Name: the establishment and utilization of patient derived xenograft models of central nervous system metastasis
Uploaded: 2021-05-07T14:00:00
Duration: 6 min 52 s
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Abbildung 3A stammt aus unserer vorherigen Publikation12 und wurde im Labor von Dr. Jann Sarkaria an der Mayo Clinic erstellt.

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Die Autoren machen keine Angaben.

Im vorliegenden Manuskript wurden Methoden zur PDX-Etablierung und -Vermehrung detailliert beschrieben. Drei verschiedene Inokulationsmethoden, die für den Aufbau präklinischer Studien bei der Beurteilung von ZNS-Metastasen verwendet werden können, wurden ebenfalls demonstriert. Die gewählte Methode sollte von den Zielen des Experiments abhängen. In einigen Fällen wäre es von Vorteil, mehr als einen Impfweg zu verwenden. Zum Beispiel bietet die subkutane Flankenimplantation einen einfachen Ansatz, um die Wirksamkeit eines Medikaments auf das Tumorwachstum zu untersuchen und das Medikament an seinem Ziel zu beurteilen, und es bietet auch eine visuelle Darstellung der Tumorgröße, die leicht überwacht und gemessen werden kann. Sobald jedoch die Durchführbarkeit des Ziels und die Anti-Tumor-Wachstumseigenschaften etabliert sind, könnte man eine orthotopische Studie durchführen, um die Wirksamkeit des Biologikums zur Überquerung der BHS zu bewerten und seine Wirkung in der Mikroumgebung des Hirntumors zu untersuchen. Auch das Überleben wird in orthotopen und intrakardialen Injektionsstudien besser beurteilt.
Die intrakranielle Injektion von Hirnmetastasen-PDX-Modellen ist aufgrund des Vorhandenseins der Mikroumgebung des Gehirns und der BHS oft das präklinische Modell der Wahl. Studien haben jedoch gezeigt, dass Hirnmetastasen die Fähigkeit haben, die BHS zu modifizieren, was die Permeabilität von Molekülen für den Tumor beeinflusst16. Diese Veränderungen der BHS würden sich bei intrakraniell implantierten Tumoren nicht widerspiegeln, und aus diesem Grund spiegeln präklinische Arzneimittelstudien das Ansprechen von Patiententumoren möglicherweise nicht vollständig wider. Trotz dieser Einschränkung bleibt die intrakranielle Injektion die beste Methode, um die Permeabilität und Wirksamkeit von Medikamenten zur Überwindung der BHS in präklinischen Modellen zu testen. Eine weitere Herausforderung bei intrakraniellen Modellen besteht darin, dass sie schwierig zu überwachen sind und den Einsatz bildgebender Verfahren erfordern. Die virale Transduktion von PDXs mit fluoreszierenden oder biolumineszenten Markern wird traditionell verwendet, kann aber eine Herausforderung darstellen. Es werden jedoch mehrere bildgebende Verfahren für den Einsatz bei Mäusen entwickelt, die keine Marker benötigen, was die Überwachung dieser orthotopen Hirntumore für präklinische Studien erleichtern könnte. Dazu gehören bildgebende Verfahren wie die Magnetresonanztomographie (MRT) und die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) sowie die Mikro-Computertomographie (Mikro-CT). Schließlich spiegelt die intrakranielle Injektion möglicherweise nicht genau die Mikroumgebung von ZNS-Metastasen außerhalb des Gehirns wider, wie z. B. bei leptomeningealen Metastasen. In diesem Fall könnte eine Injektion in die Cisterna magna durchgeführt werden, um leptomeningeale Metastasen genauer darzustellen17.
