Name: nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode
Uploaded: 2021-06-04T15:00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

Эта работа была поддержана iNEXT-Discovery, проект No 871037, финансируемый программой Horizon 2020 Европейской комиссии.

<ol>
	<li>Yanamala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-Based+Screening+of+Membrane+Protein+Ligands.">NMR-Based Screening of Membrane Protein Ligands.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 75, 237-256 (2010).</li><li>Souers, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABT-199,+a+potent+and+selective+BCL-2+inhibitor,+achieves+antitumor+activity+while+sparing+platelets.">ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets.</a> Nature Medicine. 19, 202-208 (2013).</li><li>Su, M. C., Te Chang, C., Chu, C. H., Tsai, C. H., Chang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atypical+RNA+pseudoknot+stimulator+and+an+upstream+attenuation+signal+for+-1+ribosomal+frameshifting+of+SARS+coronavirus.">An atypical RNA pseudoknot stimulator and an upstream attenuation signal for -1 ribosomal frameshifting of SARS coronavirus.</a> Nucleic Acids Research. 33, 4265-4275 (2005).</li><li>Perera, T. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+&amp;+pharmacological+characterization+of+JNJ-42756493+(Erdafitinib),+a+functionally+selective+small-molecule+FGFR+family+inhibitor.">Discovery &amp; pharmacological characterization of JNJ-42756493 (Erdafitinib), a functionally selective small-molecule FGFR family inhibitor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16, 1010-1020 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+pharmacology+of+a+highly+specific+dual+FMS+and+KIT+kinase+inhibitor.">Design and pharmacology of a highly specific dual FMS and KIT kinase inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5689-5694 (2013).</li><li>Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., Feeney, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+computational+approaches+to+estimate+solubility+and+permeability+in+drug+discovery+and+development+settings.">Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 23, 3-25 (1997).</li><li>Congreve, M., Carr, R., Murray, C., Jhoti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+'Rule+of+Three'+for+fragment-based+lead+discovery.">A 'Rule of Three' for fragment-based lead discovery.</a> Drug Discovery Today. 8, 876-877 (2003).</li><li>Ch&#225;vez-Hern&#225;ndez, A. L., S&#225;nchez-Cruz, N., Medina-Franco, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+Library+of+Natural+Products+and+its+Comparative+Chemoinformatic+Characterization.">A Fragment Library of Natural Products and its Comparative Chemoinformatic Characterization.</a> Molecular Informatics. 39, 2000050 (2020).</li><li>Sreeramulu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+quality+control+of+fragment+libraries+for+screening.">NMR quality control of fragment libraries for screening.</a> Journal of Biomolecular NMR. , 00327-00329 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+NMR+Fragment+Based+Screening+Identified+a+Novel+Interface+Blocker+to+the+LARG/RhoA+Complex.">Automated NMR Fragment Based Screening Identified a Novel Interface Blocker to the LARG/RhoA Complex.</a> PLoS One. 9, 88098 (2014).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Efficient+Fragment-Based+Lead+Generation+by+Fully+Automated+Processing+and+Analysis+of+Ligand-Observed+NMR+Binding+Data.">Fast and Efficient Fragment-Based Lead Generation by Fully Automated Processing and Analysis of Ligand-Observed NMR Binding Data.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 3303-3310 (2016).</li><li>Cox, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP(2),+an+atypical+bromodomain.">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).</li><li>Hwang, T. L., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Suppression+That+Works.+Excitation+Sculpting+Using+Arbitrary+Wave-Forms+and+Pulsed-Field+Gradients.">Water Suppression That Works. Excitation Sculpting Using Arbitrary Wave-Forms and Pulsed-Field Gradients.</a> Journal of Magnetic Resonance, Series A. 112, 275-279 (1995).</li><li>Gossert, A. D., Jahnke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+in+drug+discovery:+A+practical+guide+to+identification+and+validation+of+ligands+interacting+with+biological+macromolecules.">NMR in drug discovery: A practical guide to identification and validation of ligands interacting with biological macromolecules.</a> Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 97, 82-125 (2016).</li><li>Sklenar, V., Bax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+water+suppression+technique+for+generating+pure-phase+spectra+with+equal+excitation+over+a+wide+bandwidth.">A new water suppression technique for generating pure-phase spectra with equal excitation over a wide bandwidth.</a> Journal of Magnetic Resonance. 75, 378-383 (1987).</li><li>Binas, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=19F+NMR-Based+Fragment+Screening+for+14+Different+Biologically+Active+RNAs+and+10+DNA+and+Protein+Counter-Screens.">19F NMR-Based Fragment Screening for 14 Different Biologically Active RNAs and 10 DNA and Protein Counter-Screens.</a> ChemBioChem. , (2020).</li></ol>

Никакой.

