Name: the establishment and utilization of patient derived xenograft models of central nervous system metastasis
Uploaded: 2021-05-07T14:00:00
Duration: 6 min 52 s
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图 3A 取自我们之前的出版物12 ，由梅奥诊所的 Jann Sarkaria 博士实验室生成。

以下是一系列分步方案，用于通过皮下侧腹植入建立PDX模型和建立临床前研究，以便能够测试治疗，这有助于评估生物学变化和转移级联的各个步骤。所有研究和模型均使用3-8周龄的雌性NOG小鼠。所有组织样本均根据机构审查委员会（IRB）批准的协议在知情同意下收集。所有动物实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
1. 侧翼植入PDX模型的建立与传播
<ol><li>建立PDX模型<ol><li>在手术室从患者身上手术切除肿瘤后，将新鲜肿瘤组织储存在合适的溶液（如DMEM）中，并立即将其放在冰上。使用过量的储存溶液（>10 mL）以确保组织完全浸没。</li>
		<li>将组织转移到组织培养皿中，并用 5 mL DPBS 冲洗。 注意：此步骤应使用无菌技术在生物安全柜中进行。应采取预防措施，穿戴适当的个人防护装备（PPE），以防止可能的人类传染因子。</li>
		<li>从肿瘤中去除坏死区域。 注意：这可以识别为朝向组织中心的白色糊状区域。</li>
		<li>将剩余的组织切成大约 2 x 2 x 2 毫米的碎片。</li>
		<li>将组织转移到含有生长因子还原基底膜基质的微量离心管中，并将它们储存在冰上。确保使用足够的基底膜基质（>200μL）完全浸没每个组织片。</li>
		<li>冷冻保存不会根据步骤1.3中描述的方案植入的剩余组织。</li>
		<li>在用2-5%异氟醚和氧气的诱导室中麻醉动物。麻醉后，将动物转移到鼻锥中，以保持麻醉在1.5-2.5%异氟醚下，并连续供氧。通过缺乏踏板反射确认麻醉深度。使用兽用眼药膏以防止手术期间眼睛干燥。在整个过程中为动物提供热支持，直到动物康复。</li>
		<li>识别鼠标上的植入部位。 注意：这应该在鼠标的右翼或左翼，通常在腹部区域的一侧横向标记，尾部到胸腔。</li>
		<li>要准备手术区域，请剃除皮毛并用三种聚维酮碘和70%乙醇交替擦洗消毒。</li>
		<li>使用镊子提起小鼠的皮肤，在皮肤上做一个0.5-1厘米的切口。</li>
		<li>在切口部位的皮肤下慢慢插入一把手术剪刀，在皮下空间形成一个口袋（0.5-1厘米深）。</li>
		<li>小心地将一块肿瘤片放入口袋中，然后将其推到口袋底部，以防止肿瘤滑出。</li>
		<li>使用4-0尼龙手术缝合线关闭切口。 注意：也可以使用其他伤口闭合方法，例如不可吸收或可吸收的缝合线和伤口夹。</li>
		<li>将小鼠移回笼子并监测动物从麻醉中恢复的情况，直到它可以走动。 注意：不需要镇痛药，但如果在小鼠中观察到疼痛，则可以施用。</li>
		<li>每周监测肿瘤生长。预计每只小鼠有一个肿瘤。 注意：移植时肿瘤的体积似乎最初会减少，但这不是引起关注的原因。一旦肿瘤变得可触及并进入对数生长阶段，就被认为是已经服用的。第一段话代表了F0一代。</li>
		<li>一旦肿瘤开始生长，每周测量肿瘤三次。用卡尺测量肿瘤的长度和宽度。要计算肿瘤的体积，请使用公式：长x宽x宽/ 2。</li>
		<li>当肿瘤直径大于15毫米时，使用肿瘤的最长边对植入PDX肿瘤的小鼠实施安乐死。通过在CO2诱导室中吸入CO2进行安乐死，然后作为辅助方法进行颈椎脱位。</li>
		<li>通过切口从动物的侧面切除肿瘤。用钝剪刀和镊子轻轻解剖切除的肿瘤。为此，首先切断肿瘤顶部的皮肤，然后将肿瘤从其下方的肌肉层切开。</li>
		<li>将肿瘤组织转移到 >10 mL 的合适储存溶液（如 DMEM）中。立即将其放在冰上。这种肿瘤可以冷冻保存或传代给另一组小鼠。将这段话视为F1。 注意：再次传代会使肿瘤传代为F2，依此类推。</li>
	</ol></li>
	<li>PDX 模型的传播<ol><li>从步骤1.1.19中保存在储存溶液中的切除肿瘤开始。</li>
		<li>将组织转移到组织培养皿中，并用 5 mL DPBS 冲洗。</li>
		<li>从肿瘤中去除坏死区域。</li>
		<li>将组织切成大约 2 x 2 x 2 毫米的碎片。</li>
		<li>将组织转移到含有生长因子还原基底膜基质（>200μL）的微量离心管中并储存在冰上。</li>
		<li>根据步骤1.3中描述的方案冷冻保存未用于繁殖的剩余组织。</li>
