Name: nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode
Uploaded: 2021-06-04T15:00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

Detta arbete har fått stöd av iNEXT-Discovery, projekt nummer 871037, finansierat av Europeiska kommissionens Horizon 2020-program.

<ol>
	<li>Yanamala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-Based+Screening+of+Membrane+Protein+Ligands.">NMR-Based Screening of Membrane Protein Ligands.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 75, 237-256 (2010).</li><li>Souers, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABT-199,+a+potent+and+selective+BCL-2+inhibitor,+achieves+antitumor+activity+while+sparing+platelets.">ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets.</a> Nature Medicine. 19, 202-208 (2013).</li><li>Su, M. C., Te Chang, C., Chu, C. H., Tsai, C. H., Chang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atypical+RNA+pseudoknot+stimulator+and+an+upstream+attenuation+signal+for+-1+ribosomal+frameshifting+of+SARS+coronavirus.">An atypical RNA pseudoknot stimulator and an upstream attenuation signal for -1 ribosomal frameshifting of SARS coronavirus.</a> Nucleic Acids Research. 33, 4265-4275 (2005).</li><li>Perera, T. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+&amp;+pharmacological+characterization+of+JNJ-42756493+(Erdafitinib),+a+functionally+selective+small-molecule+FGFR+family+inhibitor.">Discovery &amp; pharmacological characterization of JNJ-42756493 (Erdafitinib), a functionally selective small-molecule FGFR family inhibitor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16, 1010-1020 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+pharmacology+of+a+highly+specific+dual+FMS+and+KIT+kinase+inhibitor.">Design and pharmacology of a highly specific dual FMS and KIT kinase inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5689-5694 (2013).</li><li>Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., Feeney, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+computational+approaches+to+estimate+solubility+and+permeability+in+drug+discovery+and+development+settings.">Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 23, 3-25 (1997).</li><li>Congreve, M., Carr, R., Murray, C., Jhoti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+'Rule+of+Three'+for+fragment-based+lead+discovery.">A 'Rule of Three' for fragment-based lead discovery.</a> Drug Discovery Today. 8, 876-877 (2003).</li><li>Ch&#225;vez-Hern&#225;ndez, A. L., S&#225;nchez-Cruz, N., Medina-Franco, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+Library+of+Natural+Products+and+its+Comparative+Chemoinformatic+Characterization.">A Fragment Library of Natural Products and its Comparative Chemoinformatic Characterization.</a> Molecular Informatics. 39, 2000050 (2020).</li><li>Sreeramulu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+quality+control+of+fragment+libraries+for+screening.">NMR quality control of fragment libraries for screening.</a> Journal of Biomolecular NMR. , 00327-00329 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+NMR+Fragment+Based+Screening+Identified+a+Novel+Interface+Blocker+to+the+LARG/RhoA+Complex.">Automated NMR Fragment Based Screening Identified a Novel Interface Blocker to the LARG/RhoA Complex.</a> PLoS One. 9, 88098 (2014).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Efficient+Fragment-Based+Lead+Generation+by+Fully+Automated+Processing+and+Analysis+of+Ligand-Observed+NMR+Binding+Data.">Fast and Efficient Fragment-Based Lead Generation by Fully Automated Processing and Analysis of Ligand-Observed NMR Binding Data.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 3303-3310 (2016).</li><li>Cox, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP(2),+an+atypical+bromodomain.">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).</li><li>Hwang, T. L., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Suppression+That+Works.+Excitation+Sculpting+Using+Arbitrary+Wave-Forms+and+Pulsed-Field+Gradients.">Water Suppression That Works. Excitation Sculpting Using Arbitrary Wave-Forms and Pulsed-Field Gradients.</a> Journal of Magnetic Resonance, Series A. 112, 275-279 (1995).</li><li>Gossert, A. D., Jahnke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+in+drug+discovery:+A+practical+guide+to+identification+and+validation+of+ligands+interacting+with+biological+macromolecules.">NMR in drug discovery: A practical guide to identification and validation of ligands interacting with biological macromolecules.</a> Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 97, 82-125 (2016).</li><li>Sklenar, V., Bax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+water+suppression+technique+for+generating+pure-phase+spectra+with+equal+excitation+over+a+wide+bandwidth.">A new water suppression technique for generating pure-phase spectra with equal excitation over a wide bandwidth.</a> Journal of Magnetic Resonance. 75, 378-383 (1987).</li><li>Binas, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=19F+NMR-Based+Fragment+Screening+for+14+Different+Biologically+Active+RNAs+and+10+DNA+and+Protein+Counter-Screens.">19F NMR-Based Fragment Screening for 14 Different Biologically Active RNAs and 10 DNA and Protein Counter-Screens.</a> ChemBioChem. , (2020).</li></ol>