Универсальность скрининга фрагментов/лекарств на основе ЯМР. BMRZ успешно внедрил самые современные автоматизированные приборы ЯМР, а также эксперименты по ЗППП-ЯМР, waterLOGSY и релаксации для идентификации фрагментов в широком диапазоне аффинного режима для открытия лекарств. Установленное оборудование включает в себя высокопроизводительный робот для подготовки образцов и высокопроизводительный блок хранения, смены и сбора данных, связанный со спектрометром 600 МГц. Недавно приобретенный криогенный зонд для 1 H, 19 F, 13 C и 15N обеспечивает требуемую чувствительность для предлагаемых измерений и позволяет разъединять 1 H (1) во время обнаружения 19F. Этот датчик подключен к консоли ЯМР последнего поколения, которая дает возможность использовать передовые программные инструменты Bruker, включая CMC-q, CMC-assist, CMC-se и FBS (входит в состав TopSpin). Инструмент скрининга на основе фрагментов (FBS) включен в последнюю версию TopSpin и помогает анализировать высокопроизводительные данные, включающие эксперименты STD, waterLOGSY, T2 / T1 r-релаксации. Жидкостный пробоотборник 1D 1H может быть заполнен в ЯМР-пробирки автоматическим способом с помощью робота для наполнения проб. Как правило, блок из 96 трубок (3 мм) заполняется примерно за два часа. 96-луночные пластинчатые стойки непосредственно расположены в устройстве смены образцов HT, которое считывает штрих-код блока и назначает ЯМР-трубки для экспериментов, контролируемых программным обеспечением автоматизации (IconNMR). Пять 96-луночных пластинчатых стеллажей могут храниться и программироваться в устройстве смены образцов HT одновременно. Температуру каждой из отдельных стоек можно контролировать и регулировать отдельно. Кроме того, каждый отдельный образец может быть предварительно подготовлен (предварительный нагрев и сушка в пробирке для удаления конденсированной влаги) до желаемой температуры перед измерением.
Пригодность для широкого спектра применений. Одним из широких применений этого автоматизированного скрининга на основе ЯМР является идентификация и разработка новых лигандов, связывающихся с биомакромолекулярной мишенью (ДНК / РНК / белки). Эти лиганды могут включать ортостерические и аллостерические ингибиторы, которые обычно связываются нековалентно. Кроме того, FBDD с помощью ЯМР обычно используется в качестве первого шага для выбора перспективных соединений, требования, которые должны быть выполнены, - это наличие биомолекулярной мишени в достаточных количествах. Эта цель подразделяется на две основные задачи.
Первая задача состоит в том, чтобы разработать и охарактеризовать собственную библиотеку фрагментов по следующим причинам: начальный и периодический контроль качества, характеристика и количественная оценка более 1000 фрагментов; определение растворимости фрагментов в буферах, оптимизированных для каждой мишени, в частности для белковых мишеней; и создание нескольких библиотек для размещения различных каркасов и распространения на другие классы макромолекул. Вторая задача состоит в том, чтобы интегрировать рабочие процессы для разработки лекарств на основе фрагментов (FBDD) с помощью ЯМР с использованием: автоматизированного скрининга под наблюдением 1D-лиганда (1H и 19F); автоматизированные замещающие анализы (конкурентные эксперименты с (природным) лигандом) для дифференциации ортостерического и аллостерического связывания; автоматизированные вторичные скрининги с несколькими фрагментами; автоматизированный скрининг 2D-белков и вторичный скрининг набора производных вокруг начального попадания с использованием библиотеки EU-OPENSCREEN или любой другой библиотеки; и повторное профилирование скрининга библиотеки FDA в соответствии с выбранными целевыми показателями.
Кроме того, метаботипирование различных клеточных линий (связанных с заболеванием) может быть проведено для того, чтобы разгадать регуляторные механизмы, которые связывают контроль клеточного цикла и метаболизм. Кроме того, существует функциональная характеристика элементов регуляции РНК/ДНК/белка in vivo и in vitro для оптимизации конструкции / оптимизации домена (оптимизация стабильности для структурных исследований (скрининг буфера, pH, температуры и соли) и расширение скрининга фрагментов на основе ЯМР на мембранные белки и внутренне неупорядоченные белки, которые, как правило, недоступны для других методов.
Ограничения. Использование библиотек фрагментов 19F и 1H имеет свои плюсы и минусы, некоторые из которых будут упомянуты ниже. Самым большим преимуществом измерений 19F по сравнению с 1H является скорость как фактического времени измерения, так и последующего анализа, поскольку смеси содержат почти вдвое больше фрагментов и необходимо проводить меньше экспериментов. Последующий анализ также проще для скрининга 19F, поскольку нет помех от буферов и, кроме того, предлагается более широкий диапазон химического сдвига практически без перекрытия сигналов для оптимально спроектированной смеси фрагментов. Сами спектры значительно упрощены, обычно имеют только один или два сигнала на фрагмент, в зависимости от количества атомов фтора. Таким образом, анализ этих спектров может быть автоматизирован, что опять же сокращает время. Это происходит за счет химического разнообразия, по крайней мере, для библиотеки, используемой в этом исследовании. Поскольку только ~ 13% библиотеки содержит 19 F, но, естественно, все они могут быть использованы при скрининге 1H, разнообразие фрагментов скрининга 19F будет ниже. Это можно было бы обойти, используя специально разработанные библиотеки 19F с большим количеством фрагментов и большим химическим разнообразием. Еще одним недостатком экранирования 19F является малое количество сигналов на фрагмент. Фрагменты обычно состоят из более чем одного атома водорода. Таким образом, экспериментыпо скринингу 1 H могут полагаться на разные сигналы для одного и того же фрагмента для обнаружения связывания. Это дает более высокую степень достоверности при идентификации попаданий для скрининга 1H, тогда как скрининг 19F должен полагаться на один или два сигнала, подаваемых на фрагмент.
Представлен подробный отчет о современных автоматизированных приборах скрининга фрагментов на основе ЯМР, программном обеспечении и методах и протоколах их анализа. Установленное оборудование включает в себя высокопроизводительного робота-пробоподготовки и высокопроизводительный блок хранения, смены и сбора данных, связанный со спектрометром 600 МГц. Недавно установленная криогенная зондовая головка для 1 H, 19 F, 13C и 15 N обеспечивает требуемую чувствительность для предлагаемых измерений и позволяет развязывать 1H во время обнаружения 19F. Кроме того, последнее поколение консоли ЯМР предлагает возможность использовать передовое аналитическое программное обеспечение для облегчения сбора данных и анализа на лету. Рассмотренная выше технология, рабочие процессы и описанные протоколы должны способствовать значительному успеху пользователей, использующих FBS с помощью ЯМР.

