Name: the establishment and utilization of patient derived xenograft models of central nervous system metastasis
Uploaded: 2021-05-07T14:00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis at JoVE.com

איור 3A נלקח מהפרסום הקודם שלנו12 ונוצר במעבדה של ד"ר יאן סרקריה במאיו קליניק.

<ol>
	<li>Cruz-Munoz, W., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+approaches+to+study+the+biology+and+treatment+of+brain+metastases.">Preclinical approaches to study the biology and treatment of brain metastases.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (2), 123-130 (2011).</li><li>Owonikoko, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+approaches+to+the+treatment+of+metastatic+brain+tumours.">Current approaches to the treatment of metastatic brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 11 (4), 203-222 (2014).</li><li>Salhia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+and+epigenomic+analysis+of+breast+cancer+brain+metastasis.">Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis.</a> PLoS One. 9 (1), 85448 (2014).</li><li>Kotecha, R., Gondi, V., Ahluwalia, M. S., Brastianos, P. K., Mehta, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+managing+brain+metastasis.">Recent advances in managing brain metastasis.</a> F1000Research. 7, 1000 (2018).</li><li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li><li>Klinghammer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensively+characterized+large+panel+of+head+and+neck+cancer+patient-derived+xenografts+identifies+the+mTOR+inhibitor+everolimus+as+potential+new+treatment+option.">A comprehensively characterized large panel of head and neck cancer patient-derived xenografts identifies the mTOR inhibitor everolimus as potential new treatment option.</a> International Journal of Cancer. 136 (12), 2940-2948 (2015).</li><li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenografts+from+non-small+cell+lung+cancer+brain+metastases+are+valuable+translational+platforms+for+the+development+of+personalized+targeted+therapy.">Patient-derived xenografts from non-small cell lung cancer brain metastases are valuable translational platforms for the development of personalized targeted therapy.</a> Clincal Cancer Research: An Official journal of the American Association of Cancer Research. 21 (5), 1172-1182 (2015).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+inhibition+of+PI3K+and+mTORC1+yields+durable+remissions+in+mice+bearing+orthotopic+patient-derived+xenografts+of+HER2-positive+breast+cancer+brain+metastases.">Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases.</a> Nature Medicine. 22 (7), 723-726 (2016).</li><li>Oshi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+breast+cancer+brain+metastasis+patient-derived+orthotopic+xenograft+model+for+preclinical+studies.">Novel breast cancer brain metastasis patient-derived orthotopic xenograft model for preclinical studies.</a> Cancers (Basel). 12 (2), 444 (2020).</li><li>Garman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+genomic+characterization+of+462+melanoma+patient-derived+xenografts,+tumor+biopsies,+and+cell+lines.">Genetic and genomic characterization of 462 melanoma patient-derived xenografts, tumor biopsies, and cell lines.</a> Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).</li><li>Krepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+patient-derived+xenograft+collection+representing+the+heterogeneity+of+melanoma.">A comprehensive patient-derived xenograft collection representing the heterogeneity of melanoma.</a> Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).</li><li>Tew, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenografts+of+central+nervous+system+metastasis+reveal+expansion+of+aggressive+minor+clones.">Patient-derived xenografts of central nervous system metastasis reveal expansion of aggressive minor clones.</a> Neuro-Oncology. 22 (1), 70-83 (2020).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+orthotopic+mouse+models+of+patient-derived+breast+cancer+brain+metastases+by+a+modified+intracarotid+injection+method.">Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method.</a> Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).</li><li>Davies, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+clonal+cytogenetic+architecture+during+progression+of+chronic+lymphocytic+leukemia+in+patients+and+patient-derived+murine+xenografts.">Dynamic changes in clonal cytogenetic architecture during progression of chronic lymphocytic leukemia in patients and patient-derived murine xenografts.</a> Oncotarget. 8 (27), 44749-44760 (2017).</li><li>Eirew, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+genomic+clones+in+breast+cancer+patient+xenografts+at+single-cell+resolution.">Dynamics of genomic clones in breast cancer patient xenografts at single-cell resolution.</a> Nature. 518 (7539), 422-426 (2015).</li><li>Arvanitis, C. D., Ferraro, G. B., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+and+blood-tumour+barrier+in+brain+tumours+and+metastases.">The blood-brain barrier and blood-tumour barrier in brain tumours and metastases.</a> Nature Reviews. Cancer. 20 (1), 26-41 (2020).</li><li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+leptomeningeal+dissemination+of+medulloblastoma+in+mouse+models.">In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models.</a> BMC Cancer. 16 (1), 723 (2016).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Bradford, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+profiling+of+patient-derived+xenograft+models+as+a+tool+to+identify+both+tumor+and+stromal+specific+biomarkers.">Whole transcriptome profiling of patient-derived xenograft models as a tool to identify both tumor and stromal specific biomarkers.</a> Oncotarget. 7 (15), 20773-20787 (2016).</li><li>Yip, H., Haupt, C., Maresh, G., Zhang, X., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+for+immune+checkpoint+blockade+in+human+solid+tumors.">Humanized mice for immune checkpoint blockade in human solid tumors.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (5), 313-320 (2019).</li></ol>

למחברים אין גילויים.