		<li>在用2-5%异氟醚和氧气的诱导室中麻醉动物。麻醉后，将动物转移到鼻锥中，以保持麻醉在1.5-2.5%异氟醚下，并连续供氧。通过缺乏踏板反射确认麻醉深度。使用兽用眼药膏以防止手术期间眼睛干燥。在整个过程中为动物提供热支持，直到动物康复。</li>
		<li>识别鼠标上的植入部位。 注意：这应该在鼠标的右翼或左翼，通常在腹部区域，胸腔尾部。</li>
		<li>要准备手术区域，请剃除皮毛并用三种聚维酮碘和70%乙醇交替擦洗消毒。</li>
		<li>在鼠标的一侧做一个0.5-1厘米的切口。</li>
		<li>在切口处的皮肤下缓慢插入一把手术剪刀，在皮下空间形成一个口袋（0.5-1厘米深）。</li>
		<li>小心地将一块肿瘤片放入口袋中，然后将其推到口袋底部，以防止肿瘤滑出。</li>
		<li>使用4-0尼龙手术缝合线或其他伤口闭合方法关闭切口。</li>
		<li>将鼠标移回笼子并监测其从麻醉中恢复，直到它可以走动。 注意：不需要镇痛药，但如果在小鼠中观察到疼痛，则可以施用。</li>
		<li>在潜伏期（非生长期），每周监测肿瘤生长。预计每只小鼠有一个肿瘤。 注意：移植时肿瘤的体积似乎最初会减少，但这不是引起关注的原因。一旦肿瘤变得可触及并开始持续生长，就被认为是被采取的。</li>
		<li>一旦肿瘤开始生长，每周测量肿瘤三次。用卡尺测量肿瘤的长度和宽度。使用以下公式计算肿瘤的体积：长x宽x宽/ 2。</li>
		<li>当肿瘤直径大于15毫米时，使用肿瘤的最长边对植入PDX肿瘤的小鼠实施安乐死。通过在 CO2 诱导室中吸入 CO2 进行安乐死，然后作为辅助方法进行颈椎脱位。</li>
		<li>通过切开并用钝剪刀和镊子轻轻解剖肿瘤，从动物的侧面切除肿瘤。</li>
		<li>将肿瘤组织转移到 >10 mL 的合适储存溶液（如 DMEM）中，然后立即放在冰上。</li>
	</ol></li>
	<li>PDX肿瘤的冷冻保存<ol><li>当肿瘤直径大于15毫米时，使用肿瘤的最长边对植入PDX肿瘤的小鼠实施安乐死。通过在 CO2 诱导室吸入CO 2 进行安乐死，然后作为辅助方法进行颈椎脱位。</li>
		<li>通过切开并用钝剪刀和镊子轻轻解剖肿瘤，从动物的侧面切除肿瘤。</li>
		<li>将肿瘤组织转移到 >10 mL 的合适储存溶液（如 DMEM）中，然后立即放在冰上。</li>
		<li>将组织转移到组织培养皿中，并用 5 mL DPBS 冲洗。</li>
		<li>从肿瘤中去除坏死区域。</li>
		<li>将组织切成大约 2 x 2 x 2 毫米的碎片。</li>
		<li>将组织转移到含有 20% DMEM、70% FBS 和 10% DMSO 的冷冻管中。</li>
		<li>将冷冻管转移到冷冻保存容器中，并放入-80°C冰箱中。</li>
		<li>当冷冻管冷却至-80°C时，将它们转移到液氮储存中。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 临床前研究的接种途径
<ol><li>皮下侧腹植入。 注意：皮下侧腹植入术可用于方便，并有助于研究转移级联的所有步骤。<ol><li>使用生长中的 PDX 肿瘤或冷冻保存的 PDX 肿瘤进行初始侧腹植入。</li>
		<li>对于生长的PDX肿瘤，当肿瘤长度大于15毫米时，使用IACUC批准的方法对小鼠实施安乐死;切除肿瘤并将肿瘤组织转移到合适的储存溶液（如DMEM）中，并立即放在冰上。</li>
		<li>对于冷冻保存的PDX肿瘤，通过浸入37°C水浴中快速解冻冷冻保存的PDX组织。</li>
		<li>按照步骤 1.2.2-1.2.19 操作。</li>
	</ol></li>
	<li>通过颅内注射到大脑中进行原位植入。 注意：该模型可用于测试药物穿越BBB的功效并研究肿瘤定植。本节主要参考肿瘤解离试剂盒的使用（ 目录).不同的组织类型需要不同的解离方案。建议用户对方案进行测试和优化，以最大限度地提高解离效率。<ol><li>当肿瘤长度大于15毫米时，使用IACUC批准的方法对植入PDX肿瘤的小鼠实施安乐死。</li>
		<li>在生物安全柜的无菌条件下，手术切除PDX肿瘤并储存在冰上的DMEM中。</li>
		<li>按照制造商的方案将酶混合物添加到DMEM中，在适当的管中制备解离溶液。</li>
		<li>在组织培养皿中的5mL DPBS中洗涤肿瘤。</li>
		<li>从肿瘤中去除坏死区域。</li>
		<li>将肿瘤切成2-4毫米长的小块。</li>
		<li>将肿瘤碎片转移到含有酶混合物的管中。</li>
		<li>将管连接到组织解离器并运行适合组织类型的程序。请查阅制造商的实验方案，了解要运行的相应程序以及所需的解离时间。</li>
		<li>程序完成后，通过70μm细胞过滤器过滤细胞。</li>
		<li>用 20 mL DMEM 清洗细胞过滤器。</li>