Скрининг на основе фрагментов в настоящее время является широко используемым методом идентификации довольно простых и низкомолекулярных молекул (MW <250 Da), которые демонстрируют слабое связывание с макромолекулярными мишенями, включая белки, ДНК и РНК. Первоначальные попадания с первичных экранов служат основой для проведения вторичного скрининга коммерчески доступных более крупных аналогов попаданий, а затем для использования стратегий роста фрагментов или связывания на основе химии. Для успешной платформы обнаружения лекарств на основе фрагментов (FBDD), как правило, требуется надежный биофизический метод для обнаружения и характеристики слабых попаданий, библиотека фрагментов, биомолекулярная мишень и стратегия последующей химии. Четырьмя широко применяемыми биофизическими методами в рамках кампаний по открытию лекарств являются анализы теплового сдвига, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), кристаллография и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
ЯМР-спектроскопия показала различные роли на разных этапах FBDD. Помимо обеспечения химической чистоты и растворимости фрагментов в библиотеке фрагментов, растворенных в оптимизированной буферной системе, эксперименты с ЯМР, наблюдаемые лигандом, могут обнаруживать связывание фрагмента с мишенью с низким сродством, а эксперименты с ЯМР-мишенью могут очертить эпитоп связывания фрагмента, что позволяет проводить детальные исследования взаимосвязи между структурой и активностью. В рамках эпитопного картирования изменения химического сдвига на основе ЯМР не только идентифицируют ортостерические сайты связывания, но и аллостерические сайты, которые могут быть загадочными и доступными только в так называемых возбужденных конформационных состояниях биомолекулярной мишени. Если биомолекулярная мишень уже связывает эндогенный лиганд, идентифицированные фрагментные попадания можно легко классифицировать как аллостерические или ортостерические, проводя конкурентные эксперименты на основе ЯМР. Определение константы диссоциации (KD) взаимодействия лиганд-мишень является важным аспектом в процессе FBDD. Химическое титрование на основе ЯМР, как лиганда, так и мишени, может быть легко выполнено для определения KD. Основным преимуществом ЯМР является то, что исследования взаимодействия проводятся в растворе и близких к физиологическим условиям. Таким образом, все конформационные состояния для анализа взаимодействия лиганда/фрагмента с мишенью могут быть исследованы. Кроме того, подходы, основанные на ЯМР, не только ограничены скринингом хорошо свернутых растворимых белков, но также применяются для размещения большего целевого пространства, включая ДНК, РНК, связанные с мембраной и внутренне неупорядоченные белки1.
Библиотеки фрагментов являются неотъемлемой частью процесса FBDD. Как правило, фрагменты действуют как начальные предшественники, которые в конечном итоге становятся частью (субструктурой) нового ингибитора, разработанного для биологической мишени. Сообщалось, что несколько препаратов (Венетоклакс2, Вемурафениб3, Эрдафитиниб4, Пексидартниб5) начинались как фрагменты и в настоящее время успешно используются в клиниках. Как правило, фрагменты представляют собой низкомолекулярные (<250 Да) органические молекулы с высокой растворимостью и стабильностью в воде. Тщательно продуманная библиотека фрагментов, содержащая, как правило, несколько сотен фрагментов, уже может обещать эффективное исследование химического пространства. Общий состав библиотек фрагментов развивался со временем и чаще всего получался путем рассечения известных лекарств на более мелкие фрагменты или разрабатывался вычислительно. Эти разнообразные библиотеки фрагментов в основном содержат плоские ароматические или гетероатомы и придерживаются правила Липински 5 6 или текущего коммерческого тренда правила 3 7, но избегают реакционноспособных групп. Некоторые библиотеки фрагментов также были получены или состояли из хорошо растворимых метаболитов, натуральных продуктов и/или их производных8. Общая проблема, возникающая в большинстве библиотек фрагментов, заключается в простоте последующей химии.
Центр биомолекулярного магнитного резонанса (BMRZ) при Университете Гёте во Франкфурте является партнером iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), консорциума структурных исследовательских инфраструктур для всех европейских исследователей из всех областей биохимических и биомедицинских исследований. В рамках предыдущей инициативы iNEXT, которая завершилась в 2019 году, была создана библиотека фрагментов, состоящая из 768 фрагментов, с целью «минимального количества фрагментов и максимального разнообразия», охватывающего большое химическое пространство. Кроме того, в отличие от любой другой библиотеки фрагментов, библиотека фрагментов iNEXT также была разработана на основе концепции «уравновешенных фрагментов» с целью облегчения последующего синтеза сложных лигандов с высоким сродством и отныне известна как внутренняя библиотека (Diamond, Structural Genomic Consortium и iNEXT).
Создание FBDD с помощью ЯМР требует рабочей силы, знаний и инструментов. На БМРЗ были разработаны оптимизированные рабочие процессы для поддержки технической помощи в скрининге фрагментов с помощью ЯМР. К ним относятся контроль качества и оценка растворимости библиотеки фрагментов 9, оптимизация буфера для выбранных мишеней, скрининг на основе 1D-лиганда, наблюдаемый 1H или 19F, конкурентные эксперименты по дифференциации ортостерического и аллостерического связывания, эксперименты по ЯМР-наблюдению за мишенями на основе 2D для картирования эпитопов и для характеристики взаимодействия со вторичным набором производных исходных попаданий фрагментов. BMRZ установил автоматизированные процедуры для анализа, как также обсуждалось ранее в литературе 10,11, низкомолекулярных и белковых взаимодействий и имеет всю необходимую автоматизированную инфраструктуру для скрининга фрагментов на основе ЯМР. В нем реализованы ЯМР с переносом насыщения (STD-ЯМР), водный лиганд, наблюдаемый с помощью градиентной спектроскопии (waterLOGSY), и релаксационные эксперименты на основе Карра-Перселла-Мейбума-Гилла (на основе CPMG) для идентификации фрагментов в широком диапазоне режимов сродства, а также современные автоматизированные приборы и программное обеспечение ЯМР для открытия лекарств. В то время как скрининг фрагментов на основе ЯМР хорошо зарекомендовал себя для белков, этот подход реже используется для поиска новых лигандов, взаимодействующих с РНК и ДНК. BMRZ доказал концепцию новых протоколов, позволяющих идентифицировать взаимодействия малых молекул РНК / ДНК. В следующих разделах этого вклада сообщается, что применение процедур скрининга на образцах белков и РНК позволяет узнать об установленных протоколах для широкой базы пользователей в биомакромолекулярных исследованиях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Avance III HD</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>600 MHz NMR Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes</td>
			<td>3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Barcoded Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix SepraSeal und DuraSeal&#38;</td>
			<td>4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SampleJet</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>HT Sample Changer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SamplePro Tube</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Pipetting Robot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode

Скрининг на основе фрагментов (FBS) является хорошо проверенной и общепринятой концепцией в процессе открытия лекарств как в академических кругах, так и в промышленности. Самым большим преимуществом скрининга фрагментов на основе ЯМР является его способность не только обнаруживать связующие вещества со сродством более 7-8 порядков, но и контролировать чистоту и химическое качество фрагментов и, таким образом, производить высококачественные попадания и минимальное количество ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Предварительным условием в FBS является выполнение начального и периодического контроля качества библиотеки фрагментов, определение растворимости и химической целостности фрагментов в соответствующих буферах и создание нескольких библиотек для покрытия различных каркасов для размещения различных классов мишеней макромолекул (белки/РНК/ДНК). Кроме того, требуется обширная оптимизация протокола скрининга на основе ЯМР в отношении количества образцов, скорости сбора и анализа на уровне биологического конструкта / фрагментного пространства, в пространстве условий (буфер, добавки, ионы, pH и температура) и в лигандном пространстве (аналоги лигандов, концентрация лигандов). По крайней мере, в академических кругах эти усилия по скринингу до сих пор предпринимались вручную в очень ограниченном объеме, что приводило к ограниченной доступности инфраструктуры скрининга не только в процессе разработки лекарств, но и в контексте разработки химических зондов. Для того, чтобы удовлетворить требования экономно, представлены расширенные рабочие процессы. Они используют преимущества новейшего современного оборудования, с помощью которого сбор жидких проб может быть заполнен в ЯМР-пробирки с регулируемой температурой в автоматическом режиме. 1Затем спектры на основе ЯМР-лигандов H/19F собираются при заданной температуре. Высокопроизводительный сменщик образцов (HT sample changer) может обрабатывать более 500 образцов в блоках с регулируемой температурой. Это вместе с передовыми программными инструментами ускоряет сбор и анализ данных. Кроме того, описано применение процедур скрининга на образцах белков и РНК, чтобы ознакомить с установленными протоколами для широкой пользовательской базы в биомакромолекулярных исследованиях.