בכתב היד הנוכחי פורטו שיטות להקמה והפצה של PDX. כמו כן הודגמו שלוש שיטות חיסון שונות שניתן להשתמש בהן להקמת מחקרים פרה-קליניים בעת הערכת גרורות במערכת העצבים המרכזית. שיטת הבחירה צריכה להיות תלויה במטרות הניסוי. במקרים מסוימים, כדאי להשתמש ביותר ממסלול חיסון אחד. לדוגמה, השתלת אגפים תת עורית מספקת גישה פשוטה לחקר יעילות התרופה על צמיחת הגידול והערכת התרופה על מטרתה והיא גם מספקת חזותית לגודל הגידול שניתן לעקוב ולמדוד בקלות. עם זאת, לאחר קביעת היתכנות המטרה ותכונות הצמיחה האנטי-סרטניות, ניתן להקים מחקר אורתוטופי כדי להעריך את היעילות של הביולוגי לחצות את מחסום הדם-מוח ולחקור את השפעתו בתוך המיקרו-סביבה של גידול המוח. כמו כן, הישרדות מוערכת טוב יותר במחקרים אורתוטופיים והזרקות תוך לב.
הזרקה תוך גולגולתית של גרורות במוח מודלים PDX הוא לעתים קרובות המודל הפרה-קליני המועדף בשל נוכחותם של מיקרו-סביבה במוח ו- BBB. עם זאת, מחקרים הראו כי גרורות במוח יש את היכולת לשנות את BBB, אשר משפיע על חדירות של מולקולות לגידול16. שינויים אלה ב- BBB לא יבואו לידי ביטוי על ידי גידולים מושתלים תוך גולגולתיים, ובגלל זה מחקרים פרה-קליניים עשויים שלא לשקף באופן מלא את התגובה של גידולי חולים. אפילו עם אזהרה זו, הזרקה תוך גולגולתית נותרה השיטה הטובה ביותר לבדוק את החדירות והיעילות של תרופות לחצות את BBB במודלים פרה-קליניים. אתגר נוסף עם מודלים תוך גולגולתיים הוא שהם קשים למעקב אחר צמיחת הגידול ודורשים שימוש בטכניקות הדמיה. התמרה ויראלית של PDX עם סמנים פלואורסצנטיים או ביולומינסנטיים שימשה באופן מסורתי, אך יכולה להיות מאתגרת לביצוע. עם זאת, מספר טכניקות הדמיה מפותחות לשימוש בעכברים שאינם דורשים החדרת סמנים, אשר יכולים לשפר את קלות הניטור של גידולי מוח אורתוטופיים אלה עבור מחקרים פרה-קליניים. אלה כוללים טכנולוגיות הדמיה כגון דימות תהודה מגנטית (MRI) וטומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) הדמיית טומוגרפיה מיקרו ממוחשבת (micro-CT). לבסוף, הזרקה תוך גולגולתית עשויה שלא לשקף במדויק את המיקרו-סביבה של גרורות במערכת העצבים המרכזית מחוץ למוח, כגון גרורות לפטומנינגיאליות. במקרה זה, הזרקה לתוך cisterna magna יכול להתבצע כדי לייצג בצורה מדויקת יותר גרורות leptomeningeal17.