Mångsidighet av NMR-baserad fragment / läkemedelsscreening. BMRZ har framgångsrikt implementerat toppmodern automatiserad NMR-instrumentering samt STD-NMR, waterLOGSY och avslappningsexperiment för att identifiera fragment inom ett brett spektrum av affinitetsregimer för läkemedelsupptäckt. Den installerade hårdvaran inkluderar en provberedningsrobot med hög genomströmning och provlagrings-, växlar- och datainsamlingsenhet med hög genomströmning associerad med en 600 MHz-spektrometer. En nyligen inköpt kryogen sond för 1 H, 19 F, 13 C och 15N säkerställer den nödvändiga känsligheten för de föreslagna mätningarna och möjliggör 1 H (1) frikoppling under 19F-detektering. Denna prob är kopplad till den senaste generationen NMR-konsol som erbjuder möjligheten att använda de avancerade mjukvaruverktygen från Bruker, inklusive CMC-q, CMC-assist, CMC-se och FBS (ingår i TopSpin). Det fragmentbaserade screeningverktyget (FBS) ingår i den senaste versionen av TopSpin och hjälper till att analysera data med hög genomströmning bestående av STD, waterLOGSY, T2/T1 r-relaxeringsexperiment. Den flytande 1D 1H-provinsamlingen kan fyllas i NMR-rören på ett automatiserat sätt med hjälp av provfyllningsroboten. Vanligtvis fylls ett block med 96 rör (3 mm) på cirka två timmar. Plattrackarna med 96 brunnar är direkt placerade i HT-provväxlaren, som läser av blockets streckkod och tilldelar NMR-rören till experimenten som styrs av automatiseringsprogramvaran (IconNMR). Fem 96-brunnsställ kan lagras och programmeras i HT-provväxlaren samtidigt. Temperaturen på var och en av de enskilda racken kan styras och regleras separat. Dessutom kan varje enskilt prov förkonditioneras (förvärmning och rörtorkning för avlägsnande av kondenserad fuktighet) till önskad temperatur före mätningen.
Lämplighet för ett brett spektrum av applikationer. En av de breda tillämpningarna av denna automatiserade NMR-baserade screening är att identifiera och utveckla nya ligander som binder till ett biomakromolekylärt mål (DNA / RNA / proteiner). Dessa ligander kan inkludera ortosteriska och allosteriska hämmare som vanligtvis binder icke-kovalent. Vidare används FBDD av NMR vanligtvis som ett första steg för att välja lovande föreningar, kraven som ska uppfyllas är tillgängligheten av det biomolekylära målet i tillräckliga mängder. Detta mål är uppdelat i två huvuduppgifter.
Uppgift ett är att utveckla och karakterisera ett internt fragmentbibliotek av följande skäl: initial och periodisk kvalitetskontroll, karakterisering och kvantifiering av mer än 1000 fragment; Bestämning av lösligheten hos fragmenten i buffertar optimerade för varje mål, särskilt för proteinmål. och inrättandet av flera bibliotek för att rymma olika byggnadsställningar och sträcka sig mot andra makromolekylklasser. Uppgift två är att integrera arbetsflöden för fragmentbaserad läkemedelsdesign (FBDD) genom NMR med: automatiserad 1D-ligandobserverad screening (1H och 19F observerade); automatiserade ersättningsanalyser (tävlingsexperiment med (naturlig) ligand) för att differentiera ortosterisk och allosterisk bindning; automatiserade sekundära screeningar med flera fragment; Automatiserad 2D-proteinscreening och sekundär screening av en uppsättning derivat kring en första träff med hjälp av EU-OPENSCREEN-biblioteket eller något annat bibliotek. och omprofilering av screening av FDA-biblioteket mot de valda målen.
Dessutom kan metabotypning av olika cellinjer (sjukdomsrelevant) utföras för att avslöja de reglerande mekanismerna som länkar cellcykelkontroll och metabolism. Det finns också funktionell karakterisering av RNA / DNA / proteinregleringselement in vivo och in vitro för optimering av konstruktion / domänoptimering (stabilitetsoptimering för strukturella undersökningar (buffert-, pH-, temperatur- och saltscreening) och en utvidgning av NMR-baserad fragmentscreening till membranproteiner och inneboende oordnade proteiner, som i allmänhet är otillgängliga för andra tekniker.