Контроль качества библиотеки фрагментов Фрагменты из собственной библиотеки поставлялись в виде исходных растворов по 50 мМ в 90% d6-DMSO и 10% D 2 O(10% D2O обеспечивает минимизацию деградации соединения из-за повторяющихся циклов замораживания-оттаивания14). Образцы отдельных соединений состояли из 1 мМ лиганда в 50 мМ фосфатном буфере (25 мМ KPi, рН 6,2 + 50 мМ KCl + 5 мМ MgCl 2), рН 6,0 в 90% H 2 O / 9% D2O / 1% d6-DMSO. 1Эксперименты H-ЯМР фрагментов из библиотеки iNEXT измерялись на ЯМР-спектрометре 500/600 МГц. Эти данные были в дальнейшем использованы для идентификации отдельных соединений в кампаниях скрининга 1H с использованием программного обеспечения CMC-q, которое позволяет пользователю полностью получать спектры в автоматическом режиме, а также для анализа CMC-a оценивалось качество (растворимость и целостность) фрагментов. Результаты автоматизированного анализа с помощью CMC-a показаны в виде графического вывода, аналогичного тому, что показано на рисунке 3. На графическом выходе показано представление 96-луночной пластины. Красный цветной круг означает, что этот фрагмент показывает несоответствие структуры или концентрации. Лунки зеленого цвета указывают на то, что фрагмент является последовательным.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig03.jpg"> Рисунок 3: Контроль качества библиотеки фрагментов. Схематическое изображение автоматизированного вывода на основе CMC-a. Оцениваются свойства фрагментов, такие как концентрация и структурная целостность. Зеленый цвет означает последовательность, оранжевый в данном случае означает непоследовательность. Несогласованные фрагменты редактируются вручную в соответствии с показанным рабочим процессом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Приблизительно 65% и 35% фрагментов были классифицированы как последовательные и несогласованные, соответственно, как в ДМСО, так и в буфере. Кроме того, 30% несогласованных классифицированных лигандов стали последовательными после тщательной ручной проверки спектров9.
19F Конструкция смеси 103 фрагмента, содержащих одну или несколько фторсодержащих групп из собственной библиотеки, были разделены на 5 смесей (A, B, C, D, E). Каждая смесь состоит из 20-21 фрагмента. В этом случае смеси должны были быть тщательно спроектированы, чтобы избежать перекрытия сигналов. 19 См.Эксперименты по поперечной релаксации F были измерены для каждой смеси, в которой применяются последовательности импульсов CPMG. Эти эксперименты могут быть изменены путем изменения задержек релаксации. Химический сдвиг смесей A-E 19F можно увидеть на рисунке 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig04.jpg"> Рисунок 4: 19спектров F 1D-ЯМР образцов смесей из собственной библиотеки. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig04large.jpg" target="_blank">нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Пробоподготовка Пробоподготовка в процедуре скрининга 19F проводилась либо вручную, либо с помощью автоматического пипетирования с использованием робота-пипетки. Фрагменты в каждой смеси имели концентрацию 2,5 мМ в 90% d6-ДМСО и 10%D2O. Конечный объем просеиваемого образца составлял 170 мкл с 5% D2O в качестве запирающего агента. Каждую смесь пипетировали два раза, один в растворе, содержащем буфер (без мишени), и один в мишень, содержащую буферный раствор. Соотношение мишени и фрагмента было установлено на 1:1, в результате чего конечная концентрация мишени/лиганда составила 50 мкМ. Кроме того, контрольными образцами являются биомолекула-мишень в просеивающем буфере без смеси для обеспечения целостности мишени, а также контрольный образец только с буфером иD2O для обеспечения качества буфера.
Данные ЯМР-скрининга 19 F-1D и 19F-CPMG-T2 были измерены, как описано в разделе 3.1. Например, в случае РНК эхо-последовательность прыжка и возврата (pp = zggpjrse,15) была получена для единственного целевого образца в буфере.