Die Charakterisierung sowohl der phänotypischen als auch der molekularen Merkmale des PDX-Modells ist wichtig für die Auswahl der besten Modelle für präklinische Studien. Die Tumorlatenz kann zwischen 7 und 140 Tagen liegen und die Aufnahmeraten können ebenfalls sehr variabel sein12. Die optimale Anzahl der zu implantierenden Tiere und der Zeitpunkt bis zum Beginn der Behandlung müssten auf den Merkmalen des jeweiligen PDX-Modells basieren und empirisch bestimmt werden. Darüber hinaus ist das molekulare Profil von PDX-Tumoren auch wichtig für die Auswahl der repräsentativsten PDX-Modelle für präklinische Studien. Je näher das Modell dem Spendergewebe molekular kommt, desto prädiktiver ist es für das klinische Ansprechen. Außerdem muss sichergestellt werden, dass die aus den Humandaten ausgewählten Zielstrukturen in den PDXs, die für Studien ausgewählt werden, vorhanden sind und über einige Generationen hinweg aufrechterhalten werden, da gezeigt wurde, dass die klonale Sukzession mit einem anderen genomischen Profil des etablierten dominanten Klons verbunden ist. Vor diesem Hintergrund wurden die phänotypischen und molekularen Profile der ZNS-Metastasen-PDX-Tumoren über mehrere Generationen hinweg umfassend charakterisiert12.
Trotz der vielen Vorteile der Verwendung von PDX-Modellen für ZNS-Metastasen gibt es einige Einschränkungen im Zusammenhang mit ihrer Verwendung. Erstens sind eine alternative Tumormikroumgebung und insbesondere das Fehlen eines Immunsystems gut dokumentierte Einschränkungen von PDX-Modellen18. Das Xenotransplantat eines menschlichen Tumors in Mäuse führt bei jeder weiteren Passage dazu, dass das menschliche Stroma durch das Mausstroma ersetzt wird, und das menschliche Stroma wird in der Regel nach mehreren Passagen vollständig ersetzt19. Die Unterschiede in der Tumormikroumgebung führen jedoch nicht zu großen Unterschieden im molekularen Profil von flankenimplantierten PDX-Tumoren im Vergleich zum ursprünglichen Patiententumor12, was darauf hindeutet, dass Flankenmodelle immer noch gute experimentelle Modelle zur Untersuchung von ZNS-Metastasen darstellen. Zweitens führt der Einsatz von immungeschwächten Tieren zu einer fehlenden Infiltration von Immunzellen in den Tumor und zu einer allgemeinen Immunantwort des Wirts, was die grundlegende Art und Weise, wie der Wirt versucht, das Krebswachstum zu bekämpfen, einschränkt12. Während humanisierte Mäuse, die mit menschlichen Immunzellen transplantiert wurden, zur Verfügung stehen, um die Interaktionen spezifischer Immunzellen mit dem Tumor zu untersuchen, gibt es immer noch viele Fragen und Kontroversen über die Ansätze, Methoden und die Interpretation dieser Ergebnisse20.
Während sich die Mehrheit der PDXs als genetisch stabil erwiesen hat, haben wir und andere gezeigt, dass es in seltenen Fällen, auch ohne Behandlungen oder anderen externen Selektionsdruck, zu Veränderungen in den Klonen der Tumore kommen kann, wie z. B. eine geringfügige Klonübernahme12,14,15. Dies könnte zu dramatischen Veränderungen des molekularen Profils führen, die letztendlich dazu führen würden, dass der Tumor nicht mehr die dominanten Klone im Patiententumorwiderspiegelt 12. Während PDXs, die eine klonale Sukzession aufweisen, in präklinischen Studien verwendet werden können, könnten viele Gene, die für das Targeting vorgesehen sind (z. B. Her2), bei der klonalen Sukzession verloren gehen. Daher wird ein häufiges Screening von PDX-Modellen empfohlen, um festzustellen, ob sie das molekulare Profil des gewünschten Klons beibehalten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass PDX-Modelle ein hervorragendes Modellsystem darstellen, um nicht nur ZNS-Metastasen, sondern auch andere Tumorarten zu untersuchen. Die Entwicklung dieser Modelle hat gezeigt, dass sie weitgehend das phänotypische, molekulare Profil und die Heterogenität menschlicher ZNS-Metastasen widerspiegeln 8,9,10,12. Sie dienen als effektive Modelle sowohl für die Untersuchung der ZNS-Metastasierungsbiologie als auch als physiologisch relevante präklinische Modelle, indem sie überstrapazierte Zelllinienmodelle ersetzen, die in der Vergangenheit für In-vivo-Studien der ZNS-Metastasierung verwendet wurden. Zweifelsohne gibt es Unterschiede zwischen dem PDX- und dem Tumor des Spenderpatienten12,18. Zu wissen, worin diese Unterschiede bestehen, ist wichtig für die richtige Planung und Durchführung präklinischer Studien. Schließlich sind PDX-Modelle durch die Wahl zwischen mehreren Inokulationswegen vielseitig einsetzbar und ermöglichen die Untersuchung mehrerer Aspekte der Krankheit. PDX-Modelle werden zweifellos eine wichtige Rolle dabei spielen, unser Verständnis der ZNS-Metastasierung und die Entwicklung neuer Therapien zu verbessern.