		<li>将解离的细胞以300× g 离心7分钟。</li>
		<li>吸出上清液并将细胞重悬于DPBS中。</li>
		<li>计数细胞并稀释至所需浓度。</li>
		<li>根据制造商的说明设置立体定位框架，并为小鼠准备加热垫。用70%乙醇消毒所有区域。</li>
		<li>在用2-5%异氟醚和氧气的诱导室中麻醉动物。麻醉后，将动物转移到鼻锥中，以保持麻醉在1.5-2.5%异氟醚下，并连续供氧。通过缺乏踏板反射确认麻醉深度。使用兽用眼药膏以防止手术期间眼睛干燥。在整个过程中为动物提供热支持，直到动物康复。</li>
		<li>通过剃掉鼠标头上的皮毛以露出头皮来准备手术区域。</li>
		<li>为小鼠提供适当的镇痛药，例如通过皮下注射给药一剂1mg / kg丁丙诺啡缓释（SR）。</li>
		<li>将鼠标转移到立体定位框架。确保鼠标咬在咬块上。使用耳杆牢固地固定鼠标头。 注意：如果用镊子轻轻按压头部时不移动，则鼠标已正确固定。</li>
		<li>用三个交替的聚维酮碘和70%乙醇擦洗剃光的区域消毒。</li>
		<li>在头皮上做一个5-7毫米的纵向切口，露出头骨并收回头皮。</li>
		<li>用钝性手术器械（如镊子）刮掉骨膜。</li>
		<li>在头骨上找到前膛。</li>
		<li>将立体定向框架的针放在前膛顶部，并将坐标重置为 0 或注意手臂上的坐标。</li>
		<li>将手臂向后（尾部）移动 1 毫米，向中线右侧横向移动 1 毫米。</li>
		<li>用永久标记标记此位置。如果手臂包含注射器插槽，请在注射器插槽上安装记号笔以标记位置。</li>
		<li>在这个位置的头骨上钻一个小毛刺孔。不要施加太大的压力以防止钻入大脑。</li>
		<li>用5-10 x 104 细胞加载5 μL，26 G Hamilton注射器，体积为1-2μL，并连接到立体定位臂。</li>
		<li>慢慢地将汉密尔顿注射器针头插入大脑2毫米。</li>
		<li>以所需的速率开始注射细胞，通常为 0.2-0.5 μL/min。</li>
		<li>注射完成后，慢慢将针头从大脑中收回。</li>
		<li>用骨蜡填充毛刺孔。</li>
		<li>用手术缝合线或手术胶关闭切口。</li>
		<li>将鼠标移回笼子并监测其从麻醉中恢复。</li>
		<li>定期监测动物的状况，并在达到批准的方案中的人道终点标准时对它们实施安乐死。 注意：大脑中成功的肿瘤生长会导致动物的状况恶化，这通常表现为头部倾斜，粗糙的毛发，驼背的身体，眯眼，活动减少和低身体状况评分（BCS < 2）。</li>
		<li>对安乐死的动物进行尸检，然后进行组织学分析以确认大脑中是否存在肿瘤。记录从植入到安乐死所需的时间长度。</li>
	</ol></li>
	<li>通过心内注射植入PDX模型 注意：一旦肿瘤细胞处于循环状态，该模型可用于研究器官嗜性。该部分还使用肿瘤解离试剂盒，需要按组织类型进行优化。<ol><li>按照步骤 2.2.1-2.2.13 操作。</li>
		<li>在用2-5%异氟醚和氧气的诱导室中麻醉动物。麻醉后，将动物转移到鼻锥中，以保持麻醉在1.5-2.5%异氟醚下，并连续供氧。通过缺乏踏板反射确认麻醉深度。使用兽用眼药膏以防止手术期间眼睛干燥。在整个过程中为动物提供热支持，直到动物康复。</li>
		<li>然后，将鼠标置于仰卧位置。</li>
		<li>要准备胸部的手术区域，请剃除皮毛并用三种聚维酮碘和70%乙醇交替擦洗进行消毒。</li>
		<li>将0.5-10 x 105 个细胞吸入28 G针头上的注射器中，体积最大为100μL。 注意：所需的细胞数量因模型的侵袭性而异，应根据经验确定每个模型的最佳细胞数。</li>
		<li>找到注射部位（小鼠胸骨稍左，胸骨切口和木突之间）。</li>
		<li>在注射部位将针头垂直插入小鼠中。</li>
		<li>观察通过进入注射器的血液回流成功进入左心室。在不移动针头的情况下缓慢将细胞分配到左心室。</li>
		<li>慢慢地将针从鼠标垂直拉出。</li>
		<li>在注射部位涂上一块无菌纱布，施加压力约1分钟，直到出血停止，同时仍然允许胸部运动进行呼吸。</li>
		<li>将鼠标从麻醉中取出，让它在加热垫上恢复。 注意：成功的肿瘤生长会导致动物状况恶化，通常表现为皱褶毛，驼背身体，眯眼，活动减少和身体状况评分低（BCS < 2）。</li>
		<li>定期监测动物的状况，并在达到批准的方案中的人道终点标准时对它们实施安乐死。</li>
		<li>进行尸检以识别安乐死动物的转移，然后进行组织学分析以确认靶器官中是否存在肿瘤。记录从心内注射到安乐死所需的时间长度。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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作者没有披露。

