Name: nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode
Uploaded: 2021-06-04T15:00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

Bu çalışma, Avrupa Komisyonu'nun Horizon 2020 programı tarafından finanse edilen 871037 numaralı proje iNEXT-Discovery tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Yanamala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-Based+Screening+of+Membrane+Protein+Ligands.">NMR-Based Screening of Membrane Protein Ligands.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 75, 237-256 (2010).</li><li>Souers, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABT-199,+a+potent+and+selective+BCL-2+inhibitor,+achieves+antitumor+activity+while+sparing+platelets.">ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets.</a> Nature Medicine. 19, 202-208 (2013).</li><li>Su, M. C., Te Chang, C., Chu, C. H., Tsai, C. H., Chang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atypical+RNA+pseudoknot+stimulator+and+an+upstream+attenuation+signal+for+-1+ribosomal+frameshifting+of+SARS+coronavirus.">An atypical RNA pseudoknot stimulator and an upstream attenuation signal for -1 ribosomal frameshifting of SARS coronavirus.</a> Nucleic Acids Research. 33, 4265-4275 (2005).</li><li>Perera, T. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+&amp;+pharmacological+characterization+of+JNJ-42756493+(Erdafitinib),+a+functionally+selective+small-molecule+FGFR+family+inhibitor.">Discovery &amp; pharmacological characterization of JNJ-42756493 (Erdafitinib), a functionally selective small-molecule FGFR family inhibitor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16, 1010-1020 (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+pharmacology+of+a+highly+specific+dual+FMS+and+KIT+kinase+inhibitor.">Design and pharmacology of a highly specific dual FMS and KIT kinase inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5689-5694 (2013).</li><li>Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., Feeney, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+computational+approaches+to+estimate+solubility+and+permeability+in+drug+discovery+and+development+settings.">Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 23, 3-25 (1997).</li><li>Congreve, M., Carr, R., Murray, C., Jhoti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+'Rule+of+Three'+for+fragment-based+lead+discovery.">A 'Rule of Three' for fragment-based lead discovery.</a> Drug Discovery Today. 8, 876-877 (2003).</li><li>Ch&#225;vez-Hern&#225;ndez, A. L., S&#225;nchez-Cruz, N., Medina-Franco, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fragment+Library+of+Natural+Products+and+its+Comparative+Chemoinformatic+Characterization.">A Fragment Library of Natural Products and its Comparative Chemoinformatic Characterization.</a> Molecular Informatics. 39, 2000050 (2020).</li><li>Sreeramulu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+quality+control+of+fragment+libraries+for+screening.">NMR quality control of fragment libraries for screening.</a> Journal of Biomolecular NMR. , 00327-00329 (2020).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+NMR+Fragment+Based+Screening+Identified+a+Novel+Interface+Blocker+to+the+LARG/RhoA+Complex.">Automated NMR Fragment Based Screening Identified a Novel Interface Blocker to the LARG/RhoA Complex.</a> PLoS One. 9, 88098 (2014).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+Efficient+Fragment-Based+Lead+Generation+by+Fully+Automated+Processing+and+Analysis+of+Ligand-Observed+NMR+Binding+Data.">Fast and Efficient Fragment-Based Lead Generation by Fully Automated Processing and Analysis of Ligand-Observed NMR Binding Data.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 3303-3310 (2016).</li><li>Cox, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP(2),+an+atypical+bromodomain.">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).</li><li>Hwang, T. L., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Suppression+That+Works.+Excitation+Sculpting+Using+Arbitrary+Wave-Forms+and+Pulsed-Field+Gradients.">Water Suppression That Works. Excitation Sculpting Using Arbitrary Wave-Forms and Pulsed-Field Gradients.</a> Journal of Magnetic Resonance, Series A. 112, 275-279 (1995).</li><li>Gossert, A. D., Jahnke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+in+drug+discovery:+A+practical+guide+to+identification+and+validation+of+ligands+interacting+with+biological+macromolecules.">NMR in drug discovery: A practical guide to identification and validation of ligands interacting with biological macromolecules.</a> Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 97, 82-125 (2016).</li><li>Sklenar, V., Bax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+water+suppression+technique+for+generating+pure-phase+spectra+with+equal+excitation+over+a+wide+bandwidth.">A new water suppression technique for generating pure-phase spectra with equal excitation over a wide bandwidth.</a> Journal of Magnetic Resonance. 75, 378-383 (1987).</li><li>Binas, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=19F+NMR-Based+Fragment+Screening+for+14+Different+Biologically+Active+RNAs+and+10+DNA+and+Protein+Counter-Screens.">19F NMR-Based Fragment Screening for 14 Different Biologically Active RNAs and 10 DNA and Protein Counter-Screens.</a> ChemBioChem. , (2020).</li></ol>