Die Inzidenz von Metastasen im Zentralnervensystem (ZNS) hat in den letzten Jahren zugenommen 1,2,3. Traditionelle Therapien für ZNS-Metastasen, wie z. B. Tumorresektion, Ganzhirnstrahlentherapie und stereotaktische Radiochirurgie, sind weitgehend palliativ und selten kurativ und können zu schwächenden Nebenwirkungen wie einer kognitiven Verschlechterung führen1. In jüngster Zeit werden viele neue zielgerichtete und immunologische Therapien für die Behandlung von ZNS-Metastasen entwickelt, die vielversprechend sind, um wirksamere Behandlungen zu sein und gleichzeitig weniger Nebenwirkungen zu haben4.
Die Übersetzung präklinischer Ergebnisse in aussagekräftige klinische Endpunkte erfordert oft effektive und prädiktive Modellierungsstrategien. In der Vergangenheit waren Zelllinien-Xenograft-Modelle der Standard für die präklinische Forschung in der ZNS-Metastasenforschung. Diese Zelllinienmodelle spiegeln jedoch nicht das tatsächliche Tumorverhalten des Wirtstumors wider und repräsentieren auch nicht die histologische oder molekulare Heterogenität der Erkrankung. Darüber hinaus sind Zelllinienmodelle in der Lage, sich an In-vitro-Wachstumsbedingungen anzupassen und verlieren daher die ursprünglichen Eigenschaften des Wirtstumors. Patientenabgeleitete Xenotransplantate (PDXs), bei denen der Tumor eines Patienten in eine immundefiziente oder humanisierte Maus transplantiert wird, werden zunehmend in der translationalen Krebsforschung eingesetzt. Forscher haben gezeigt, dass PDX-Modelle in der Regel das Tumorwachstum, die histologischen Merkmale, die Aufrechterhaltung der Tumorheterogenität, des Metastasierungspotenzials und der molekulargenetischen Merkmale originalgetreu rekapitulieren können. Darüber hinaus sind PDX-Modelle prognostisch, wobei die PDX-Tumorlatenzzeit mit dem Gesamtüberleben der Patienten korreliert, und sie haben auch in Patientenstudien gezeigt, dass sie das therapeutische Ansprechen genau vorhersagenkönnen 5,6.
Es gab ein Auftreten von ZNS-Metastasen-PDXs, die meist Tumore darstellen, die aus einem einzigen Ursprung stammen, wie z. B. nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC)7, Brustkrebs8,9 und Melanom10,11. In jüngerer Zeit wurde eine große und vielfältige Sammlung von PDX-Modellen entwickelt und charakterisiert, die acht verschiedene histologische Subtypen repräsentieren12. Es konnte gezeigt werden, dass PDX-Modelle für ZNS-Metastasen sowohl histologisch als auch molekular ihrem ursprünglichen Patiententumor sehr ähnlich sind und auch histologisch einzigartige Unterschiede und Ähnlichkeiten aufweisen10,12. Während die meisten PDX-Modelle für ZNS-Metastasen die klonale Heterogenität menschlicher Tumore beibehalten, wiesen einige Hinweise auf klonale Sukzession12 auf, was sie auch ideal für die Untersuchung von Therapieresistenzen durch die Überwachung klonaler Veränderungen nach der Behandlung macht.