אפיון התכונות הפנוטיפיות והמולקולריות של מודל PDX חשוב לבחירת המודלים הטובים ביותר למחקרים פרה-קליניים. חביון הגידול יכול לנוע בין 7-140 ימים ושיעורי הנטילה יכולים להיות גם משתנים מאוד12. המספר האופטימלי של בעלי חיים להשתלה ועיתוי תחילת הטיפול יצטרכו להתבסס על המאפיינים של כל מודל PDX ויש לקבוע אותם אמפירית. יתר על כן, הפרופיל המולקולרי של גידולי PDX חשוב גם לבחירת המודלים המייצגים ביותר של PDX למחקרים פרה-קליניים. ככל שהמודל מייצג מולקולרית קרוב יותר את הרקמה התורמת, כך סביר להניח שהוא ינבא יותר את התגובה הקלינית. כמו כן, קריטי להבטיח כי המטרות שנבחרו מתוך נתונים אנושיים נמצאות ב- PDX שנבחרו למחקרים ונשמרות לאורך כמה דורות, כפי שהוכח רצף השבטים קשור לפרופיל גנומי שונה של השיבוט הדומיננטי המכהן. לאור זאת, הפרופילים הפנוטיפיים והמולקולריים של גידולי PDX גרורות במערכת העצבים המרכזית אופיינו בהרחבה במשך דורות רבים12.
למרות היתרונות הרבים של שימוש במודלים PDX גרורות CNS, ישנן מספר מגבלות הקשורות לשימוש בהם. ראשית, מיקרו-סביבה חלופית של הגידול ובמיוחד היעדר מערכת חיסונית הן מגבלות מתועדות היטב של מודלים PDX18. קסנוגרפט של גידול אנושי בעכברים גורם להחלפת סטרומה אנושית בסטרומה של עכבר עם כל מעבר עוקב והסטרומה האנושית מוחלפת בדרך כלל לחלוטין לאחר מספר מעברים19. עם זאת, ההבדלים במיקרו-סביבה של הגידול אינם גורמים להבדלים גדולים בפרופיל המולקולרי של גידולי PDX מושתלי אגפים בהשוואה לגידול המקורי של המטופל12, דבר המצביע על כך שמודלים של אגפים עדיין מייצגים מודלים ניסיוניים טובים לחקר גרורות במערכת העצבים המרכזית. שנית, השימוש בבעלי חיים מדוכאי חיסון גורם להיעדר חדירה של תאי מערכת החיסון לגידול ולתגובה חיסונית כללית של הפונדקאי, מה שמגביל את הדרך הבסיסית שבה הפונדקאי מנסה להילחם בצמיחת סרטן12. בעוד עכברים אנושיים שהושתלו בתאי חיסון אנושיים זמינים לחקר האינטראקציות של תאי חיסון ספציפיים עם הגידול, עדיין קיימות שאלות ומחלוקות רבות לגבי הגישות, השיטות והפרשנות של תוצאות אלה20.
בעוד שרוב PDX הוכחו כיציבים גנטית, אנו ואחרים הראינו כי במקרים נדירים, גם בהיעדר טיפולים או לחצים סלקטיביים חיצוניים אחרים, ייתכנו שינויים בשיבוטים של הגידולים, כגון השתלטות שיבוט מינורית12,14,15. זה יכול לגרום לשינויים דרמטיים בפרופיל המולקולרי, אשר בסופו של דבר יגרום לכך שהגידול לא ישקף את השיבוטים הדומיננטיים בגידול החולה12. בעוד PDX המציגים רצף שבטים יכול להיות בשימוש במחקרים פרה-קליניים, גנים רבים המיועדים למיקוד (למשל, Her2) עלולים ללכת לאיבוד עם רצף השבטים. לכן, מומלץ לבצע בדיקות תכופות של מודלים של PDX כדי לקבוע אם הם עדיין שומרים על הפרופיל המולקולרי של השיבוט הרצוי.