在目前的手稿中，已经详细介绍了PDX建立和传播的方法。在评估中枢神经系统转移时，还证明了可用于建立临床前研究的三种不同的接种方法。选择的方法应取决于实验的目标。在某些情况下，使用一种以上的接种途径将是有益的。例如，皮下侧腹植入提供了一种简单的方法来研究药物对肿瘤生长的有效性并评估药物在其靶标上的有效性，它还提供了易于监测和测量的肿瘤大小的视觉效果。然而，一旦确定了靶点可行性和抗肿瘤生长特性，就可以建立一个原位研究来评估生物制品穿越BBB的功效，并研究其在脑肿瘤微环境中的作用。此外，在原位和心内注射研究中可以更好地评估生存率。
由于存在脑微环境和BBB，脑转移PDX模型的颅内注射通常是临床前的首选模型。然而，研究表明，脑转移瘤具有修饰BBB的能力，BBB会影响分子对肿瘤的渗透性16。BBB的这些变化不会反映在颅内植入的肿瘤中，并且由于这种临床前药物研究可能无法完全反映患者肿瘤的反应。即使有这个警告，颅内注射仍然是测试药物在临床前模型中穿过BBB的渗透性和有效性的最佳方法。颅内模型的另一个挑战是它们难以监测肿瘤生长，需要使用成像技术。传统上一直使用荧光或生物发光标记物对PDX进行病毒转导，但执行起来可能具有挑战性。然而，正在开发几种成像技术用于不需要引入标记物的小鼠，这可以提高监测这些原位脑肿瘤以进行临床前研究的便利性。其中包括磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描（PET）成像以及微型计算机断层扫描（micro-CT）等成像技术。最后，颅内注射可能无法准确反映脑外中枢神经系统转移的微环境，例如软脑膜转移。在这种情况下，可以向大池注射以更准确地表示软脑膜转移17。
表征PDX模型的表型和分子特征对于选择临床前研究的最佳模型非常重要。肿瘤潜伏期范围为 7-140 天，服用率也可能变化很大12.植入的最佳动物数量和开始治疗的时间必须基于每个PDX模型的特征，并且需要根据经验确定。此外，PDX肿瘤的分子谱对于选择最具代表性的PDX模型进行临床前研究也很重要。模型在分子上越接近地代表供体组织，就越有可能预测临床反应。此外，确保从人类数据中选择的靶标存在于被选择用于研究的PDX中并持续几代至关重要，因为显示克隆继承与现有显性克隆的不同基因组图谱相关。有鉴于此，中枢神经系统转移PDX肿瘤的表型和分子谱已在多代中进行了广泛的表征12。
尽管使用CNS转移PDX模型具有许多优点，但其使用仍存在一些限制。首先，替代肿瘤微环境，特别是缺乏免疫系统是PDX模型18的局限性。将人肿瘤异种移植到小鼠体内导致在随后的每次传代中用小鼠基质替换人基质，并且人类基质通常在几次传代后完全取代19。然而，与原始患者肿瘤12相比，肿瘤微环境的差异并未导致侧腹植入PDX肿瘤的分子谱存在较大差异，这表明侧翼模型仍然是研究CNS转移的良好实验模型。其次，使用免疫功能低下的动物导致肿瘤中缺乏免疫细胞浸润和宿主的一般免疫反应，限制了宿主试图对抗癌症生长的基本方式12。虽然移植了人类免疫细胞的人源化小鼠可用于研究特定免疫细胞与肿瘤的相互作用，但关于这些结果的方法，方法和解释仍然存在许多问题和争议20。
虽然大多数PDX已被证明在遗传上是稳定的，但我们和其他人已经表明，在极少数情况下，即使没有治疗或其他外部选择压力，肿瘤的克隆也可能发生变化，例如次要克隆接管12，14，15。这可能导致分子谱发生巨大变化，最终使肿瘤不能反映患者肿瘤中的优势克隆12。虽然显示克隆演替的PDX可用于临床前研究，但许多用于靶向的基因（例如Her2）可能会随着克隆演替而丢失。因此，鼓励经常筛选PDX模型，以确定它们是否仍保持所需克隆的分子谱。
总之，PDX模型代表了一个优秀的模型系统，不仅可以研究CNS转移，还可以研究其他肿瘤类型。开发这些模型表明，它们在很大程度上反映了人类中枢神经系统转移的表型、分子谱和异质性8，9，10，12。它们是研究中枢神经系统转移生物学的有效模型，也可以作为生理相关的临床前模型，取代历史上用于中枢神经系统转移体内研究的过度使用的细胞系模型。毫无疑问，PDX和供体患者肿瘤之间存在差异12，18。了解这些差异对于正确规划和执行临床前研究非常重要。最后，通过在几种接种途径之间进行选择，PDX模型在使用中用途广泛，可以研究疾病的多个方面。PDXs模型无疑将在促进我们对CNS转移的理解和新疗法的开发方面发挥重要作用。