Die hier beschriebenen Protokolle beschreiben Methoden der PDX-Etablierung und verschiedene Inokulationswege, die in präklinischen Studien zur ZNS-Metastasierung verwendet werden (Abbildung 1). Diese Implantationsmethoden unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, Wachstum und Metastasierung nachzuahmen. Hier zeigt das Protokoll die Anwendungen für jeden Implantationsweg auf und zeigt, wie sie für die Untersuchung von ZNS-Metastasen verwendet werden könnten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470106-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>W31G-RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIEA NOG mouse</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>NOG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethiqa XR (buprenorphine SR)</td>
			<td>MWI</td>
			<td>072117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tube</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>PH-PURALUBE-VET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/DPBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine swabs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15648-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drill</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical glue</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>VG3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sutures</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>MMV-661-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53548-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor dissociation kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the establishment and utilization of patient derived xenograft models of central nervous system metastasis

Die Entwicklung neuartiger Therapien für die Metastasierung des Zentralnervensystems (ZNS) wurde durch das Fehlen präklinischer Modelle, die die Krankheit genau abbilden, behindert. Es hat sich gezeigt, dass patientenabgeleitete Xenograft-Modelle (PDX) der ZNS-Metastasierung die phänotypischen und molekularen Merkmale der menschlichen Erkrankung besser repräsentieren und die Heterogenität und klonale Dynamik menschlicher Patiententumore im Vergleich zu historischen Zelllinienmodellen besser widerspiegeln. Es gibt mehrere Stellen, die für die Implantation von patienteneigenem Gewebe verwendet werden können, wenn präklinische Studien eingerichtet werden, jede mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen und jede geeignet, um verschiedene Aspekte der metastasierten Kaskade zu untersuchen. Hier beschreibt das Protokoll, wie PDX-Modelle etabliert werden können, und stellt drei verschiedene Ansätze für die Verwendung von ZNS-Metastasen-PDX-Modellen in präklinischen Studien vor, wobei ihre Anwendungen und Einschränkungen diskutiert werden. Dazu gehören die Flankenimplantation, die orthotope Injektion in das Gehirn und die intrakardiale Injektion. Die subkutane Flankenimplantation ist am einfachsten zu überwachen und daher für präklinische Studien am geeignetsten. Darüber hinaus wurden Metastasen im Gehirn und anderen Geweben durch die Flankenimplantation beobachtet, was darauf hindeutet, dass der Tumor mehrere Metastasierungsschritte durchlaufen hat, einschließlich Intravasation, Extravasation und Kolonisierung. Die orthotope Injektion in das Gehirn ist die beste Option, um die Mikroumgebung des Hirntumors zu rekapitulieren, und ist nützlich, um die Wirksamkeit von Biologika zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu bestimmen, umgeht jedoch die meisten Schritte der metastasierten Kaskade. Die intrakardiale Injektion erleichtert die Metastasierung ins Gehirn und ist auch für die Untersuchung des Organtropismus nützlich. Während diese Methode auf frühere Schritte der metastasierten Kaskade verzichtet, müssen diese Zellen dennoch die Zirkulation überleben, extravasieren und kolonisieren. Die Nützlichkeit eines PDX-Modells wird daher von der Art der Tumorinokulation beeinflusst, und die Wahl des zu verwendenden Modells sollte von der wissenschaftlichen Fragestellung und den allgemeinen Zielen des Experiments diktiert werden.

Flankenvermehrte PDX-Tumoren sind am einfachsten zu implantieren, zu überwachen und zu resezieren und werden im Allgemeinen für die initiale Etablierung und Vermehrung von PDX-Tumoren empfohlen (Abbildung 1). Bei der Etablierung oder Vermehrung von PDX-Tumoren ist es ratsam, Tumore bei mehreren Tieren zu implantieren, da die Tumoraufnahmerate variieren kann und nicht jedes Tumorstück bei Mäusen immer vorhanden ist. Es wurden Methoden zur Etablierung und Vermehrung von ZNS-Metastasen-PDXs direkt im Gehirn entwickelt13. Diese Methoden sind jedoch mit geringeren Aufnahmeraten immer noch anspruchsvoller und die Tumore sind deutlich schwieriger zu vermehren und zu überwachen als die Flankenimplantation.