NMR tabanlı fragman/ilaç taramasının çok yönlülüğü. BMRZ, ilaç keşfi için çok çeşitli afinite rejimindeki parçaları tanımlamak için son teknoloji ürünü otomatik NMR enstrümantasyonunun yanı sıra STD-NMR, waterLOGSY ve gevşeme deneylerini başarıyla uygulamıştır. Kurulan donanım, yüksek verimli bir numune hazırlama robotu ve 600 MHz spektrometre ile ilişkili yüksek verimli numune depolama, değiştirici ve veri toplama ünitesi içerir. 1 H, 19 F, 13C ve 15N için yakın zamanda satın alınan bir kriyojenik prob, önerilen ölçümler için gerekli hassasiyeti sağlar ve 19F algılama sırasında 1 H (1) dekuplaja izin verir. Bu prob, CMC-q, CMC-assist, CMC-se ve FBS (TopSpin'e dahil) dahil olmak üzere Bruker'in gelişmiş yazılım araçlarını kullanma imkanı sunan en yeni nesil NMR konsoluna bağlanır. Parça tabanlı tarama (FBS) aracı, TopSpin'in en son sürümüne dahil edilmiştir ve STD, waterLOGSY, T2 / T1r-gevşeme deneylerinden oluşan yüksek verimli verilerin analiz edilmesine yardımcı olur. Sıvı 1D 1H numune toplama, numune doldurma robotu kullanılarak NMR tüplerine otomatik bir şekilde doldurulabilir. Tipik olarak, 96 tüpten (3 mm) oluşan bir blok yaklaşık iki saat içinde doldurulur. 96 delikli plaka rafları, bloğun barkodunu okuyan ve NMR tüplerini otomasyon yazılımı (IconNMR) tarafından kontrol edilen deneylere atayan HT numune değiştiriciye doğrudan yerleştirilir. HT numune değiştiricide aynı anda beş adet 96 delikli plaka rafı saklanabilir ve programlanabilir. Her bir rafın sıcaklığı ayrı ayrı kontrol edilebilir ve ayarlanabilir. Ek olarak, her bir numune ölçümden önce istenen sıcaklığa önceden koşullandırılabilir (yoğuşmuş nemin giderilmesi için ön ısıtma ve boru kurutma).
Çok çeşitli uygulamalar için uygunluk. Bu otomatik NMR tabanlı taramanın geniş uygulamalarından biri, bir biyomakromoleküler hedefe (DNA / RNA / Proteinler) bağlanan yeni ligandları tanımlamak ve geliştirmektir. Bu ligandlar, tipik olarak kovalent olmayan şekilde bağlanan ortosterik ve allosterik inhibitörleri içerebilir. Ayrıca, NMR tarafından FBDD tipik olarak umut verici bileşikleri seçmek için ilk adım olarak kullanılır, karşılanması gereken gereksinimler biyomoleküler hedefin yeterli miktarlarda mevcudiyetidir. Bu hedef iki ana göreve ayrılmıştır.
Birinci görev, aşağıdaki nedenlerden dolayı şirket içi bir parça kütüphanesi geliştirmek ve karakterize etmektir: 1000'den fazla parçanın ilk ve periyodik kalite kontrolü, karakterizasyonu ve nicelleştirilmesi; fragmanların her bir hedef için, özellikle protein hedefleri için optimize edilmiş tamponlardaki çözünürlüğünün belirlenmesi; ve çeşitli iskeleleri barındıracak ve diğer makromolekül sınıflarına doğru uzanacak birkaç kütüphanenin kurulması. İkinci görev, NMR tarafından fragman tabanlı ilaç tasarımı (FBDD) için iş akışlarını entegre etmektir: otomatik 1D-ligand gözlemlenen tarama (1H ve 19F gözlenen); ortosterik ve allosterik bağlamayı ayırt etmek için otomatik replasman testleri ((doğal) ligand ile rekabet deneyleri); birden fazla parçaya sahip otomatik ikincil taramalar; otomatik 2D-protein taraması ve EU-OPENSCREEN kütüphanesini veya başka bir kütüphaneyi kullanan ilk vuruş etrafında bir dizi türevin ikincil taraması; ve seçilen hedeflere karşı FDA kütüphanesinin yeniden profillendirilmesi.
Ek olarak, hücre döngüsü kontrolünü ve metabolizmasını birbirine bağlayan düzenleyici mekanizmaları çözmek için çeşitli hücre hatlarının metabotiplemesi (hastalıkla ilgili) yapılabilir. Ayrıca, yapı / alan optimizasyonunun optimizasyonu için in vivo ve in vitro RNA / DNA / protein düzenleme elemanlarının fonksiyonel karakterizasyonu (yapısal araştırmalar için stabilite optimizasyonu (Tampon, pH, sıcaklık ve tuz taraması) ve NMR bazlı fragman taramasının membran proteinlerine ve genellikle diğer tekniklere erişilemeyen içsel olarak bozulmuş proteinlere genişletilmesi vardır.
Sınırlama. 19F ve 1H parça kütüphanelerinin kullanımının artıları ve eksileri vardır, bunlardan birkaçı aşağıda belirtilecektir. 19F'ye karşı 1H ölçümlerinin en büyük yararı, hem gerçek ölçüm süresinin hem de sonraki analizin hızıdır, çünkü karışımlar neredeyse iki kat daha fazla parça içerir ve daha az deney yapılması gerekir. Takip analizi, 19F tarama için de daha kolaydır, çünkü tamponlardan parazit yoktur ve ayrıca optimum şekilde tasarlanmış bir parça karışımı için neredeyse hiç sinyal çakışması olmadan daha geniş bir kimyasal kayma aralığı sunar. Spektrumların kendileri büyük ölçüde basitleştirilmiştir, genellikle flor atomlarının sayısına bağlı olarak parça başına sadece bir veya iki sinyale sahiptir. Bu spektrumların analizi bu nedenle otomatikleştirilebilir ve yine zaman içinde kısaltılabilir. Bu, en azından bu çalışmada kullanılan kütüphane için kimyasal çeşitlilik pahasına gelir. Kütüphanenin sadece ~% 13'ü 19 F içerdiğinden, ancak doğal olarak hepsi 1H taramasında kullanılabilir olduğundan, 19F tarama parçalarının çeşitliliği daha düşük olacaktır. Bu, daha fazla parçaya ve daha büyük kimyasal çeşitliliğe sahip özel olarak tasarlanmış 19F kütüphaneleri kullanılarak atlatılabilir. 19F tarama için bir diğer dezavantaj, parça başına düşük sinyal sayısıdır. Parçalar genellikle birden fazla hidrojen atomundan oluşur. Bu nedenle, 1saat gözlemlenen tarama deneyleri, bağlanmayı tespit etmek için aynı parça için farklı sinyallere güvenebilir. Bu, 1H taraması için isabetleri belirlerken daha yüksek bir güven derecesi sağlarken, 19F taraması parça başına verilen bir veya iki sinyale dayanmalıdır.
Modern otomatik NMR tabanlı fragman tarama enstrümantasyonu, yazılım ve analiz yöntemleri ve bunların protokolleri hakkında ayrıntılı bir açıklama sunulmuştur. Kurulan donanım, yüksek verimli bir numune hazırlama robotu ve 600 MHz spektrometre ile ilişkili yüksek verimli bir numune depolama, değiştirici ve veri toplama ünitesi içerir. 1H, 19 F, 13 C ve 15N için yakın zamanda monte edilmiş bir kriyojenik prob kafası, önerilen ölçümler için gerekli hassasiyeti sağlar ve 19F algılama sırasında 1H dekuplaja izin verir. Ayrıca, en yeni nesil NMR konsolu, edinim ve anında analize yardımcı olmak için gelişmiş analitik yazılım kullanma imkanı sunar. Yukarıda tartışılan teknoloji, iş akışları ve açıklanan protokoller, FBS'yi NMR tarafından takip eden kullanıcılara kayda değer bir başarı sağlamalıdır.