Begränsningar. Användning av 19F- och 1H-fragmentbibliotek har sina fördelar och nackdelar, varav få kommer att nämnas i det följande. Den största fördelen med 19F kontra 1H-mätningar är hastigheten på både den faktiska mättiden och den efterföljande analysen, eftersom blandningarna innehåller nästan dubbelt så många fragment och färre experiment måste utföras. Uppföljningsanalysen är också enklare för 19F-screening, eftersom det inte finns någon störning från buffertar och dessutom erbjuder ett bredare kemiskt skiftområde med nästan ingen signalöverlappning för en optimalt utformad fragmentblandning. Spektra själva är mycket förenklade, vanligtvis har de bara en eller två signaler per fragment, beroende på antalet fluoratomer. Analysen av dessa spektra kan därför automatiseras, vilket återigen minskar tiden. Detta sker på bekostnad av kemisk mångfald, åtminstone för biblioteket som används i denna studie. Eftersom endast ~ 13% av biblioteket innehåller 19F, men naturligtvis alla är användbara vid 1H-screening, kommer mångfalden av 19F-screeningfragmenten att vara lägre. Detta kan kringgås med hjälp av specialdesignade 19F-bibliotek med fler fragment och större kemisk mångfald. En annan nackdel för 19F-screening är det låga antalet signaler per fragment. Fragment består i allmänhet av mer än en väteatom. Därför kan 1H observerade screeningexperiment förlita sig på olika signaler för samma fragment för detektering av bindning. Detta ger en högre grad av förtroende vid identifiering av träffar för 1H-screening, medan 19F-screening måste förlita sig på en eller två signaler som ges per fragment.
En detaljerad redogörelse för den moderna automatiserade NMR-baserade fragmentscreeninginstrumentationen, programvara och analysmetoder och protokoll därav har presenterats. Den installerade hårdvaran inkluderar en provberedningsrobot med hög genomströmning och en provlagrings-, växlar- och datainsamlingsenhet med hög genomströmning associerad med en 600 MHz-spektrometer. Ett nyligen installerat kryogent sondhuvud för 1 H, 19 F, 13 C och 15N säkerställer den känslighet som krävs för de föreslagna mätningarna och möjliggör 1H frikoppling under 19F-detektering. Dessutom erbjuder den senaste generationen av NMR-konsolen möjligheten att använda avancerad analytisk programvara för att underlätta förvärv och on-the-fly-analys. Den ovan diskuterade tekniken, arbetsflödena och de beskrivna protokollen bör främja anmärkningsvärd framgång för användare som bedriver FBS av NMR.

Fragmentbaserad screening är nu en vanlig metod för att identifiera ganska enkla och lågmolekylära molekyler (MW <250 Da) som visar svag bindning till makromolekylära mål inklusive proteiner, DNA och RNA. Initiala träffar från primära skärmar tjänar som grund för att genomföra en sekundär skärm av kommersiellt tillgängliga större analoger av träffarna och sedan använda kemibaserade fragmenttillväxt eller länkningsstrategier. För en framgångsrik fragmentbaserad drug discovery (FBDD) plattform krävs i allmänhet en robust biofysisk metod för att upptäcka och karakterisera svaga träffar, ett fragmentbibliotek, ett biomolekylärt mål och en strategi för uppföljningskemi. Fyra vanligt förekommande biofysiska metoder inom läkemedelsupptäcktskampanjerna är termiska skiftanalyser, ytplasmonresonans (SPR), kristallografi och kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR).
NMR-spektroskopi har visat varierande roller inom FBDS olika stadier. Förutom att säkerställa den kemiska renheten och lösligheten hos fragmenten i ett fragmentbibliotek upplöst i ett optimerat buffertsystem, kan ligandobserverade NMR-experiment detektera fragmentbindning till ett mål med låg affinitet och de målobserverade NMR-experimenten kan avgränsa fragmentets bindningsepitop, vilket möjliggör detaljerade struktur-aktivitetsrelationsstudier. Inom epitopkartläggning kan NMR-baserade kemiska skiftförändringar inte bara identifiera de ortosteriska bindningsställena utan även allosteriska platser som kan vara kryptiska och endast tillgängliga i så kallade exciterade konformationstillstånd hos det biomolekylära målet. Om det biomolekylära målet redan binder en endogen ligand kan de identifierade fragmentträffarna enkelt klassificeras som allosteriska eller ortosteriska genom att utföra NMR-baserade tävlingsexperiment. Att bestämma dissociationskonstanten (KD) för ligand-målinteraktionen är en viktig aspekt i FBDD-processen. NMR-baserade kemiska skifttitreringar, antingen ligand eller mål observerade kan lätt utföras för att bestämma KD. En stor fördel med NMR är att interaktionsstudierna utförs i lösning och nära fysiologiska förhållanden. Således kan alla konformationstillstånd för analys av ligand/fragmentinteraktion med dess mål undersökas. Vidare är NMR-baserade tillvägagångssätt inte bara begränsade till screening av välveckade lösliga proteiner, utan tillämpas också för att rymma större målutrymme inklusive DNA, RNA, membranbundna och inneboende oordnade proteiner1.