Wenn Patiententumore nicht ohne weiteres verfügbar sind, können PDX-Tumore der ZNS-Metastasierung auch aus einer Vielzahl von Quellen bezogen werden, einschließlich Repositorien akademischer Labore oder kommerzieller Unternehmen. Nach dem Erwerb der Tumore besteht die erste Priorität darin, so viel Material wie möglich zu vermehren und zu kryokonservieren, um sicherzustellen, dass eine große Anzahl von Tumoren mit niedriger Passage erhalten bleibt. Dadurch wird sichergestellt, dass genügend Material für eine unbegrenzte Anzahl von Folgestudien mit den PDX-Modellen zur Verfügung steht. Ähnlich wie immortalisierte Zelllinien sollten PDX-Tumore kryokonserviert und bei geringer Passagenzahl verwendet werden, da genetische Drift im Laufe der Zeit zu Veränderungen des Phänotyps und des Genotyps der PDXs führt12,14,15. Unabhängig von der Quelle von PDX-Tumoren ist es wichtig, PDX- und Mauskolonien häufig auf Krankheitserreger für Mensch und Maus zu untersuchen, wie z. B. HIV und Hepatitis für den Menschen und Corynebacterium bovis für Mäuse. Dadurch wird die Ausbreitung unerwünschter Krankheitserreger vom PDX sowohl auf die Person, die mit ihnen umgeht, als auch auf andere Mäuse in der Studie und im Vivarium begrenzt.
Die hier beschriebenen Implantationsmethoden können zur Untersuchung der Tumorbiologie, zur Bewertung mehrerer Aspekte der metastasierten Kaskade und für präklinische Studien verwendet werden. Der Hauptvorteil der Flankenimplantation ist die einfache Überwachung des Tumors im Laufe der Zeit, da die Tumore sichtbar sind und ihr Wachstum leicht mit einem Messschieber gemessen werden kann. Diese Methode kann ein guter Ausgangspunkt sein, um die Machbarkeit eines Wirkstoffziels zu ermitteln. Die intrakranielle Implantation wird bevorzugt, wenn das Vorhandensein der Mikroumgebung des Gehirns wichtig ist und das Wachstum oder das molekulare Profil des Tumors verändern könnte. Darüber hinaus platziert die intrakranielle Implantation den Tumor hinter der Blut-Hirn-Schranke (BHS), was sie für präklinische Studien zur Untersuchung der Wirksamkeit von Medikamenten, die für die Überwindung der BHS erforderlich sind, unerlässlich macht. Es ist jedoch schwierig, das Wachstum von PDX-Tumoren zu überwachen und erfordert eine radiologische Bildgebung oder biolumineszente Bildgebung, wenn die Zellen markiert sind. Um zu wissen, wann die medikamentöse Behandlung präklinisch beginnen muss, wären entweder Bildgebungsdaten zur Überwachung des Wachstums oder Kenntnisse über das durchschnittliche Überleben von Mäusen erforderlich, die einen bestimmten PDX-Tumor tragen. Darüber hinaus umgeht die intrakranielle Implantation alle wesentlichen Schritte der metastasierten Kaskade und eignet sich daher nur für die Untersuchung der Wirksamkeit von Medikamenten und der Mikroumgebung des Tumors im Gehirn. Trotz der Unterschiede in der Mikroumgebung des Tumors ist die Morphologie von PDX-Tumoren unabhängig von der Implantationsstelle ähnlich, wie bei diesem PDX-Tumor (CM04) zu sehen ist, der aus einer Hirnmetastase stammt, die von einem kleinzelligen Primärtumor des Lungenkarzinoms stammt (Abbildung 2). Die kleinzellige Lungenkarzinommorphologie von Tumorzellen mit kleinen Zellkernen und spärlichem Zytoplasma kann im Flankentumor, im intrakraniellen Tumor und in abdominalen Metastasen infolge intrakardialer Injektion beobachtet werden. Darüber hinaus wurden bereits spontane Metastasen von Tumoren, die in die Flanke implantiert wurden, beobachtet12, was darauf hindeutet, dass die metastasierten Prozesse wie Intravasation, Extravasation und Kolonisation rekapituliert und in Flankentumoren untersucht werden können, was sonst mit orthotopen Tumoren im Gehirn nicht möglich wäre. Generell wird beobachtet, dass die Flankenimplantation eine geeignete Methode ist, um die Biologie der ZNS-Metastasierung zu untersuchen und präklinische Studien durchzuführen.