Анализ данных Процедура скрининга 19F была применена к рибопереключателю ТЭС thiM из E. coli и протеинтирозинкиназе (PtkA) из M. tuberculosis, а также к нескольким другим мишеням16. Библиотека скрининга 19F содержит 103 фрагмента, которые разделены на 5 смесей, помеченных от смеси A до E. Подготовка просеивающих образцов может быть выполнена вручную без использования робота-пипетки. Раствор, содержащий 40 мкМ тиМ РНК (буферные условия), смешивали с 3,2 мкл из смесей. Далее были подготовлены контрольные образцы, состоящие только из буфера, буфера с 5% ДМСО (предварительно обеспечивающего стабильность биомакромолекулы в присутствии желаемой концентрации ДМСО) и буфера с РНК. Эти 13 скрининговых образцов были подготовлены и перенесены в ЯМР-пробирки диаметром 3 мм. Штрих-коды ЯМР-пробирок сканируются, и каждая смесь в наличии и отсутствии РНК, а также контрольные образцы были измерены в соответствии с вышеупомянутыми экспериментами ЯМР 19F, выполненными при 298 К. Скрининг thiM РНК по внутренней библиотеке проводили путем проведения измерений T2 с CPMG 0 мс и 200 мс для каждого отдельного образца. Надлежащий шимминг и подавление воды контролировались после завершения измерений путем сравнения всех пиков ДМСО с точки зрения уширения линии и потери интенсивности дополнительно измеренных экспериментов 1 H 1Dдля всех образцов. Обработка полученных релаксационных спектров CPMG T2 19F проводилась с использованием заранее подготовленного и автоматизированного макроса в TopSpin соответственно. Анализ данных проводился в соответствии с инструкциями в разделе протокола. Интегральные данные, полученные от TopSpin (следуя инструкциям в протоколе), можно быстро и легко оценить с помощью готовой электронной таблицы или любой аналогичной программы, установив правильные условия и пороговые значения. Как описано ранее, пороговые значения полезны при определении связующего, слабого связующего или несвязующего. На рисунке 5 показаны типичные результаты спектров CPMG РНК thiM и PtkA соответственно. В некоторых случаях потребовалась дальнейшая экспертная доработка.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig05.jpg"> Рисунок 5: Вырезано из спектров ЯМР19 F CPMG, показывающих изменения интенсивности, полученные при различных временах задержки экспериментов на основе CPMG . (A) Представление связующего (хита) и несвязывающего вещества в скрининге на основе фрагментов 19F, проведенном на рибопереключателе ТТП РНК из E. coli. (B) Представление связующего и несвязующего вещества при скрининге на основе фрагментов 19F, проведенном на PtkA от M. tuberculosis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
1час скрининга
Конструкция смеси Используемая собственная библиотека настолько разнообразна, что для целей просеивания в течение 1часа не было выполнено проектирование смеси. Это означает, что 64 смеси были приготовлены путем случайного выбора 12 для смешивания в одной смеси.
Подготовка образцов Для скрининга образцовойРНК SARS-CoV-2 в течение 1 часа для подготовки образцов было выполнено автоматизированное пипетирование с использованием робота-пипетки. Фрагменты в каждой смеси имели концентрацию 4,2 мМ в 90% d6-ДМСО и 10% D2O. Конечный объем просеиваемого образца составлял 200 мкл с 5% D2O в качестве запирающего агента. 64 образца, каждый из которых содержал различную смесь в 25 мМ KPi, 50 мМ KCl при рН 6,2, были пипетированы без целевой РНК. Соответственно, 64 образца были пипетированы с целевой РНК, каждый из которых содержал свою смесь. Соотношение РНК:лиганд было установлено на 1:20, в результате чего концентрация РНК составила 10 мкМ, а концентрация лиганда - 200 мкМ.
Анализ данных Для анализа 1H использовался инструмент FBS в TopSpin. Чтобы определить, является ли фрагмент ударом, были проведены эксперименты по релаксации 1D, waterLOGSY, T2 . Для релаксацииТ2 снижение интенсивности более чем на 30% считалось попаданием, в то время как для химического сдвига сдвиг более 6 Гц был отсечкой. waterLOGSY должен был показать значительное изменение сигнала (в данном случае от отрицательного к положительному). Если любые два из этих трех критериев были положительными, фрагмент засчитывался как попадание. Два примера этого можно увидеть на рисунке 6.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig06.jpg"> Рисунок 6: Скрининг за 1час, проведенный на образцовой РНК SARS-CoV-2 с критериями определения попадания. Получение трех различных экспериментов (1 H T2 CPMG (5/100 мс), waterLOGSY, и 1D 1H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Hit-1 показывает снижение T2 на ~ 50% и CSP ≥ 6 Гц. waterLOGSY не показывает достаточно значительного изменения сигнала, чтобы его можно было считать положительным. Поскольку два из трех экспериментов положительные, этот фрагмент засчитывается как попадание. Для Hit-2 T2 показывает снижение интенсивности сигнала на ~ 80%, и для waterLOGSY, можно увидеть явное изменение сигнала. CSP в этом случае недостаточно, но, поскольку два предыдущих критерия являются положительными, он все равно считается хитом.

Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Скрининг на основе фрагментов с помощью ЯМР является надежным методом быстрой идентификации низкомолекулярных связывающих веществ с биомакромолекулами (ДНК, РНК или белками). Представлены протоколы, описывающие автоматическую пробоподготовку, эксперименты ЯМР и условия сбора данных, а также рабочие процессы анализа. Этот метод позволяет оптимально использовать как 1H, так и 19F ЯМР-активных ядер для обнаружения.

Скрининг фрагментов на основе ЯМР в режиме минимальной выборки, но максимальной автоматизации

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Мы проводим исследования ядерного магнитного резонанса. Это позволяет определить структуры белков, РНК и ДНК в растворе. Эти биомолекулы являются составляющими, являются компонентами наших клеток, и наши протоколы, которые мы представляем здесь, связаны с скринингом малых молекул и их связыванием с этими мишенями.Из этих молекул наша медицинская химия и структурная биология могут получить новые лекарства, которые борются с болезнями. Основное преимущество нашей методики заключается в том, что мы имеем полный контроль над качеством молекулярных мишеней, таких как белки, и мы имеем полный контроль над качеством фрагментов малых молекул и лекарств, а также мы можем проводить скрининг белков на связывание широкого спектра сродств, что является преимуществом по сравнению с другими методологиями. Чтобы подготовить образцы экрана для измерения ЯМР, используйте робота-пробоподготовки для распределения 768 соединений по восьми 96-луночным планшетам, чтобы получить 64 смеси, содержащие 12 фрагментов, до конечной концентрации 4,2 миллимоляра на смесь.Перенесите интересующую биомолекулярную мишень, разбавленную в соответствующем просеивающем буфере, в соответствующее количество трехмиллиметровых высокопроизводительных пробирок для смены образцов ЯМР со штрих-кодом и используйте робота для переноса 10 микролитров каждой смеси лигандов в каждую пробирку с целевой биомолекулой. Затем попросите робота тщательно перемешать растворы. Для сбора данных ЯМР загрузите образец в спектрометр.Откройте программное обеспечение спектрометра, затем выберите набор параметров и последовательности импульсов для экспериментов на основе лигандов. Для всех перечисленных экспериментов в качестве подавления воды выберите коррекцию возбуждения. Для скрининга фтора-19 выберите эксперименты 1D и T2.Выберите спектральную ширину до 220 частей на миллион, частоту возбуждения до 140 частей на миллион и время анализа от одного до пяти часов. Для T2 время CPMG должно чередоваться от 5 до 100 миллисекунд. Запишите эксперименты T1r и T2.Запишите разницу переноса насыщения в виде псевдо-2D. Для обработки двух одиночных 1D-спектров используйте функцию ProcStd программы AU с опцией релаксации или без нее. WaterLOGSY представляет собой одиночный 1D, который должен быть фазирован отрицательным для сигнала растворителя.Чтобы проанализировать данные скрининга водорода, следуйте инструкциям к инструменту скрининга на основе фрагментов, чтобы сохранить данные биомолекулярного магнитно-резонансного ЯМР из скрининговых кампаний, так что каждая просеивающая смесь имеет свой каталог, в котором подкаталог содержит различные эксперименты, измеренные на образце. Храните эталонные спектры, сохраняя все данные из образцов без биомолекулярной мишени, но со смесями и единичным соединением в разных каталогах. Создайте прямой путь к каталогу, содержащему полученные данные, и выберите каталог ЯМР, в котором все смеси должны иметь отдельный каталог.Убедитесь, что CSV-файл, фрагмент экрана, XML-документ и файлы BAC также скопированы в каталог NMR данных. Чтобы использовать инструмент скрининга на основе фрагментов для распространённого образца, перетащите символ проекта растрирования на основе фрагментов в середину окна анализа. Символ должен появиться, если в него были скопированы ранее сохраненные наборы данных.Должно автоматически открыться окно параметров экранирования на основе фрагментов. Выберите CSV-файл коктейля, содержащий названия смесей, названия каждого фрагмента и разделение каждого фрагмента на миксы. Определите папку спектров эталонных лигандов со всеми измеренными спектрами отдельных фрагментов и определите папку эталонных пустых экспериментов, которая обычно содержит наборы данных смесей без исследуемой мишени.