לסיכום, מודלים PDX מייצגים מערכת מודל מצוינת לחקר לא רק גרורות CNS אלא גם סוגים אחרים של גידולים. פיתוח מודלים אלה הראה כי הם משקפים במידה רבה את הפרופיל הפנוטיפי, המולקולרי וההטרוגניות של גרורות CNS אנושיות 8,9,10,12. הם משמשים כמודלים יעילים לחקר הביולוגיה של גרורות במערכת העצבים המרכזית וגם משמשים גם כמודלים פרה-קליניים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, ומחליפים מודלים של קו תאים בשימוש יתר ששימשו בעבר למחקרי in vivo של גרורות במערכת העצבים המרכזית. אין ספק שההבדלים בין PDX לגידול של חולה תורם קיימים12,18. ידיעת ההבדלים הללו חשובה לתכנון וביצוע נכון של מחקרים פרה-קליניים. לבסוף, על ידי בחירה בין מספר מסלולי חיסון, מודלים PDX הם תכליתיים בשימוש שלהם המאפשר מחקר של היבטים מרובים של המחלה. מודלים של PDXs ללא ספק ימלאו תפקיד חשוב בקידום ההבנה שלנו של גרורות במערכת העצבים המרכזית ופיתוח טיפולים חדשניים.

שכיחות גרורות למערכת העצבים המרכזית (CNS) עלתה בשנים האחרונות 1,2,3. טיפולים מסורתיים לגרורות במערכת העצבים המרכזית, כגון כריתת גידול, הקרנות מוח שלמות ורדיוכירורגיה סטריאוטקטית, היו פליאטיביים במידה רבה ולעתים רחוקות מרפאים, ויכולים להוביל לתופעות לוואי מתישות, כגון הידרדרות קוגניטיבית1. לאחרונה, טיפולים ממוקדים ואימונולוגיים חדשים רבים מפותחים לטיפול בגרורות במערכת העצבים המרכזית המראים הבטחה להיות טיפולים יעילים יותר, תוך פחות תופעות לוואי4.
תרגום תוצאות פרה-קליניות לנקודות קצה קליניות משמעותיות דורש לעתים קרובות אסטרטגיות מידול יעילות ומנבאות. מבחינה היסטורית, מודלים של קסנוגרפט קו תאים היו הסטנדרט למחקר פרה-קליני במחקר גרורות במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, מודלים אלה של קו תאים אינם משקפים את התנהגות הגידול האמיתית של הגידול המארח או מייצגים את ההטרוגניות ההיסטולוגית או המולקולרית של המחלה. יתר על כן, מודלים של קווי תאים מסוגלים להסתגל לתנאי גידול חוץ גופיים, ולכן לאבד את המאפיינים המקוריים של הגידול המארח. xenografts נגזר המטופל (PDXs), אשר להשתיל את הגידול של המטופל לתוך עכבר מדוכא חיסון או אנושי, משמשים יותר ויותר במחקר סרטן תרגומי. חוקרים הראו כי מודלים של PDX יכולים בדרך כלל לשחזר נאמנה את צמיחת הגידול, מאפיינים היסטולוגיים, לשמור על הטרוגניות הגידול, פוטנציאל גרורתי ותכונות גנטיות מולקולריות. בנוסף, מודלים של PDX הם פרוגנוסטיים לפיהם תקופת חביון הגידול PDX מתואמת עם ההישרדות הכוללת של המטופל והם גם הוכחו כמנבאים במדויק תגובה טיפולית בניסויי חולים 5,6.
הייתה הופעה של גרורות במערכת העצבים המרכזית PDXs. לרוב, אלה פותחו המייצגים גידולים שמקורם ממקור יחיד, כגון סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC)7, סרטן השד8,9 ומלנומה 10,11. לאחרונה פותח ואופיין אוסף גדול ומגוון של דגמי PDX, המייצגים שמונה תת-סוגים היסטולוגיים שונים12. הוכח כי מודלים של PDX עבור גרורות במערכת העצבים המרכזית דומים מאוד לגידול המקורי של המטופל, הן מבחינה היסטולוגית והן מבחינה מולקולרית, והראו גם הבדלים ודמיון היסטולוגיים ייחודיים10,12. יתר על כן, בעוד שרוב המודלים של PDX גרורות במערכת העצבים המרכזית שומרים על ההטרוגניות השבטית של גידולים אנושיים, חלקם הראו עדות לרצף שבטים12, מה שהופך אותם גם לאידיאליים לחקר עמידות לטיפולים על ידי מעקב אחר שינויים שבטיים לאחר הטיפול.