Die intrakardiale Injektion wird am häufigsten verwendet, um den Organtropismus und das Metastasierungspotenzial von Tumoren zu untersuchen. Injizierte Tumorzellen müssten mehrere Schritte der metastatischen Kaskade durchlaufen, einschließlich des Überlebens der Zirkulation, der Extravasation und der Kolonisierung der metastasierten Stelle. Ähnlich wie bei der orthotopen Injektion in das Gehirn kann es schwierig sein, das Fortschreiten der Tumormetastasierung ohne radiologische Bildgebung oder Zellmarkierung zu verfolgen. Wie bei der orthotopen Implantation führt eine erfolgreiche Inokulation jedoch zu einer Verschlechterung des Zustands der Tiere im Laufe der Zeit, wenn sich der Tumor ausbreitet. Abbildung 3A zeigt die Metastasierung des Gehirns nach intrakardialer Injektion im ZNS-Metastasen-PDX-Modell M2, das von einem Melanom stammt. Die intrakardiale Injektion des PDX-Tumors (CM04) führte zu Metastasen in die Bauchhöhle und die Leber (Abbildung 3B). Andere untersuchte Organe wie Lunge, Niere und Eierstöcke wiesen keine sichtbaren Metastasen auf.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig01.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm, das den allgemeinen Arbeitsablauf bei der Einrichtung, Verbreitung und Verwendung von PDX für präklinische Studien zeigt. Für jede Inokulationsmethode sind die Schritte der beteiligten metastasierten Kaskade unter jeder Methode aufgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig02.jpg"> Abbildung 2: Histologie von PDX-Tumoren nach verschiedenen Inokulationsmethoden. Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) eines ZNS-Metastasen-PDX-Tumors, der von einem kleinzelligen Lungenkrebs (CM04) stammt, der immungeschwächten Mäusen mit den drei Methoden implantiert wurde, weist ähnliche tumorpathohistologische und morphologische Merkmale wie kleinzellige Lungenkarzinome auf, mit kleinen Kernen und spärlichem Zytoplasma. Das intrakardiale Injektionspanel zeigt eine abdominale Metastasierung. Nester aus kleinen Zellen und ein hohes Verhältnis von Kern zu Zytoplasma sind in allen drei Bildern zu erkennen. Die Bilder wurden mit einem Diascanner aufgenommen und auf das 10-fache vergrößert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig03.jpg"> Abbildung 3: Metastasen nach intrakardialer Injektion. H&E-Färbung von Geweben mit sichtbarer Metastasierung während der Beurteilung durch Sektion nach intrakardialer Injektion von (A) M2 und (B) CM04. Die Bilder wurden (A) auf einem Objektträgerscanner aufgenommen und auf einem normalen Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung auf 1-fach (links) oder 20-fach (rechts) oder (B) vergrößert. Diese Abbildung wurde gegenüber unserer vorherigen Veröffentlichung12 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Metastasierung des Zentralnervensystems PDX-Modelle repräsentieren die phänotypischen und molekularen Merkmale der humanen Metastasierung und sind damit hervorragende Modelle für präklinische Studien. Hier wird beschrieben, wie PDX-Modelle erstellt werden und welche Inokulationswege am besten für präklinische Studien verwendet werden.