近年来，中枢神经系统（CNS）转移的发生率有所增加1，2，3。中枢神经系统转移的传统疗法，如肿瘤切除术、全脑放疗和立体定向放射外科手术，基本上是姑息性的，很少治愈，并可能导致使人衰弱的副作用，如认知能力恶化1。最近，正在开发许多新的靶向和免疫疗法来治疗中枢神经系统转移，这些疗法有望成为更有效的治疗方法，同时副作用更少4。
将临床前结果转化为有意义的临床终点通常需要有效的预测建模策略。从历史上看，细胞系异种移植模型是中枢神经系统转移研究中临床前研究的标准。然而，这些细胞系模型并不能反映宿主肿瘤的真实肿瘤行为，也不能代表疾病的组织学或分子异质性。此外，细胞系模型能够适应 体外 生长条件，因此失去了宿主肿瘤的原始特性。患者来源的异种移植物（PDXs）将患者的肿瘤移植到免疫缺陷或人源化小鼠中，越来越多地用于转化癌症研究。研究人员已经表明，PDX模型通常可以忠实地概括肿瘤生长，组织学特征，维持肿瘤异质性，转移潜力和分子遗传特征。此外，PDX模型具有预后性，其中PDX肿瘤潜伏期与患者总生存期相关，并且在患者试验中还被证明可以准确预测治疗反应5，6。
已经出现了中枢神经系统转移PDX。 大多数情况下，这些已经开发代表起源于单一来源的肿瘤，例如非小细胞肺癌（NSCLC）7，乳腺癌8，9和黑色素瘤10，11。最近，已经开发和表征了大量多样化的PDX模型，代表了八种不同的组织学亚型12。已经证明，用于CNS转移的PDX模型在组织学和分子上都与原始患者肿瘤非常相似，并且还显示出组织学上独特的差异和相似之处10，12。此外，虽然大多数CNS转移PDX模型保持了人类肿瘤的克隆异质性，但一些模型显示出克隆演替的证据12，这使得它们也是通过监测治疗后的克隆变化来研究治疗耐药性的理想选择。
这里描述的方案概述了PDX建立的方法和CNS转移临床前研究中使用的各种接种途径（图1）。这些植入方法在模仿生长和转移的能力方面各不相同。在这里，该协议强调了每种植入途径的应用，并展示了它们如何用于中枢神经系统转移的研究。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470106-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>W31G-RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIEA NOG mouse</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>NOG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethiqa XR (buprenorphine SR)</td>
			<td>MWI</td>
			<td>072117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tube</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>PH-PURALUBE-VET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/DPBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine swabs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15648-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drill</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical glue</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>VG3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sutures</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>MMV-661-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53548-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor dissociation kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the establishment and utilization of patient derived xenograft models of central nervous system metastasis

