקטרה' וקבעו את סוג המפרט בהתאם לנתוני התהליך. בכרטיסיה פריסת תצוגה, הגדר את הספקטרום שיושווה בהתאם לסוגי המפרט. לאחר מכן, לחץ על אישור כדי להתחיל את הפרויקט.בזמן עיבוד הנתונים, ייפתח חלון נפרד עם טבלה המסכמת את כל תערובות הקוקטיילים והליגנדות של כל מיקס. לחץ פעמיים על תא כדי לפתוח את ערכות הנתונים המתאימות. לפני הקצאת קלסרים, ודא שפסגות הייחוס תואמות זו לזו ובעלות אותו שינוי כימי.אם נצפים הבדלים, פתח את הכרטיסיה תהליך והשתמש באפשרות העיבוד הטורי כדי לתקן אותם. לניתוח הראשון על תערובות פלואור-19, פתח את הכרטיסייה ניתוח ובחר את פונקציית השילוב. ודא שמוגדר אזור אינטגרציה ברור עבור אות פלואור-19 המתאים לכל קטע בתערובת.שמור אזורי שילוב ייצוא כדי לייצא את קובץ השילוב לשימוש עתידי, ושמור את כל קבצי השילוב המשומשים בספריית ההתקנה המתאימה. עבור נתוני פלואור-19, פתח ערכת נתונים עם או בלי היעד הנחקר, ותחת הכרטיסיה נתח, לחץ על שלב וקרא אזורי שילוב ייבוא כדי לטעון את קובץ השילוב המתאים לספקטרום הנוכחי. לאחר מכן, לחץ על שמור וחזור כדי לאתר רשימה של האזורים המשולבים בכרטיסיה אינטגרלים, והעתק מידע זה לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח במורד הזרם.המבנה המולקולרי או המבנה המולקולרי של הליגנדות בספריית המקטעים מנותח באמצעות תוכנת ביטחון מולקולרית כפי שהודגם והתוצאות מוצגות כפלט גרפי. צבע כתום מציין שהשבר מפגין חוסר עקביות במבנה או בריכוז. בארות בצבע ירוק מעידות על עקביות השבר.בניתוח מייצג זה, 103 קטעים המכילים קבוצת פלואור אחת או יותר מהספרייה הפנימית חולקו לחמש תערובות של 20 עד 21 שברים לתערובת. ניסויי הרפיה רוחביים של פלואור-19 נמדדו עבור כל תערובת שהפעילה רכבות דופק CPMG. ערכי סף שימושיים להגדרת קושר, קושר חלש או לא קושר בתערובת, כפי שנצפה בחלבון תיאמין טיפוסי זה טירוזין קינאז A וספקטרום RNA.בניתוח מייצג זה, פגע אחד הראה ירידה T2 של כ -50% ושינוי כימי גדול או שווה לשישה הרץ. ה- WaterLOGSY לא הראה שינוי משמעותי באות כדי להיספר כחיובי. עם זאת, מכיוון ששניים מתוך שלושה ניסויים היו חיוביים, קטע זה נחשב להיט.עבור מכה שנייה, T2 הראה ירידה של כ -80% בעוצמת האות. שינוי אות ברור נצפה גם עבור WaterLOGSY. השינוי הכימי לא הספיק בניסוי זה, אך מכיוון ששני הקריטריונים הקודמים היו חיוביים, הוא עדיין נחשב להיט.המטרה הסופית של שיטות כאלה היא לפתח תרופות חדשות או מעכבי זיקה גבוהה של, למשל, אנזימים, ובכך, הכימיה הרפואית משתלטת ומסנתזת את המולקולות החדשות האלה, אבל ביולוגיה של מבנה, הטכניקות שאתה מיישם כאן יכולות להנחות את הכימיה הרפואית ולהפוך את הגישה הזו להרבה יותר מהירה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

מעקב בזמן אמת של הפרדת ה- DNA הפרדה על ידי הטלפון החכם

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

הקרנה עבור התרמוטוגה מארימה ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

זרימת עבודה וכלים להקרנת שברים קריסטלוגרפיים בהלמהולץ-זנטרום ברלין

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...