Die Etablierung und Nutzung von patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen der Metastasierung des Zentralnervensystems

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Die Entwicklung neuartiger Therapien für ZNS-Metastasen wurde durch den Mangel an guten präklinischen Modellen behindert. Unsere patientenabgeleiteten Xenograft-Modelle rekapitulieren ZNS-Metastasen besser als historisch verwendete Zelllinienmodelle. Durch die Verwendung verschiedener Wege der Tumorinokulation können Sie verschiedene Aspekte der metastasierten Kaskade untersuchen.Jede Route hat Vorteile, die Sie für Ihr Studium nutzen können. Das Verfahren wird von Ben Yi Tew, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Für die subkutane Flankenimplantation von kryokonservierten PDX-Tumoren wird das kryokonservierte Tumorgewebe in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad schnell aufgetaut.Spülen Sie es dann in fünf Millilitern DPBS in einer Gewebekulturschale ab. Nachdem Sie die Anästhesie bei einer drei bis acht Wochen alten weiblichen NOG-Maus bestätigt haben, machen Sie einen 0,5 bis einen Zentimeter großen Schnitt entweder an der linken oder rechten Flanke und führen Sie ein 2 x 2 x 2 Millimeter großes Stück des Tumorgewebes tief in die Tasche ein. Lassen Sie die Maus nach dem Schließen des Schnitts von der Narkose unter Überwachung erholen, bis sie gehfähig ist.Sobald der Tumor zu wachsen beginnt, messen Sie den Tumor dreimal pro Woche mit einem Messschieber. Am entsprechenden experimentellen Endpunkt Metastasen durch eine Nekropsie identifizieren und das Vorhandensein von Tumoren im Zielorgan durch eine histologische Analyse bestätigen. Legen Sie den resezierten PDX-Tumor in DMEM auf Eis.Waschen Sie den Tumor in fünf Millilitern DPBS in einer Gewebekulturschale und entfernen Sie die nekrotischen Regionen, falls vorhanden. Schneiden Sie den Tumor in kleine Stücke von zwei bis vier Millimetern Länge und geben Sie die Stücke in ein Röhrchen mit Dissoziationslösung. Mit dem entsprechenden Programm auf einem Dissoziator das Gewebe mechanisch dissoziieren und die resultierende Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb abseihen.Verwenden Sie 20 Milliliter DMEM, um die verbleibenden Zellen aus dem Sieb zu waschen und die dissoziierte Zellsuspension zu zentrifugieren. Dann resuspendieren Sie die Zellen und DPBS zum Zählen und stellen Sie die Zellen auf eine Konzentration von fünf bis 10 mal 10 bis vierten Zellen pro ein bis zwei Mikroliter DPBS ein. Um den Operationsbereich vorzubereiten, rasieren Sie das Fell auf dem Kopf der Maus, um die Kopfhaut freizulegen.Platzieren Sie dann die Maus in einem stereotaktischen Rahmen und befestigen Sie den Kopf der Maus mit Ohrbügeln. Stellen Sie sicher, dass Sie auch ein geeignetes Analgetikum verabreichen. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei abwechselnden Peelings aus Povidon-Jod und 70%igem Ethanol.Machen Sie einen fünf bis sieben Millimeter langen Längsschnitt, um den Schädel freizulegen und die Kopfhaut zurückzuziehen. Kratzen Sie die Knochenhaut mit einer Pinzette ab, um das Bregma zu lokalisieren. Positionieren Sie die Nadel des stereotaktischen Rahmens auf dem Bregma und setzen Sie die Koordinaten auf Null zurück.Bewegen Sie den Arm einen Millimeter nach hinten und einen Millimeter seitlich nach rechts von der Mittellinie und markieren Sie diese Stelle mit einem Permanentmarker. Bohren Sie dann an der markierten Stelle ein kleines Bohrloch in den Schädel und achten Sie darauf, nicht in das Gehirn zu bohren. Laden Sie fünf Mikroliter 26-Gauge-Hamilton-Spritze mit ein bis zwei Mikrolitern Zellen und befestigen Sie die Spritze am stereotaktischen Arm.Führen Sie die Nadel