Fragmentbibliotek är en oumbärlig del av FBDD-processen. I allmänhet fungerar fragment som de initiala prekursorerna som så småningom blir en del (understruktur) av den nya hämmaren som utvecklats för ett biologiskt mål. Flera läkemedel (Venetoklax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) har rapporterats ha börjat som fragment och används nu framgångsrikt i klinikerna. Vanligtvis är fragment organiska molekyler med låg molekylvikt (<250 Da) med hög vattenlöslighet och stabilitet. Ett noggrant utformat fragmentbibliotek som vanligtvis innehåller några hundra fragment kan redan lova effektiv utforskning av kemiskt utrymme. Den allmänna sammansättningen av fragmentbibliotek har utvecklats över tid och oftast härletts genom att dissekera kända läkemedel i mindre fragment eller designats beräkningsmässigt. Dessa olika fragmentbibliotek innehåller huvudsakligen platta aromatiska eller heteroatomer och följer Lipinski-regeln 5 6, eller den nuvarande kommersiella trendregeln 3 7, men undviker reaktiva grupper. Vissa fragmentbibliotek härleddes också eller bestod av mycket lösliga metaboliter, naturliga produkter och/eller deras derivat8. En allmän utmaning som de flesta fragmentbiblioteken utgör är enkel nedströmskemi.
Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ) vid Goethe-Universität Frankfurt är partner till iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), ett konsortium för strukturella forskningsinfrastrukturer för alla europeiska forskare från alla områden av biokemisk och biomedicinsk forskning. Inom det tidigare initiativet iNEXT som avslutades 2019 skapades ett fragmentbibliotek bestående av 768 fragment i syfte att "minimala fragment och maximal mångfald" som täcker ett stort kemiskt utrymme. Vidare, till skillnad från alla andra fragmentbibliotek, utformades iNEXT-fragmentbiblioteket också baserat på begreppet "poised fragments" i syfte att underlätta nedströms syntes av komplexa, högaffinitetsligander och hädanefter känt som internt bibliotek (Diamond, Structural Genomic Consortium och iNEXT).
Att etablera FBDD av NMR kräver arbetskraft, kunskap och instrumentering. Vid BMRZ har optimerade arbetsflöden för att stödja tekniskt stöd till fragmentscreening med NMR utvecklats. Dessa inkluderar kvalitetskontroll och löslighetsbedömning av fragmentbiblioteket 9, buffertoptimering för de valda målen, 1H eller 19F-observerad 1D-ligandbaserad screening, tävlingsexperiment för att skilja mellan ortosterisk och allosterisk bindning, 2D-baserade målobserverade NMR-experiment för epitopkartläggning och för att karakterisera interaktionen med sekundär uppsättning derivat av de initiala fragmentträffarna. BMRZ har etablerat automatiserade rutiner för analys, som också tidigare diskuterats i litteratur 10,11, av småmolekyl-proteininteraktioner och har på plats all nödvändig automatiserad infrastruktur för NMR-baserad fragmentscreening. Det har implementerat mättnadsöverföringsskillnad NMR (STD-NMR), vattenligand observerad via gradientspektroskopi (waterLOGSY) och Carr-Purcell-Meiboom-Gill-baserade (CPMG-baserade) avslappningsexperiment för att identifiera fragment inom ett brett spektrum av affinitetsregimer samt toppmodern automatiserad NMR-instrumentering och programvara för läkemedelsupptäckt. Medan NMR-baserad fragmentscreening är väl etablerad för proteiner, används detta tillvägagångssätt mindre vanligt för att hitta nya ligander som interagerar med RNA och DNA. BMRZ har etablerat proof of concept för nya protokoll som möjliggör identifiering av små molekyl-RNA/DNA-interaktioner. I följande avsnitt av detta bidrag rapporteras tillämpning av screeningrutiner på protein- och RNA-prover för att göra medvetna om de etablerade protokollen för en bred användarbas inom biomakromolekylär forskning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Avance III HD</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>600 MHz NMR Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes</td>
			<td>3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Barcoded Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix SepraSeal und DuraSeal&#38;</td>
			<td>4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SampleJet</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>HT Sample Changer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SamplePro Tube</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Pipetting Robot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode

Fragmentbaserad screening (FBS) är ett väl validerat och accepterat koncept inom läkemedelsupptäcktsprocessen både inom akademin och industrin. Den största fördelen med NMR-baserad fragmentscreening är dess förmåga att inte bara detektera bindemedel över 7-8 storleksordningar av affinitet utan också att övervaka renhet och kemisk kvalitet hos fragmenten och därmed producera högkvalitativa träffar och minimala falska positiva eller falska negativ. En förutsättning inom FBS är att utföra initial och periodisk kvalitetskontroll av fragmentbiblioteket, bestämma löslighet och kemisk integritet hos fragmenten i relevanta buffertar och upprätta flera bibliotek för att täcka olika byggnadsställningar för att rymma olika makromolekylmålklasser (proteiner / RNA / DNA). Vidare krävs en omfattande NMR-baserad screeningprotokolloptimering med avseende på provkvantiteter, förvärvshastighet och analys på nivå med biologisk konstruktion / fragmentrum, i tillståndsrum (buffert, tillsatser, joner, pH och temperatur) och i ligandrum (ligandanaloger, ligandkoncentration). Åtminstone inom akademin har dessa screeninginsatser hittills genomförts manuellt på ett mycket begränsat sätt, vilket leder till begränsad tillgång till screeninginfrastruktur, inte bara i läkemedelsutvecklingsprocessen utan också i samband med utveckling av kemisk sond. För att möta kraven ekonomiskt presenteras avancerade arbetsflöden. De drar nytta av den senaste toppmoderna avancerade hårdvaran, med vilken vätskeprovuppsamlingen kan fyllas på ett temperaturkontrollerat sätt i NMR-rören på ett automatiserat sätt. 1H/19F NMR-ligandbaserade spektra samlas sedan in vid en given temperatur. Provväxlare med hög genomströmning (HT-provväxlare) kan hantera mer än 500 prover i temperaturkontrollerade block. Detta tillsammans med avancerade mjukvaruverktyg påskyndar datainsamling och analys. Vidare beskrivs tillämpning av screeningrutiner på protein- och RNA-prover för att göra medvetna om de etablerade protokollen för en bred användarbas inom biomakromolekylär forskning.

Kvalitetskontroll av fragmentbibliotek Fragmenten från det egna biblioteket levererades som 50 mM stamlösningar i 90% d6-DMSO och 10% D 2 O (10% av D2O säkerställer minimering av föreningsnedbrytning på grund av upprepade frys-tina cykler14). Enstaka samlingsprover bestod av 1 mM ligand i 50 mM fosfatbuffert (25 mM KPi pH 6,2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl 2), pH 6,0 i 90% H 2 O/9% D2O/1% d6-DMSO. 1H-NMR-experiment av fragment från iNEXT-biblioteket mättes på en 500/600 MHz NMR-spektrometer. Dessa data användes vidare för att identifiera de enskilda föreningarna i 1H-screeningkampanjer med hjälp av CMC-q-programvaran som gör det möjligt för användaren att helt förvärva spektra på ett automatiserat sätt och analystillägget CMC-a kvaliteten (löslighet och integritet) av fragment utvärderades. Resultaten från den automatiserade analysen från CMC-a visas som en grafisk utgång som liknar den som representeras i figur 3. Den grafiska utgången visar en representation av en 96-brunnsplatta. En rödfärgad cirkel betyder att detta fragment visar inkonsekvens i struktur eller koncentration. Grönfärgade brunnar indikerar att fragmentet är konsekvent.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig03.jpg"> Bild 3: Kvalitetskontroll av fragmentbiblioteket. Schematisk representation av CMC-a-baserad automatiserad utgång. Fragmentegenskaper såsom koncentration och strukturell integritet bedöms. Grönt står för konsekvent, orange i detta fall står för inkonsekvent. Inkonsekventa fragment revideras manuellt enligt det visade arbetsflödet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Ungefär 65% och 35% av fragmenten klassificerades som konsekventa respektive inkonsekventa i både DMSO och buffert. Vidare blev 30% av de inkonsekventa klassificerade liganderna konsekventa efter en noggrann manuell inspektion av spektra9.
19F Blandningens utformning 103 fragment innehållande en eller flera fluorgrupper från det egna biblioteket delades in i 5 blandningar (A, B, C, D, E). Varje blandning har 20 till 21 fragment. I detta fall måste blandningarna utformas noggrant för att undvika signalöverlappning. 19F tvärgående avslappningsexperiment mättes för varje blandning som applicerar CPMG-pulståg. Dessa experiment kan modifieras genom att variera avslappningsfördröjningarna. Den kemiska förskjutningen 19F av blandningar A-E kan ses i figur 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig04.jpg"> Figur 4: 19F 1D-NMR-spektra för blandningsprover från det egna biblioteket. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Provberedning Provberedningen i 19F-screeningproceduren gjordes antingen manuellt eller med automatiserad pipettering med hjälp av en pipetteringsrobot. Fragmenten i varje blandning hade en koncentration av 2,5 mM i 90% d6-DMSO och 10%D2O. Den slutliga volymen av ett screeningprov var 170 μL med 5% D2Osom låsmedel. Varje blandning pipetterades två gånger, en i en buffertlösning (utan mål) och en till en målinnehållande buffertlösning. Förhållandet mellan mål och fragment sattes till 1:1, vilket resulterade i en slutlig mål-/ligandkoncentration på 50 μM. Dessutom är kontrollprover målbiomolekylen i screeningbuffert utan blandning för att säkerställa målintegritet samt ett kontrollprov med endast buffert ochD2Oför att säkerställa buffertkvalitet.