הפרוטוקולים המתוארים כאן מתארים שיטות לביסוס PDX ונתיבי חיסון שונים המשמשים במחקרים פרה-קליניים של גרורות במערכת העצבים המרכזית (איור 1). שיטות השתלה אלה נבדלות זו מזו ביכולתן לחקות גדילה וגרורות. כאן, הפרוטוקול מדגיש את היישומים עבור כל מסלול של השתלה ומדגים כיצד הם יכולים לשמש לחקר גרורות CNS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470106-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>W31G-RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIEA NOG mouse</td>
			<td>Taconic</td>
			<td>NOG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethiqa XR (buprenorphine SR)</td>
			<td>MWI</td>
			<td>072117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tube</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel growth factor reduced (GFR)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>PH-PURALUBE-VET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/DPBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine swabs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15648-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drill</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical glue</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>VG3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sutures</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>MMV-661-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53548-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor dissociation kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the establishment and utilization of patient derived xenograft models of central nervous system metastasis

פיתוח טיפולים חדשניים לגרורות במערכת העצבים המרכזית (CNS) עוכב על ידי היעדר מודלים פרה-קליניים המייצגים במדויק את המחלה. מודלים של גרורות במערכת העצבים המרכזית (PDX) של גרורות במערכת העצבים המרכזית הוכחו כמייצגים טוב יותר את המאפיינים הפנוטיפיים והמולקולריים של המחלה האנושית, כמו גם משקפים טוב יותר את ההטרוגניות והדינמיקה השבטית של גידולים אנושיים בהשוואה למודלים היסטוריים של קו תאים. ישנם אתרים רבים שניתן להשתמש בהם להשתלת רקמה שמקורה במטופל בעת הקמת ניסויים פרה-קליניים, כל אחד עם היתרונות והחסרונות שלו, וכל אחד מהם מתאים לחקר היבטים שונים של המפל הגרורתי. כאן, הפרוטוקול מתאר כיצד לבסס מודלים של PDX ומציג שלוש גישות שונות לשימוש במודלים של PDX גרורות במערכת העצבים המרכזית במחקרים פרה-קליניים, תוך דיון בכל אחד מהיישומים והמגבלות שלהם. אלה כוללים השתלת אגף, הזרקה אורתוטופית במוח והזרקה תוך לבבית. השתלת אגף תת עורית היא הקלה ביותר למעקב, ולכן הנוחה ביותר למחקרים פרה-קליניים. בנוסף, נצפו גרורות למוח ולרקמות אחרות מהשתלת אגף, דבר המצביע על כך שהגידול עבר מספר שלבים של גרורות, כולל intravasation, extravasation, וקולוניזציה. הזרקה אורתוטופית במוח היא האפשרות הטובה ביותר לשחזור המיקרו-סביבה של הגידול במוח והיא שימושית לקביעת היעילות של תרופות ביולוגיות לחצות את מחסום הדם-מוח (BBB), אך עוקפת את רוב השלבים של המפל הגרורתי. הזרקה תוך לבבית מקלה על גרורות למוח והיא שימושית גם לחקר טרופיזם איברים. בעוד שיטה זו מוותרת על שלבים מוקדמים יותר של מפל גרורתי, תאים אלה עדיין יצטרכו לשרוד את זרימת הדם, אקסטרווס, ולהתיישב. התועלת של מודל PDX, אם כן, מושפעת ממסלול החיסון של הגידול והבחירה באיזה מהם להשתמש צריכה להיות מוכתבת על ידי השאלה המדעית והמטרות הכוללות של הניסוי.

גידולי PDX בעלי התפשטות אגפית הם הקלים ביותר לשתלה, ניטור וכריתה, והם מומלצים בדרך כלל לביסוס ראשוני והתפשטות של גידולי PDX (איור 1). בעת הקמה או הפצה של גידולי PDX, זה נבון להשתיל גידולים במספר בעלי חיים, מכיוון שקצב לקיחת הגידול עשוי להשתנות ולא כל פיסת גידול תמיד תיקח בעכברים. פותחו שיטות להקמה והתפשטות של גרורות במערכת העצבים המרכזית, PDXs, ישירות במוח13. עם זאת, שיטות אלה עדיין מאתגרות יותר עם שיעורי נטילה נמוכים יותר והגידולים קשים יותר באופן משמעותי להפצה ולניטור מאשר השתלת אגף.