Fragman bazlı tarama, proteinler, DNA ve RNA dahil olmak üzere makromoleküler hedeflere zayıf bağlanma gösteren oldukça basit ve düşük moleküler ağırlıklı molekülleri (MW <250 Da) tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Birincil ekranlardan gelen ilk isabetler, isabetlerin ticari olarak temin edilebilen daha büyük analoglarının ikincil bir ekranını yürütmek ve daha sonra kimya tabanlı parça büyümesi veya bağlantı stratejilerini kullanmak için temel oluşturur. Başarılı bir fragman tabanlı ilaç keşif (FBDD) platformu için, genel olarak, zayıf isabetleri tespit etmek ve karakterize etmek için sağlam bir biyofiziksel yöntem, bir parça kütüphanesi, bir biyomoleküler hedef ve takip kimyası için bir strateji gereklidir. İlaç keşif kampanyalarında yaygın olarak uygulanan dört biyofiziksel yöntem, termal kayma testleri, yüzey plazmon rezonansı (SPR), kristalografi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisidir (NMR).
NMR spektroskopisi, FBDD'nin farklı aşamalarında çeşitli roller göstermiştir. Optimize edilmiş bir tampon sistemde çözünmüş bir fragman kütüphanesindeki parçaların kimyasal saflığını ve çözünürlüğünü sağlamanın yanı sıra, ligand gözlemlenen NMR deneyleri, düşük afiniteli bir hedefe parça bağlanmasını tespit edebilir ve hedef gözlemlenen NMR deneyleri, parçanın bağlanma epitopunu tanımlayabilir, böylece ayrıntılı yapı-aktivite ilişkisi çalışmalarına olanak tanır. Epitop haritalamasında, NMR tabanlı kimyasal kayma değişiklikleri sadece ortosterik bağlanma bölgelerini değil, aynı zamanda şifreli olabilecek ve sadece biyomoleküler hedefin uyarılmış konformasyonel durumlarında erişilebilen allosterik bölgeleri de tanımlamakla kalmaz. Biyomoleküler hedef zaten endojen bir ligandı bağlarsa, tanımlanan fragman vuruşları, NMR tabanlı rekabet deneyleri yapılarak kolayca allosterik veya ortosterik olarak sınıflandırılabilir. Ligand-hedef etkileşiminin ayrışma sabitinin (KD) belirlenmesi, FBDD sürecinde önemli bir husustur. NMR bazlı kimyasal kayma titrasyonları, ligand veya gözlemlenen hedef, KD'yi belirlemek için kolayca gerçekleştirilebilir. NMR'nin en büyük avantajı, etkileşim çalışmalarının çözelti içinde ve fizyolojik koşullara yakın bir yerde yapılmasıdır. Böylece, hedefi ile ligand / fragman etkileşiminin analizi için tüm konformasyonel durumlar araştırılabilir. Ayrıca, NMR tabanlı yaklaşımlar sadece iyi katlanmış çözünür proteinlerin taranmasıyla sınırlı değildir, aynı zamanda DNA, RNA, membrana bağlı ve içsel olarak düzensiz proteinler1 dahil olmak üzere daha büyük hedef alanı barındırmak için de uygulanmaktadır.
Parça kütüphaneleri FBDD sürecinin vazgeçilmez bir parçasıdır. Genel olarak, fragmanlar, sonunda biyolojik bir hedef için geliştirilen yeni inhibitörün bir parçası (altyapısı) haline gelen ilk öncüller olarak hareket eder. Bazı ilaçların (Venetoclax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) fragman olarak başladığı ve günümüzde kliniklerde başarıyla kullanıldığı bildirilmiştir. Tipik olarak, fragmanlar yüksek sulu çözünürlük ve stabiliteye sahip düşük moleküler ağırlıklı (<250 Da) organik moleküllerdir. Tipik olarak birkaç yüz parça içeren özenle hazırlanmış bir parça kütüphanesi, kimyasal alanın verimli bir şekilde araştırılmasını vaat edebilir. Parça kütüphanelerinin genel bileşimi fazla mesai içinde evrimleşmiştir ve çoğu zaman bilinen ilaçların daha küçük parçalara ayrılmasıyla veya hesaplamalı olarak tasarlanmasıyla türetilmiştir. Bu çeşitli parça kütüphaneleri esas olarak düz aromatik veya heteroatomlar içerir ve 5 6'nın Lipinski Kuralına veya 3 7'nin mevcut ticari eğilim Kuralına uyar, ancak reaktif gruplardan kaçının. Bazı parça kütüphaneleri de yüksek oranda çözünür metabolitlerden, doğal ürünlerden ve veya bunların türevlerinden türetilmiş veya bunlardan oluşmuştur8. Parça kütüphanelerinin çoğunun ortaya koyduğu genel bir zorluk, aşağı akış kimyasının kolaylığıdır.
Frankfurt Goethe Üniversitesi'ndeki Biyomoleküler Manyetik Rezonans Merkezi (BMRZ), biyokimyasal ve biyomedikal araştırmaların tüm alanlarından tüm Avrupalı araştırmacılar için yapısal araştırma altyapıları konsorsiyumu olan iNEXT-Discovery'nin (Transformeral research-Discovery için NMR, EM ve X-ışınları için altyapı) ortağıdır. iNEXT'in 2019 yılında sona eren bir önceki girişimi kapsamında, geniş bir kimyasal alanı kapsayan "minimum parça ve maksimum çeşitlilik" hedefiyle 768 parçadan oluşan bir fragman kütüphanesi hazırlanmıştı. Ayrıca, diğer parça kütüphanelerinden farklı olarak, iNEXT parça kütüphanesi de karmaşık, yüksek afiniteli ligandların aşağı akış sentezini kolaylaştırmak amacıyla "hazır parçalar" kavramına dayanarak tasarlanmıştır ve bundan böyle kurum içi kütüphane olarak bilinir (Diamond, Structural Genomic Consortium ve iNEXT).
FBDD'nin NMR tarafından kurulması insan gücü, bilgi ve enstrümantasyon gerektirir. BMRZ'de, NMR tarafından parça taramasına teknik yardımı desteklemek için optimize edilmiş iş akışları geliştirilmiştir. Bunlar arasında parça kütüphanesi 9'un kalite kontrolü ve çözünürlük değerlendirmesi, seçilen hedefler için tampon optimizasyonu, 1H veya 19F- gözlemlenen 1D-ligand tabanlı tarama, ortosterik ve allosterik bağlanma arasında ayrım yapmak için rekabet deneyleri, epitop haritalaması için 2D tabanlı hedef gözlemlenen NMR deneyleri ve ilk parça isabetlerinin ikincil türev setiyle etkileşimi karakterize etmek için yer almaktadır. BMRZ, daha önce literatür 10,11'de de tartışıldığı gibi, küçük molekül-protein etkileşimlerinin analizi için otomatik rutinler oluşturmuştur ve NMR tabanlı fragman taraması için gerekli tüm otomatik altyapıya sahiptir. Çok çeşitli afinite rejimlerindeki parçaları tanımlamak için doygunluk transfer farkı NMR (STD-NMR), su-ligandı (waterLOGSY) ve Carr-Purcell-Meiboom-Gill tabanlı (CPMG tabanlı) gevşeme deneylerinin yanı sıra ilaç keşfi için son teknoloji ürünü otomatik NMR enstrümantasyonu ve yazılımı uygulamıştır. NMR bazlı fragman taraması proteinler için iyi kurulmuş olsa da, bu yaklaşım RNA ve DNA ile etkileşime giren yeni ligandları bulmak için daha az yaygın olarak kullanılmaktadır. BMRZ, küçük molekül-RNA / DNA etkileşimlerinin tanımlanmasını sağlayan yeni protokoller için kavram kanıtı oluşturmuştur. Bu katkının ilerleyen bölümlerinde, protein ve RNA örnekleri üzerinde tarama rutinlerinin uygulanmasının, biyomakromoleküler araştırmalarda geniş bir kullanıcı tabanı için belirlenmiş protokollerin farkında olduğu bildirilmektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bruker Avance III HD</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>600 MHz NMR Spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes</td>
			<td>3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Barcoded Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix SepraSeal und DuraSeal&#38;</td>
			<td>4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SampleJet</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>HT Sample Changer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SamplePro Tube</td>
			<td></td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Pipetting Robot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode

Fragman tabanlı tarama (FBS), hem akademide hem de endüstride ilaç keşif sürecinde iyi doğrulanmış ve kabul görmüş bir kavramdır. NMR tabanlı fragman taramasının en büyük avantajı, sadece 7-8 afinite büyüklüğünün üzerindeki bağlayıcıları tespit etmekle kalmayıp, aynı zamanda parçaların saflığını ve kimyasal kalitesini izlemek ve böylece yüksek kaliteli isabetler ve minimum yanlış pozitifler veya yanlış negatifler üretmek için de yeteneğidir. FBS içindeki bir ön koşul, parça kütüphanesinin ilk ve periyodik kalite kontrolünü yapmak, ilgili tamponlardaki parçaların çözünürlüğünü ve kimyasal bütünlüğünü belirlemek ve çeşitli makromolekül hedef sınıflarını (proteinler / RNA / DNA) barındırmak için çeşitli iskeleleri kapsayacak şekilde çoklu kütüphaneler oluşturmaktır. Ayrıca, numune miktarları, biyolojik yapı/fragman-uzay düzeyinde, koşul-uzayda (tampon, katkı maddeleri, iyonlar, pH ve sıcaklık) ve ligand-uzayda (ligand analogları, ligand konsantrasyonu) elde etme ve analiz hızı açısından kapsamlı bir NMR tabanlı tarama protokolü optimizasyonu gereklidir. En azından akademide, bu tarama çabaları şimdiye kadar çok sınırlı bir şekilde manuel olarak gerçekleştirilmiş ve bu da sadece ilaç geliştirme sürecinde değil, aynı zamanda kimyasal prob geliştirme bağlamında da tarama altyapısının sınırlı mevcudiyetine yol açmıştır. Gereksinimlerin ekonomik olarak karşılanabilmesi için gelişmiş iş akışları sunulmaktadır. Sıvı numune toplamanın sıcaklık kontrollü bir şekilde NMR tüplerine otomatik bir şekilde doldurulabildiği en son teknoloji ürünü gelişmiş donanımdan yararlanırlar. 1H / 19F NMR ligand bazlı spektrumlar daha sonra belirli bir sıcaklıkta toplanır. Yüksek verimli numune değiştirici (HT numune değiştirici), sıcaklık kontrollü bloklarda 500'den fazla numuneyi işleyebilir. Bu, gelişmiş yazılım araçlarıyla birlikte veri toplama ve analizini hızlandırır. Ayrıca, tarama rutinlerinin protein ve RNA örnekleri üzerinde uygulanması, biyomakromoleküler araştırmalarda geniş bir kullanıcı tabanı için belirlenmiş protokollerin farkında olmak için açıklanmaktadır.