由于缺乏准确代表该疾病的临床前模型，中枢神经系统（CNS）转移的新疗法的开发受到阻碍。与历史细胞系模型相比，CNS转移的患者来源异种移植（PDX）模型已被证明可以更好地代表人类疾病的表型和分子特征，并更好地反映人类患者肿瘤的异质性和克隆动力学。在建立临床前试验时，有多个位点可用于植入患者来源的组织，每个位点都有自己的优点和缺点，并且每个位点都适合研究转移级联反应的不同方面。在这里，该协议描述了如何建立PDX模型，并提出了在临床前研究中利用CNS转移PDX模型的三种不同方法，讨论了它们的每个应用和局限性。这些包括侧腹植入、脑原位注射和心内注射。皮下侧腹植入最容易监测，因此最方便临床前研究。此外，观察到侧腹植入向脑和其他组织的转移，表明肿瘤经历了多个转移步骤，包括内渗、外渗和定植。脑中原位注射是重现脑肿瘤微环境的最佳选择，可用于确定生物制剂穿过血脑屏障（BBB）的功效，但绕过了转移级联反应的大多数步骤。心内注射有助于向大脑转移，也可用于研究器官嗜性。虽然这种方法放弃了转移级联的早期步骤，但这些细胞仍然必须在循环中存活、外渗和定植。因此，PDX模型的效用受到肿瘤接种途径的影响，选择使用哪种模型应由科学问题和实验的总体目标决定。