NMR-screeningdata för 19 F-1D och 19F-CPMG-T2 var mätningar som beskrivs i avsnitt 3.1. Till exempel, i fallet med RNA förvärvades en hopp-retur ekosekvens (pp = zggpjrse,15) för det enda målprovet i buffert.
Analys av data 19F-screeningproceduren tillämpades på TPP-riboswitchen thiM från E. coli och proteintyrosinkinas (PtkA) från M. tuberculosis bland flera andra mål16. Screeningbiblioteket 19F har 103 fragment som är uppdelade i 5 blandningar märkta från Mix A till E. Beredning av screeningprover kan utföras manuellt utan användning av en provpipetteringsrobot. 40 μM thiM RNA-innehållande lösning (buffertförhållanden) blandades med 3,2 μL från blandningarna. Ytterligare kontrollprover framställdes bestående av endast buffert, buffert med 5% DMSO (tidigare säkerställd stabiliteten hos biomakromolekylen i närvaro av önskad DMSO-koncentration) och buffert med RNA. Dessa 13 screeningprover bereddes och överfördes till 3 mm NMR-rör. Streckkoder för NMR-rör skannas och varje blandning i närvaro och frånvaro av RNA, samt kontrollprover mättes enligt de ovan nämnda 19F NMR-experimenten utförda vid 298 K. Screening av thiM RNA mot det interna biblioteket utfördes genom att utföra T2-mätningar med CPMG på 0 ms och 200 ms för varje prov. Korrekt shimming och vattendämpning övervakades efter avslutad mätning genom att jämföra alla DMSO-toppar när det gäller linjebreddning och intensitetsförlust av ytterligare uppmätta 1H 1D-experiment för alla prover. Bearbetning av erhållna CPMG T219F relaxation spectra utfördes med användning av ett tidigare preparerat respektive automatiserat makro i TopSpin. Dataanalys utfördes enligt instruktionerna i protokollavsnittet. De integrerade data som erhållits från TopSpin (enligt instruktionerna i protokollet) kan utvärderas snabbt och enkelt med hjälp av ett färdigt kalkylblad eller något liknande program genom att ställa in rätt villkor och trösklar. Som beskrivits tidigare är tröskelvärden användbara för att definiera bindemedel, svagt bindemedel eller icke-bindemedel. Figur 5 visar typiska resultat av CPMG-spektra för thiM RNA respektive PtkA. I vissa fall behövdes ytterligare expertgranskning. 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig05.jpg"> Figur 5: Utskuren av 19 F CPMG NMR-spektra som visar intensitetsförändringarna erhållna från olika fördröjningstider för CPMG-baserade experiment . (A) Representation av ett bindemedel (träff) och ett icke-bindemedel i 19F-fragmentbaserad screening utförd på TPP-riboswitch thiM RNA från E. coli. (B) Representation av ett bindemedel och ett icke-bindemedel i 19F fragmentbaserad screening utförd på PtkA från M. tuberculosis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
1h screening
Blandning design Det använda interna biblioteket är så mångsidigt att ingen blandningsdesign utfördes för 1H-screeningändamål. Detta innebär att 64 blandningar framställdes genom att slumpmässigt välja 12 som skulle blandas i en blandning.
Provberedning För 1H-screening av ett exemplifierande SARS-CoV-2 RNA utfördes automatiserad pipettering med hjälp av en pipetteringsrobot för att förbereda proverna. Fragmenten i varje blandning hade en koncentration av 4,2 mM i 90% d6-DMSO och 10% D2O. Den slutliga volymen av ett screeningprov var 200 μL med 5% D2Osom låsmedel. 64 prover vardera innehållande en annan blandning i 25 mM KPi, 50 mM KCl vid pH 6,2 pipetterades utan mål-RNA. Respektive 64 prover pipetterades med mål-RNA, var och en innehållande en annan blandning. RNA: Liland-förhållandet sattes till 1:20, vilket resulterade i en RNA-koncentration på 10 μM och en ligandkoncentration på 200 μM.