langsam zwei Millimeter in das Gehirn ein und beginnen Sie, Zellen mit der gewünschten Geschwindigkeit zu injizieren. Wenn alle Zellen abgegeben wurden, ziehen Sie die Nadel langsam zurück, füllen Sie das Bohrloch mit Knochenwachs und schließen Sie den Einschnitt. Setzen Sie die Maus zurück in ihren Käfig und überwachen Sie, bis sie sich von der Narkose erholt hat.Nachdem das Tier am entsprechenden experimentellen Endpunkt eingeschläfert wurde, wird das Vorhandensein von Tumoren im Gehirn durch eine histologische Analyse bestätigt. Um PDX-Tumore durch intrakardiale Injektion zu implantieren, bereiten Sie die Tumorzellen wie gezeigt vor und platzieren Sie die anästhesierte Empfängermaus in Rückenlage. Rasieren Sie das Fell auf der Brust des Tieres und desinfizieren Sie die freiliegende Haut mit Povidon-Jod und 70%igem Ethanol.Ziehen Sie 0,5 bis 10 mal 10 bis fünfte Tumorzellen und bis zu 100 Mikroliter DPBS in eine Spritze, die mit einer 28-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Lokalisieren Sie die Injektionsstelle etwas links vom Brustbein auf halbem Weg zwischen der sternalen Kerbe und dem Processus xiphoideus. Führen Sie dann die Nadel an der Injektionsstelle senkrecht in die Maus ein.Sobald ein Rückfluss beobachtet wird, der auf ein erfolgreiches Eindringen der Nadel in die linke Herzkammer hinweist, dosieren Sie die Tumorsuspension langsam in die linke Herzkammer, ohne die Nadel zu bewegen. Wenn alle Zellen abgegeben wurden, ziehen Sie die Nadel langsam und vertikal zurück und tragen Sie etwa eine Minute lang ein Stück sterile Gaze auf die Injektionsstelle auf, bis die Blutung aufhört. Lassen Sie die Maus auf einem beheizten Pad mit Überwachung erholen, bis sie gehfähig ist.Am entsprechenden experimentellen Endpunkt Metastasen durch eine Nekropsie identifizieren und das Vorhandensein von Tumoren im Zielorgan durch eine histologische Analyse bestätigen. Trotz Unterschieden in der Mikroumgebung des Tumors zeigen die PDX-Tumoren ähnliche Morphologien mit Zellen mit kleinen Zellkernen und spärlichem Zytoplasma, unabhängig vom Ort der Implantation. In dieser Analyse führte die intrakardiale Injektion von humanen Melanomzellen zu Metastasen der Tumorzellen in das Mäusegehirn, während die intrakardiale Injektion von hirnmetastasierenden humanen kleinzelligen Lungenkrebstumorzellen zu Metastasen in die Bauchhöhle und Leber der Maus führte.Diese Protokolle ermöglichen die Einrichtung präklinischer Studien zur Erprobung neuer Behandlungen und Behandlungskombinationen und können bei der Untersuchung biologischer Prozesse und der Metastasierung von Tumoren helfen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Entwicklung und Wartung eines Präklinische Patienten gewonnen Tumorxenotransplantates Modell für die Untersuchung von neuartigen Anti-Krebs-Therapien

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Forschung

Krebsforschung

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Intracarotid Cancer Cell Injection zu produzieren Mausmodelle von Hirnmetastase

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Einrichtung einer primären Kultur des Patienten abgeleitet Weichteilsarkomen

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Nutzung von Ultraschall geführte Gewebe gerichtet zellulären Implantation für die Einrichtung der biologisch relevanten metastasiertem Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Patientenabgeleitete orthotopische Xenograft-Modelle für humanes Urotheliale Zellkarzinom und Kolorektalkrebs-Tumorwachstum und spontane Metastasierung

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Ein melanompatientenabgeleitetes Xenograft-Modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...