Parça kütüphanesinin kalite kontrolü Şirket içi kütüphaneden alınan parçalar, %90 d6-DMSO ve %10D2O'da 50 mM stok çözeltileri olarak teslim edildi (D2O'nun%10'u, tekrarlanan donma-çözülme döngüleri nedeniyle bileşik bozulmanın en aza indirilmesini sağlar14). Tek bileşik numuneler, 50 mM fosfat tamponunda 1 mM liganddan (25 mM KPi pH 6.2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl2), %90 H2 O/%9D2O/%1 d6-DMSO'da pH 6.0'dan oluşuyordu. 1iNEXT kütüphanesinden parçaların H-NMR deneyleri 500/600 MHz NMR spektrometresinde ölçüldü. Bu veriler ayrıca, kullanıcının spektrumları otomatik bir şekilde tam olarak elde etmesini sağlayan CMC-q yazılımı kullanılarak 1H tarama kampanyalarında tek bileşikleri tanımlamak için kullanıldı ve analiz eklentisi CMC-a, parçaların kalitesi (çözünürlük ve bütünlük) değerlendirildi. CMC-a'dan elde edilen otomatik analizden elde edilen sonuçlar, Şekil 3'te gösterilene benzer bir grafik çıktı olarak gösterilmiştir. Grafik çıktı, 96 delikli bir plakanın bir temsilini gösterir. Kırmızı renkli bir daire, bu parçanın yapı veya konsantrasyonda tutarsızlık gösterdiği anlamına gelir. Yeşil renkli kuyucuklar, parçanın tutarlı olduğunu gösterir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig03.jpg"> Şekil 3: Parça kütüphanesinin kalite kontrolü. CMC-a tabanlı otomatik çıktının şematik gösterimi. Konsantrasyon ve yapısal bütünlük gibi parça özellikleri değerlendirilir. Yeşil tutarlı anlamına gelir, bu durumda turuncu tutarsız anlamına gelir. Tutarsız parçalar, gösterilen iş akışının ardından el ile gözden geçirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Yaklaşık olarak, fragmanların yaklaşık% 65'i ve% 35'i hem DMSO hem de tamponda sırasıyla tutarlı ve tutarsız olarak sınıflandırıldı. Ayrıca, tutarsız sınıflandırılmış ligandların% 30'u, spektrumların dikkatli bir manuel incelemesinden sonra tutarlı hale geldi9.
19F Karışım tasarımı Kurum içi kütüphaneden bir veya birkaç flor grubu içeren 103 parça 5 karışıma (A, B, C, D, E) bölünmüştür. Her karışımın 20 ila 21 parçası vardır. Bu durumda, karışımların sinyal çakışmasını önlemek için dikkatlice tasarlanması gerekiyordu. 19CPMG darbe trenleri uygulayan her karışım için F enine gevşeme deneyleri ölçüldü. Bu deneyler, gevşeme gecikmelerini değiştirerek değiştirilebilir. A-E karışımlarının 19F kimyasal kayması Şekil 4'te görülebilir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig04.jpg"> Şekil 4: Şirket içi kütüphaneden alınan karışım örneklerinin 19F 1D-NMR spektrumu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Numune hazırlama 19F eleme prosedüründeki numune hazırlama işlemi manuel olarak veya pipetleme robotu kullanılarak otomatik pipetleme ile yapıldı. Her karışımdaki fragmanlar,% 90 d6-DMSO ve% 10D2O'da 2.5 mM'lik bir konsantrasyona sahipti. Bir tarama numunesinin son hacmi, bir kilitleme maddesi olarak% 5 D2O ile 170 μL idi. Her karışım, biri çözelti içeren bir tamponda (hedefsiz) ve diğeri tampon çözeltisi içeren bir hedefe olmak üzere iki kez pipetlendi. Hedef ve fragman oranı 1: 1 olarak ayarlandı ve 50 μM'lik bir nihai hedef / ligand konsantrasyonu ile sonuçlandı. Ek olarak, kontrol numuneleri, hedef bütünlüğünü sağlamak için karışımsız tarama tamponunda hedef biyomolekülün yanı sıra tampon kalitesini sağlamak için sadece tampon ve D2O içeren bir kontrol numunesidir.
19F-1D ve 19F-CPMG-T2'nin NMR tarama verileri, bölüm 3.1'de açıklandığı gibi ölçümlerdir. Örneğin, RNA durumunda, tampondaki tek hedef örnek için bir sıçrama-geri dönüş yankı dizisi (pp = zggpjrse,15) elde edildi.