Чтобы определить исследуемые спектры и цвета отображения спектров, откройте вкладку «Типы спектров» и установите тип спецификации в соответствии с данными процесса. На вкладке «Макет дисплея» определите спектры, которые будут сравниваться в соответствии с типами спецификаций. Затем нажмите кнопку ОК, чтобы запустить проект.Пока данные обрабатываются, откроется отдельное окно с таблицей, в которой будут обобщены все коктейльные смеси и лиганды каждой смеси. Дважды щелкните ячейку, чтобы открыть соответствующие наборы данных. Перед назначением связующих убедитесь, что контрольные пики совпадают друг с другом и имеют одинаковый химический сдвиг.Если наблюдаются различия, откройте вкладку «Процесс» и используйте параметр последовательной обработки, чтобы исправить их. Для первого анализа смесей фтора-19 откройте вкладку «Анализ» и выберите функцию интеграции. Убедитесь, что для каждого фрагмента в смеси определена четкая область интеграции для соответствующего сигнала фтора-19.Сохраните экспортируемые регионы интеграции, чтобы экспортировать файл интеграции для дальнейшего использования, и сохраните все использованные файлы интеграции в соответствующем каталоге установки. Для данных по фтору-19 откройте набор данных с исследуемым целевым объектом или без него, а затем на вкладке "Анализ" щелкните "Интегрировать и прочитать регионы интеграции импорта", чтобы загрузить соответствующий файл интеграции в текущий спектр. Затем нажмите кнопку «Сохранить и вернуться», чтобы найти список интегрированных областей на вкладке «Интегралы», и скопируйте эту информацию в электронную таблицу для последующего анализа.Молекулярная структура или строение лигандов в библиотеке фрагментов анализируется с использованием программного обеспечения молекулярной достоверности, как показано, и результаты представляются в виде графического вывода. Оранжевый цвет указывает на то, что фрагмент демонстрирует несоответствие по структуре или концентрации. Лунки зеленого цвета указывают на то, что фрагмент является последовательным.В этом репрезентативном анализе 103 фрагмента, содержащих одну или несколько фторсодержащих групп из собственной библиотеки, были разделены на пять смесей по 20-21 фрагменту в смеси. Эксперименты по поперечной релаксации фтора-19 были измерены для каждой смеси, в которой применялись последовательности импульсов CPMG. Пороговые значения полезны для определения связующего, слабого связывающего или несвязывающего вещества в смеси, как это наблюдается в этих типичных спектрах тиаминпротеиновой тирозинкиназы А и РНК.В этом репрезентативном анализе первый удар показал снижение T2 примерно на 50% и химический сдвиг, превышающий или равный шести герцам. WaterLOGSY не показал значительных изменений в сигнале, который можно было бы считать положительным. Однако, поскольку два из трех экспериментов были положительными, этот фрагмент был засчитан как попадание.Для второго удара T2 показал снижение интенсивности сигнала примерно на 80%. Явное изменение сигнала также наблюдалось для WaterLOGSY. Химического сдвига было недостаточно в этом эксперименте, но, поскольку два предыдущих критерия были положительными, он все равно считался хитом.Конечная цель таких методов состоит в том, чтобы разработать новые лекарства или высокоаффинные ингибиторы, например, ферментов, и в этом случае медицинская химия берет на себя и синтезирует эти новые молекулы, но структурная биология, методы, которые вы применяете здесь, могут направлять медицинскую химию и сделать этот подход намного быстрее.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Автоматизированная Акустическая дозирования для серийного разведения пептидные агонисты в Potency Определение Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

В режиме реального времени отслеживание разделения фрагментов ДНК с помощью смартфона

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Универсальный выборочный держатель для макромолекулярной рентгеновской кристаллографии с минимальным рассеянием фона

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Кинетический скрининг nuclease деятельности с использованием нуклеиновой кислоты зондов

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Скрининг для Термотога маритима Мембрана-Связанные пирофосфаза ингибиторы

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Пример ы подготовки к протеомики объекта представления и последующего анализа данных

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Рабочий процесс и инструменты для скрининга кристаллографических фрагментов в Берлинском центре Гельмгольца

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...