侧腹增殖的PDX肿瘤最容易植入、监测和切除，通常推荐用于PDX肿瘤的初始建立和增殖（图1）。在建立或繁殖PDX肿瘤时，谨慎的做法是在多只动物中植入肿瘤，因为肿瘤的摄取率可能会有所不同，并且并非每块肿瘤都会在小鼠中吸收。已经开发了直接在大脑中建立和传播CNS转移PDX的方法13。然而，这些方法仍然更具挑战性，取材率较低，肿瘤比侧腹植入更难繁殖和监测。
如果患者肿瘤不容易获得，也可以从各种来源获得CNS转移PDX肿瘤，包括学术实验室或商业公司的存储库。获得肿瘤后，首要任务是尽可能多地繁殖和冷冻保存物质，确保保留大量低通道肿瘤。这确保了有足够的材料可用于PDX模型的无限数量的后续研究。与永生化细胞系非常相似，PDX肿瘤应冷冻保存并以低传代数使用，因为遗传漂移会导致PDX的表型和基因型随时间的变化12，14，15。无论PDX肿瘤的来源如何，重要的是频繁地对PDX和小鼠菌落进行人类和小鼠病原体的筛查，例如人类的HIV和肝炎以及小鼠的牛棒状杆菌。这将限制不需要的病原体从PDX传播到处理它们的个体以及研究中的其他小鼠和动物饲养室。
这里描述的植入方法可用于研究肿瘤生物学，评估转移级联反应的多个方面，以及用于临床前研究。侧腹植入的主要优点是易于随着时间的推移监测肿瘤，因为肿瘤是可见的，并且可以使用卡尺轻松测量其生长。这种方法可以成为确定药物靶点可行性的良好起点。如果脑微环境的存在很重要并且可能改变肿瘤的生长或分子谱，则首选颅内植入。此外，颅内植入将肿瘤置于血脑屏障（BBB）后面，因此对于检查穿越BBB所需药物的疗效的临床前研究至关重要。然而，很难监测PDX肿瘤的生长，如果细胞被标记，则需要放射成像或生物发光成像。知道何时在临床前开始药物治疗将需要成像数据来监测生长或了解携带特定PDX肿瘤的小鼠的平均生存率。此外，颅内植入绕过了转移级联的所有基本步骤，使其仅适用于研究药物疗效和脑内肿瘤微环境。尽管肿瘤微环境存在差异，但无论植入部位如何，PDX肿瘤的形态都是相似的，这可以从源自小细胞肺癌原发肿瘤的脑转移的PDX肿瘤（CM04）中看到（图2）。在心内注射引起的侧腹肿瘤、颅内肿瘤和腹部转移中，可以观察到小细胞核和细胞质稀少的肿瘤细胞的小细胞肺癌形态。此外，先前已经观察到植入侧腹的肿瘤的自发转移12，这表明可以在侧腹肿瘤中重现和研究诸如内渗，外渗和定植等转移过程，否则无法在脑中的原位肿瘤中实现。一般来说，观察到侧腹植入是研究CNS转移生物学和进行临床前研究的合适方法。
心内注射最常用于研究肿瘤的器官嗜性和转移潜力。注射的肿瘤细胞必须经历转移级联的几个步骤，包括存活的循环、外渗和转移部位的定植。就像原位注射到大脑中一样，如果没有放射成像或细胞标记，可能很难跟踪肿瘤转移的进展。然而，与原位植入一样，随着肿瘤扩散，成功的接种会导致动物的状况随着时间的推移而恶化。 图3A 显示了中枢神经系统转移PDX模型M2的心内注射后向大脑转移，该模型起源于黑色素瘤。心内注射PDX肿瘤（CM04）导致腹腔和肝脏转移（图3B）。评估的其他器官，如肺、肾和卵巢，没有明显的转移。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig01.jpg"> 图 1：流程图显示了建立、传播和使用 PDX 进行临床前研究的一般工作流程。对于每种接种方法，每种方法下方列出了所涉及的转移级联的步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig02.jpg"> 图2：采用不同接种方法的PDX肿瘤的组织学。 苏木精和伊红（H&E）染色起源于小细胞肺癌（CM04）的CNS转移PDX肿瘤通过三种方法植入免疫功能低下的小鼠，具有与小细胞肺癌相似的肿瘤病理学和形态学特征，具有小细胞核和稀少的细胞质。心内注射面板显示腹部转移。小尺寸细胞的巢穴和高核质比在所有三个图像中都很明显。图像在玻片扫描仪上拍摄并放大至10倍。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig03.jpg"> 图3：心内注射后观察到的转移。 在心内注射（A）M2和（B）CM04后通过尸检评估期间对具有可见转移的组织进行H&E染色。在载玻片扫描仪上（A）拍摄图像，并在常规显微镜上以10倍放大倍率放大至1倍（左）或20倍（右）或（B）。这个数字是从我们之前的出版物12修改的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