Veri Analizi 19F tarama prosedürü, diğer bazı hedeflerin yanı sıra E. coli'den TPP riboswitch thiM'ye ve M. tuberculosis'ten protein tirozin kinazına (PtkA) uygulandı16. 19F eleme kütüphanesi, Karışım A'dan E'ye etiketlenmiş 5 Karışıma bölünmüş 103 parçaya sahiptir. 40 μM thiM RNA içeren çözelti (tampon koşulları) karışımlardan 3.2 μL ile karıştırıldı. Sadece tampon, DMSO'nun% 5'i ile tampon (daha önce istenen DMSO konsantrasyonunun varlığında biyomakromolekülün stabilitesini sağlamak) ve RNA ile tampondan oluşan daha fazla kontrol numunesi hazırlandı. Bu 13 tarama örneği hazırlandı ve 3 mm'lik NMR tüplerine aktarıldı. NMR tüplerinin barkodları taranır ve RNA varlığı ve yokluğunda her karışım ve kontrol numuneleri yukarıda belirtilen 19F NMR deneylerine göre ölçülmüştür 298 K'da yapılan thiM RNA'nın kurum içi kütüphaneye karşı taranması, her farklı numune için 0 ms ve 200 ms'lik CPMG'lerle T2 ölçümleri yapılarak gerçekleştirilmiştir. Tüm DMSO piklerini, tüm numuneler için ek olarak ölçülen 1 H 1Ddeneylerinin çizgi genişlemesi ve yoğunluk kaybı açısından karşılaştırarak ölçümleri bitirdikten sonra uygun şimleme ve su bastırma izlendi. Elde edilen CPMG T219F gevşeme spektrumlarının işlenmesi, sırasıyla TopSpin'de önceden hazırlanmış ve otomatikleştirilmiş bir makro kullanılarak gerçekleştirildi. Veri analizi, protokol bölümündeki talimatlar izlenerek gerçekleştirilmiştir. TopSpin'den elde edilen integral veriler (protokoldeki talimatları izleyerek), doğru koşulları ve eşikleri ayarlayarak önceden hazırlanmış bir elektronik tablo veya benzer bir program kullanılarak hızlı ve kolay bir şekilde değerlendirilebilir. Daha önce açıklandığı gibi, eşikler bağlayıcıyı, zayıf bağlayıcıyı veya bağlayıcı olmayanı tanımlamada kullanışlıdır. Şekil 5, sırasıyla thiM RNA ve PtkA'nın CPMG spektrumlarının tipik sonuçlarını göstermektedir. Bazı durumlarda, daha fazla uzman revizyonuna ihtiyaç duyuldu. 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig05.jpg"> Şekil 5: CPMG tabanlı deneylerin farklı gecikme sürelerinden elde edilen yoğunluk değişikliklerini gösteren 19 F CPMG NMR spektrumundan kesilmiş. (A) E. coli'den TPP riboswitch thiM RNA üzerinde gerçekleştirilen 19F fragman bazlı taramada bir bağlayıcı (hit) ve bağlayıcı olmayan bir gösterimi. (B) M. tuberculosis'ten PtkA üzerinde yapılan 19F fragman bazlı taramada bağlayıcı ve bağlayıcı olmayan bir kişinin temsili. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
1Saat Gösterim
Karışım tasarımı Kullanılan kurum içi kütüphane o kadar çeşitlidir ki, 1saat tarama amacıyla hiçbir karışım tasarımı yapılmamıştır. Bu, 64 karışımın, bir karışımda karıştırılmak üzere rastgele 12 tanesi seçilerek hazırlandığı anlamına gelir.
Numune Hazırlama Örnek bir SARS-CoV-2 RNA'sının 1saatlik taraması için, numuneleri hazırlamak için bir pipetleme robotu kullanılarak otomatik pipetleme gerçekleştirildi. Her karışımdaki fragmanlar% 90 d6-DMSO ve% 10D2O'da 4.2 mM'lik bir konsantrasyona sahipti. Bir tarama numunesinin son hacmi, bir kilitleme maddesi olarak% 5D2O ile 200 μL idi. Her biri 25 mM KPi, pH 6.2'de 50 mM KCl'de farklı bir karışım içeren 64 numune, hedef RNA olmadan pipetlendi. Sırasıyla, her biri farklı bir karışım içeren 64 örnek hedef RNA ile pipetlendi. RNA: Ligand oranı 1:20 olarak ayarlandı, bu da 10 μM'lik bir RNA konsantrasyonu ve 200 μM'lik bir ligand konsantrasyonu ile sonuçlandı.
Veri Analizi 1H analizi için TopSpin'deki FBS aracı kullanılmıştır. Bir parçanın isabet olup olmadığını belirlemek için, 1D kimyasal kayma, waterLOGSY ve T2 gevşeme deneyleri yapıldı. T2 gevşemesi için, yoğunlukta% 30'dan daha büyük bir azalma bir vuruş olarak sayılırken, kimyasal kayma için 6 Hz'den daha büyük bir kayma kesme oldu. WaterLOGSY'nin önemli bir sinyal değişikliği göstermesi gerekiyordu (bu durumda negatiften pozitife). Bu üç kriterden herhangi ikisi pozitifse, bir parça isabet olarak sayıldı. Bunun için iki örnek Şekil 6'da görülebilir.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig06.jpg"> Şekil 6: Hit belirleme kriterlerini gösteren örnek bir SARS-CoV-2 RNA üzerinde yapılan 1H taraması. Üç farklı deneyin elde edilmesi (1 H T2 CPMG (5/100 ms), waterLOGSY ve 1D 1H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
İsabet-1, ~% 50'lik bir T2 düşüşü ve 6 Hz'≥ bir CSP gösterir. waterLOGSY, sinyalde pozitif olarak sayılacak kadar önemli bir değişiklik göstermez. Üç deneyden ikisi pozitif olduğundan, bu parça bir hit olarak sayılır. Hit-2 için, T2 ~% 80 sinyal yoğunluğunda bir azalma gösterir ve waterLOGSY için net bir sinyal değişimi görülebilir. CSP bu durumda yeterli değildir, ancak önceki iki kriter olumlu olduğu için hala bir isabet olarak sayılır.

Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode at JoVE.com

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

NMR ile fragman tabanlı tarama, küçük molekül bağlayıcılarını biyomakromoleküllere (DNA, RNA veya proteinler) hızlı bir şekilde tanımlamak için sağlam bir yöntemdir. Otomasyon tabanlı numune hazırlama, NMR deneyleri ve elde etme koşulları ve analiz iş akışlarını açıklayan protokoller sunulmaktadır. Bu teknik, tespit için hem 1H hem de 19F NMR-aktif çekirdeklerin optimum şekilde kullanılmasına izin verir.

Minimum numune ancak maksimum otomasyon modunda NMR tabanlı parça taraması

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Nükleer manyetik rezonans çalışmaları yapıyoruz. Bu, çözeltideki proteinlerin, RNA'nın ve DNA'nın yapılarını belirlememizi sağlar. Bu biyomoleküller hücrelerimizin bileşenleridir, bileşenleridir ve burada sunduğumuz protokollerimiz küçük moleküllerin taranması ve bu hedeflere bağlanmaları ile ilgilidir.Bu moleküllerden, tıbbi kimyamız ve yapısal biyolojimiz, hastalıklarla mücadele eden yeni ilaçlar türetebilir. Tekniğimizin temel avantajı, proteinler gibi moleküler hedeflerin kalitesi üzerinde tam kontrole sahip olmamız ve küçük molekül parçalarının ve ilaçların kalitesi üzerinde tam kontrole sahip olmamız ve ayrıca diğer metodolojilere kıyasla bir avantaj olan çok çeşitli afinitelerin bağlanması için proteinleri tarayabilmemizdir. NMR ölçümü için elek numuneleri hazırlamak üzere, karışım başına 4,2 milimolar nihai konsantrasyona kadar 12 parça içeren 64 karışım elde etmek üzere 768 bileşiği sekiz adet 96 delikli plakaya dağıtmak üzere bir numune hazırlama robotu kullanın.Uygun bir tarama tamponunda seyreltilmiş ilgili biyomoleküler hedefi, uygun sayıda barkodlu üç milimetrelik NMR yüksek verimli numune değiştirici tüplerine aktarın ve robotu, her ligand karışımının 10 mikrolitresini hedef biyomolekülün her bir tüpüne aktarmak için kullanın. Ardından, robotun çözeltileri iyice karıştırmasını sağlayın. NMR alımı için, numuneyi spektrometreye yükleyin.Spektrometre yazılımını açın, ardından ligand tabanlı deneyler için parametre kümesini ve darbe dizilerini seçin. Listelenen tüm deneyler için, su bastırma olarak uyarma heykelini seçin. Flor-19 taraması için hem 1B hem de T2 deneylerini seçin.Spektral genişliği milyonda 220 parçaya, uyarma frekansını milyonda 140 parçaya ve analiz süresini bir ila beş saat arasında seçin. T2 için, CPMG süresi 5 ila 100 milisaniye arasında değişmelidir. T1r ve T2 deneylerini kaydedin.Doygunluk transfer farkını sahte 2B olarak kaydedin. İki tek 1B spektrumu işlemek için, gevşeme seçeneği olsun veya olmasın, AU programı ProcStd işlevini kullanın. WaterLOGSY, çözücü sinyali için negatif ile fazlanması gereken tek bir 1D'dir.Hidrojen tarama verilerini analiz etmek için, tarama kampanyalarından biyomoleküler manyetik rezonans NMR verilerini depolamak için parça tabanlı tarama aracının talimatlarını izleyin, böylece her tarama karışımının, bir alt dizinin numune üzerinde ölçülen farklı deneyleri içerdiği dizini vardır. Referans spektrumlarını, biyomoleküler hedef olmadan numunelerden kaydedilen tüm verilere sahip olarak, ancak karışımlar ve farklı dizinlerdeki tek bileşikle saklayın. Elde edilen verileri içeren dizine doğrudan bir yol oluşturun ve tüm karışımların ayrı bir dizine sahip olması gereken NMR dizinini seçin.CSV, parça ekranı, XML belgesi ve BAC dosyalarının da verilerin NMR dizinine kopyalandığından emin olun. Filtrelenen bir örnek için parça tabanlı tarama aracını kullanmak üzere, parça tabanlı tarama projesi sembolünü analiz penceresinin ortasına sürükleyin. Simge, önceden kaydedilmiş veri kümeleri bu veri kümesine kopyalanmışsa görünmelidir.Parça tabanlı tarama seçenekleri penceresi otomatik olarak açılmalıdır. Mikslerin adlarını, her parçanın adını ve her parçanın mikslere bölünmesini içeren bir CSV kokteyl dosyası seçin. Tek parçaların ölçülen tüm spektrumlarını içeren bir referans ligand spektrum klasörü tanımlayın ve genellikle araştırılan hedef olmadan karışımların veri kümelerini içeren bir referans boş deney klasörü tanımlayın.