Analys av data För 1H-analysen användes FBS-verktyget i TopSpin. För att avgöra om ett fragment är en träff genomfördes 1D kemisk förskjutning, waterLOGSY och T2 avslappningsexperiment. För T2-avkoppling räknades en minskning i intensitet större än 30% som en träff, medan för den kemiska förskjutningen var en förskjutning större än 6 Hz cut-off. WaterLOGSY måste visa en signifikant signalförändring (från negativ till positiv i detta fall). Om två av dessa tre kriterier var positiva räknades ett fragment som en träff. Två exempel på detta kan ses i figur 6.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig06.jpg"> Figur 6: 1H-screening utförd på ett exemplifierande SARS-CoV-2-RNA som visar träffbestämningskriterier. Förvärv av tre olika experiment (1 H T2 CPMG (5/100 ms), waterLOGSY och 1D 1H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Träff-1 visar en T2-minskning på ~50 % och en CSP ≥ 6 Hz. WaterLOGSY visar inte en tillräckligt signifikant förändring i signalen för att också räknas som positiv. Eftersom två av tre experiment är positiva räknas detta fragment som en träff. För Hit-2 visar T2 en minskning med ~ 80% signalintensitet och en tydlig signalförändring kan ses för waterLOGSY. CSP räcker inte i det här fallet, men eftersom de två tidigare kriterierna är positiva räknas det fortfarande som en träff.

Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

Fragmentbaserad screening med NMR är en robust metod för att snabbt identifiera småmolekylära bindemedel till biomakromolekyler (DNA, RNA eller proteiner). Protokoll som beskriver automationsbaserad provberedning, NMR-experiment & förvärvsförhållanden och analysarbetsflöden presenteras. Tekniken möjliggör optimalt utnyttjande av både 1H och 19F NMR-aktiva kärnor för detektion.

NMR-baserad fragmentscreening i ett minimalt prov men maximalt automatiseringsläge

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Vi utför kärnmagnetiska resonansstudier. Detta gör att vi kan bestämma strukturerna av proteiner, RNA och DNA i lösning. Dessa biomolekyler är beståndsdelarna, är komponenterna i våra celler, och våra protokoll som vi presenterar här handlar om screening av små molekyler och deras bindning till dessa mål.Från dessa molekyler kan vår läkemedelskemi och strukturbiologi härleda nya läkemedel som bekämpar sjukdomar. Den största fördelen med vår teknik är att vi har full kontroll över kvaliteten på de molekylära målen, som proteinerna, och vi har full kontroll över kvaliteten på småmolekylfragmenten och läkemedlen, och vi kan också screena proteiner för bindning av ett brett spektrum av affiniteter, vilket är en fördel jämfört med andra metoder. För att förbereda skärmprover för NMR-mätning, använd en provberedningsrobot för att fördela 768 föreningar i åtta 96-brunnsplattor för att erhålla 64 blandningar innehållande 12 fragment till en slutlig koncentration av 4,2 millimolar per blandning.Överför det biomolekylära målet av intresse, utspätt i en lämplig screeningbuffert, till lämpligt antal streckkodade tre millimeter NMR-provväxlarrör med hög genomströmning och använd roboten för att överföra 10 mikroliter av varje ligandblandning till varje rör av målbiomolekyl. Låt sedan roboten blanda lösningarna noggrant. För NMR-insamling, ladda provet i spektrometern.Öppna spektrometerns programvara och välj sedan parameteruppsättning och pulssekvenser för ligandbaserade experiment. För alla listade experiment, välj excitationsskulptur som vattendämpning. För fluor-19-screening, välj både 1D- och T2-experiment.Välj spektralbredd till 220 delar per miljon, excitationsfrekvensen till 140 delar per miljon och analystiden mellan en till fem timmar. För T2 bör CPMG-tiden växla mellan 5 och 100 millisekunder. Spela in T1r- och T2-experimenten.Registrera mättnadsöverföringsskillnaden som en pseudo 2D. För att bearbeta de två enskilda 1D-spektra, använd AU-programmets ProcStd-funktion, med eller utan relax-alternativet. WaterLOGSY är en enda 1D som ska fasas med ett negativ för lösningsmedelssignalen.För att analysera vätescreeningdata, följ instruktionerna för det fragmentbaserade screeningverktyget för att lagra biomolekylär magnetisk resonans NMR-data från screeningkampanjer, så att varje screeningblandning har sin katalog där en underkatalog innehåller de olika experimenten som mäts på provet. Lagra referensspektra, med alla data sparade från proverna utan det biomolekylära målet, men med blandningarna och den enskilda föreningen i olika kataloger. Skapa en direkt sökväg till katalogen som innehåller inhämtade data och välj NMR-katalogen där alla blandningar ska ha en distinkt katalog.Kontrollera att CSV-, fragmentskärmen, XML-dokumentet och BAC-filerna också kopieras till NMR-katalogen för data. Om du vill använda det fragmentbaserade screeningverktyget för ett avskärmat prov drar du den fragmentbaserade symbolen för screeningprojekt