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The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

中枢神经系统转移PDX模型代表了人类转移的表型和分子特征，使其成为临床前研究的优秀模型。这里介绍如何建立PDX模型和最适合临床前研究的接种途径。

患者衍生的中枢神经系统转移异种移植模型的建立与利用

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

由于缺乏良好的临床前模型，中枢神经系统转移的新疗法的开发受到阻碍。我们的患者来源的异种移植模型比历史上使用的细胞系模型更好地概括了CNS转移。通过利用不同的肿瘤接种途径，您可以研究转移级联反应的不同方面。每条路线都有可用于学习的优势。演示该程序的将是我实验室的博士后Ben Yi Tew。对于冷冻保存的PDX肿瘤的皮下侧腹植入，在37摄氏度的水浴中快速解冻冷冻保存的肿瘤组织。然后，在组织培养皿中用五毫升DPBS冲洗。接下来，在确认三到八周大的雌性NOG小鼠的麻醉后，在左翼或右翼做一个0.5到1厘米的切口，并将一块2x2x2毫米的肿瘤组织深深地插入口袋中。关闭切口后，让小鼠通过监测从麻醉中恢复，直到它可以走动。一旦肿瘤开始生长，每周用卡尺测量肿瘤三次。在适当的实验终点，通过尸检识别转移，并通过组织学分析确认靶器官内是否存在肿瘤。将切除的PDX肿瘤放在冰上的DMEM中。在组织培养皿中用五毫升DPBS洗涤肿瘤，并去除坏死区域（如果有）。将肿瘤切成两到四毫米长的小块，并将碎片转移到含有解离溶液的管中。在解离器上使用适当的程序，机械地解离组织并通过70微米的细胞过滤器过滤所得的细胞悬液。使用20毫升DMEM从过滤器中洗涤任何剩余的细胞，并离心解离的细胞悬液。然后，重悬细胞和DPBS进行计数，并将细胞浓度调整至每1至2微升DPBS的5至10乘以10至第四个细胞。要准备手术区域，请剃掉鼠标头上的皮毛以露出头皮。然后，将鼠标放入立体定位框架中，使用耳杆牢固地固定鼠标头部。确保还使用适当的镇痛药。用三种聚维酮碘和70%乙醇交替擦洗的头皮消毒。做一个五到七毫米的纵向切口，露出头骨并回缩头皮。用镊子刮掉骨膜以定位前膛。将立体定向框架的针定位在前膛顶部并将坐标重置为零。将手臂向后移动一毫米，向中线右侧横向移动一毫米，并用永久性标记标记此位置。然后，在标记位置的头骨上钻一个小毛刺孔，注意不要钻入大脑。装入带有一到两微升细胞的五微升 26 号汉密尔顿注射器，并将注射器连接到立体定位臂。慢慢将针头插入大脑两毫米，然后以所需的速率开始注射细胞。当所有细胞都已交付后，慢慢收回针头，用骨蜡填充毛刺孔，然后关闭切口。将鼠标放回笼子中，进行监测，直到从麻醉中恢复。在适当的实验终点对动物实施安乐死后，通过组织学分析确认大脑中存在肿瘤。为了通过心内注射植入PDX肿瘤，如图所示制备肿瘤细胞并将麻醉的受体小鼠置于仰卧位。剃掉动物胸部的皮毛，并用聚维酮碘和70%乙醇对暴露的皮肤进行消毒。将0.5至10乘以10至第五个肿瘤细胞和多达100微升DPBS吸入配备有28号针头的注射器中。将注射部位定位在胸骨切口和剑突之间的胸骨稍左。然后，将针头垂直插入注射部位的小鼠中。一旦观察到回流，表明针头成功进入左心室，缓慢地将肿瘤悬液分配到左心室而不移动针头。当所有细胞都已交付后，缓慢垂直地缩回针头，并在注射部位涂上一块无菌纱布约一分钟，直到出血停止。让鼠标在加热垫上恢复，直到它可以移动。在适当的实验终点，通过尸检识别转移，并通过组织学分析确认靶器官内是否存在肿瘤。尽管肿瘤微环境存在差异，但PDX肿瘤表现出相似的形态，其中包含具有小细胞核和稀少细胞质的细胞，无论植入部位如何。在该分析中，心内注射人黑色素瘤细胞导致肿瘤细胞转移到小鼠大脑，而心内注射转移人小细胞肺癌肿瘤细胞导致转移到小鼠腹腔和肝脏。这些方案能够建立临床前研究以测试新的治疗方法和治疗组合，并可以帮助研究生物过程和肿瘤转移。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

开发和维护的临床前患者来源的肿瘤异种移植模型为新的抗癌疗法的调查

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

科研

癌症研究

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

可追踪记者乳腺癌患者来源的移植瘤贴标肿瘤生长和转移的研究

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

颈动脉肿瘤细胞注射，产生脑转移瘤小鼠模型

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

病人衍生软组织肉瘤原代培养的建立

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

超声引导组织定向细胞植入术在生物学相关转移性肿瘤移植中的应用

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

患者衍生的人类泌尿细胞癌和结肠直肠癌肿瘤生长和自发转移的正交异种移植模型

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

患者衍生的胰腺癌异质异种移植模型,使用斑马鱼幼虫作为比较药物评估的宿主

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

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Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

建立胃癌患者衍生异种移植模型和原细胞系

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...