İncelenen spektrumları ve spektrum görüntüleme renklerini tanımlamak için, Spektrum Türleri sekmesini açın ve spesifikasyon türünü proses verilerine göre ayarlayın. Görüntü Düzeni sekmesinde, teknik özellik türlerine göre karşılaştırılacak spektrumları tanımlayın. Ardından, projeyi başlatmak için Tamam'ı tıklatın.Veriler işlenirken, tüm kokteyl karışımlarını ve her karışımın ligandlarını özetleyen tablonun bulunduğu ayrı bir pencere açılacaktır. İlgili veri kümelerini açmak için bir hücreye çift tıklayın. Bağlayıcıları atamadan önce, referans piklerinin birbiriyle eşleştiğinden ve aynı kimyasal kaymaya sahip olduğundan emin olun.Farklılıklar gözlenirse, İşlem sekmesini açın ve bunları düzeltmek için seri işleme seçeneğini kullanın. Flor-19 karışımları üzerindeki ilk analiz için, Analiz sekmesini açın ve entegre işlevini seçin. Karışımdaki her parça için karşılık gelen flor-19 sinyali için net bir entegrasyon bölgesinin tanımlandığından emin olun.Tümleştirme dosyasını ileride kullanmak üzere dışa aktarmak için dışarı aktarma tümleştirme bölgelerini kaydedin ve kullanılan tümleştirme dosyalarını uygun yükleme dizinine kaydedin. Flor-19 verileri için, araştırılan hedef olsun veya olmasın bir veri kümesi açın ve Analiz sekmesi altında, ilgili tümleştirme dosyasını geçerli spektruma yüklemek için İçe Aktarma Tümleştirme Bölgelerini Tümleştirme ve Okuma Tümleştirme Bölgeleri'ne tıklayın. Ardından, İntegraller sekmesinde tümleşik bölgelerin listesini bulmak için Kaydet ve geri dön'ü tıklatın ve bu bilgileri aşağı akış analizi için bir elektronik tabloya kopyalayın.Fragman kütüphanesindeki ligandların moleküler yapısı veya yapısı, gösterildiği gibi moleküler güven yazılımı kullanılarak analiz edilir ve sonuçlar grafiksel bir çıktı olarak sunulur. Turuncu renk, parçanın yapı veya konsantrasyonda tutarsızlık sergilediğini gösterir. Yeşil renkli kuyular, parçanın tutarlı olduğunu gösterir.Bu temsili analizde, kurum içi kütüphaneden bir veya birkaç flor grubu içeren 103 parça, karışım başına 20 ila 21 parçadan oluşan beş karışıma bölünmüştür. CPMG darbe trenleri uygulayan her karışım için Flor-19 enine gevşeme deneyleri ölçüldü. Eşikler, bu tipik tiamin proteini tirozin kinaz A ve RNA spektrumlarında gözlendiği gibi, karışımdaki bağlayıcı, zayıf bağlayıcı veya bağlayıcı olmayanları tanımlamak için yararlıdır.Bu temsili analizde, isabetli bir vuruş yaklaşık% 50'lik bir T2 düşüşü ve altı hertz'den daha büyük veya ona eşit bir kimyasal kayma gösterdi. WaterLOGSY, pozitif olarak sayılacak sinyalde önemli bir değişiklik göstermedi. Bununla birlikte, üç deneyden ikisi pozitif olduğu için, bu parça bir hit olarak sayıldı.İkinci vuruş için, T2 sinyal yoğunluğunda yaklaşık% 80'lik bir düşüş gösterdi. WaterLOGSY için de net bir sinyal değişikliği gözlendi. Kimyasal kayma bu deneyde yeterli değildi, ancak önceki iki kriter pozitif olduğu için hala bir isabet olarak sayıldı.Bu tür yöntemlerin nihai amacı, örneğin enzimlerin yeni ilaçları veya yüksek afiniteli inhibitörleri geliştirmektir ve bu bağlamda, tıbbi kimya bu yeni molekülleri devralır ve sentezler, ancak yapı biyolojisi, burada uyguladığınız teknikler tıbbi kimyaya rehberlik edebilir ve bu yaklaşımı daha hızlı hale getirebilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Akıllı Telefon ile DNA Parçalarının Ayırılmasının Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Minimal arka plan saçılma ile Macromoleküler X-ışını Kristalografi için bir hepsi bir arada örnek tutucu

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nükleik Asit Probları Kullanılarak Nükleaz Aktivitesinin Kinetik Taraması

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Thermotoga maritima Membran Bağlı Pirofosfataz Inhibitörleri için tarama

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomik Tesis Gönderimi ve Müteakip Veri Analizi için TMT Örnek Hazırlama

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Helmholtz-Zentrum Berlin'de Kristalografik Parça Taraması için İş Akışı ve Araçlar

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...