till mitten av analysfönstret. Symbolen ska visas om de tidigare sparade datauppsättningarna kopierades till den.Fönstret för fragmentbaserade gallringsalternativ bör öppnas automatiskt. Välj en CSV-cocktailfil som innehåller namnen på blandningarna, namnen på varje fragment och uppdelningen av varje fragment i blandningarna. Definiera en referensligandspektramapp med alla uppmätta spektra för de enskilda fragmenten och definiera en referenstom experimentmapp, som vanligtvis innehåller datauppsättningarna för blandningarna utan det undersökta målet.För att definiera de undersökta spektra- och spektradisplayfärgerna, öppna fliken Spektratyper och ställ in specifikationstypen enligt processdata. På fliken Visningslayout definierar du de spektra som ska jämföras enligt specifikationstyperna. Klicka sedan på OK för att starta projektet.Medan data bearbetas öppnas ett separat fönster med tabellen som sammanfattar alla cocktailblandningar och liganderna i varje blandning. Dubbelklicka på en cell för att öppna respektive datauppsättningar. Innan du tilldelar bindemedel, se till att referenstopparna matchar varandra och har samma kemiska skift.Om skillnader observeras öppnar du fliken Process och använder alternativet för seriell bearbetning för att korrigera dem. För den första analysen av fluor-19-blandningarna öppnar du fliken Analysera och väljer integrationsfunktionen. Se till att ett tydligt integrationsområde för motsvarande fluor-19-signal definieras för varje fragment i blandningen.Spara exportintegreringsregioner för att exportera integrationsfilen för framtida användning och spara alla använda integreringsfiler i lämplig installationskatalog. För fluor-19-data öppnar du en datauppsättning med eller utan det undersökta målet och klickar på Integrera och läs Importera integrationsregioner under fliken Analysera för att läsa in motsvarande integrationsfil i det aktuella spektrumet. Klicka sedan på Spara och gå tillbaka för att hitta en lista över de integrerade regionerna på fliken Integraler och kopiera informationen till ett kalkylblad för underordnad analys.Den molekylära strukturen eller sammansättningen av liganderna i fragmentbiblioteket analyseras med hjälp av molekylär konfidensprogramvara som demonstreras, och resultaten presenteras som en grafisk utgång. En orange färg indikerar att fragmentet uppvisar en inkonsekvens i struktur eller koncentration. Grönfärgade brunnar indikerar att fragmentet är konsekvent.I denna representativa analys delades 103 fragment innehållande en eller flera fluorgrupper från det egna biblioteket in i fem blandningar av 20 till 21 fragment per blandning. Fluor-19 tvärgående avslappningsexperiment mättes för varje blandning som applicerade CPMG-pulståg. Tröskelvärden är användbara för att definiera bindemedel, svagt bindemedel eller icke-bindemedel i blandningen, vilket observeras i dessa typiska tiaminproteintyrosinkinas A- och RNA-spektra.I denna representativa analys visade träff ett en T2-minskning på cirka 50% och ett kemiskt skift större än eller lika med sex hertz. WaterLOGSY uppvisade ingen signifikant förändring i signal för att räknas som positiv. Men eftersom två av tre experiment var positiva räknades detta fragment som en träff.För träff två visade T2 en minskning med cirka 80% i signalintensitet. En tydlig signalförändring observerades också för WaterLOGSY. Det kemiska skiftet var inte tillräckligt i detta experiment, men eftersom de två tidigare kriterierna var positiva räknades det fortfarande som en träff.Det slutliga målet med sådana metoder är att utveckla nya läkemedel eller högaffinitetshämmare av till exempel enzymer, och i detta tar läkemedelskemi över och syntetiserar dessa nya molekyler, men strukturbiologi, de tekniker du tillämpar här kan styra läkemedelskemi och göra det tillvägagångssättet mycket snabbare.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiserad Acoustic Utlämning för serieutspädning av peptidagonister i Styrka Fastställande Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Spårning i realtid av DNA-fragment separering av smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En allt-i-ett-provhållare för makro molekyl ära röntgenkristallografi med minimal bakgrunds spridning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetisk screening av Nukleasaktivitet med hjälp av Nukleinsyrprober

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening för Thermotoga maritima membran-bundna Pyrofosfatashämmare

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Provberedning för Proteomics Facility Submission och efterföljande dataanalys

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Arbetsflöde och verktyg för kristallografisk fragmentscreening på Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En provförberedande pipeline för mikrokritaler vid VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...