אם גידולים של חולים אינם זמינים, גרורות במערכת העצבים המרכזית ניתן להשיג גידולי PDX גם ממגוון מקורות, כולל מאגרים של מעבדות אקדמיות או חברות מסחריות. לאחר רכישת הגידולים, העדיפות הראשונה תהיה להפיץ ולשמר בהקפאה חומר רב ככל האפשר, ולהבטיח מספר רב של גידולים במעבר נמוך נשמרים. זה מבטיח כי מספיק חומר זמין עבור מספר בלתי מוגבל של מחקרים הבאים עם מודלים PDX. בדומה לקווי תאים אימורטליים, גידולי PDX צריכים להישמר בהקפאה ולהשתמש בהם במספרי מעבר נמוכים, שכן נדידה גנטית גורמת לשינויים בפנוטיפ ובגנוטיפ של PDX לאורך זמן12,14,15. ללא קשר למקור גידולי PDX, חשוב לבצע בדיקות סקר תכופות של PDX ומושבות עכברים עבור פתוגנים אנושיים ועכברים כאחד, כגון HIV והפטיטיס לבני אדם ו- Corynebacterium bovis לעכברים. זה יגביל את ההתפשטות של פתוגנים לא רצויים מה-PDX הן לאדם המטפל בהם והן לעכברים אחרים במחקר ולוויבריום.
שיטות ההשתלה המתוארות כאן יכולות לשמש לחקר הביולוגיה של הגידול, להערכת היבטים רבים של המפל הגרורתי ולמחקרים פרה-קליניים. היתרון העיקרי של השתלת אגפים הוא קלות ניטור הגידול לאורך זמן, שכן גידולים נראים לעין, וניתן למדוד את צמיחתו בקלות באמצעות קליפר. שיטה זו יכולה להיות מקום טוב להתחיל בו לקביעת היתכנות של יעד לתרופה. השתלה תוך גולגולתית מועדפת אם נוכחות המיקרו-סביבה במוח חשובה ויכולה לשנות את הצמיחה או הפרופיל המולקולרי של הגידול. בנוסף, השתלה תוך גולגולתית ממקמת את הגידול מאחורי מחסום הדם במוח (BBB), מה שהופך אותו חיוני למחקרים פרה-קליניים הבוחנים את יעילות התרופות הדרושות כדי לחצות את מחסום הדם-מוח. עם זאת, קשה לעקוב אחר הצמיחה של גידולי PDX ודורש הדמיה רדיולוגית או הדמיה ביולומינסנטית אם התאים מסומנים. לדעת מתי להתחיל את הטיפול התרופתי באופן פרה-קליני ידרוש נתוני הדמיה כדי לעקוב אחר גדילה או ידע על הישרדות ממוצעת של עכברים הנושאים גידול PDX מסוים. יתר על כן, השתלה תוך גולגולתית עוקפת את כל השלבים החיוניים של המפל הגרורתי, מה שהופך אותה למתאימה רק לחקר יעילות התרופה והמיקרו-סביבה של הגידול במוח. למרות ההבדלים במיקרו-סביבה של הגידול, המורפולוגיה של גידולי PDX דומה ללא קשר לאתר ההשתלה, כפי שניתן לראות בגידול PDX זה (CM04) שמקורו בגרורות במוח שמקורן בגידול ראשוני של סרטן ריאה מסוג תאים קטנים (איור 2). ניתן לראות את המורפולוגיה של סרטן הריאה של תאים סרטניים בעלי גרעינים קטנים וציטופלסמה דלה בגידול האגפי, גידול תוך גולגולתי וגרורות בטניות כתוצאה מהזרקה תוך לבבית. יתר על כן, גרורות ספונטניות מגידולים שהושתלו באגף נצפו בעבר12 , דבר המצביע על כך שניתן לשחזר ולחקור את התהליכים הגרורתיים כגון intravasation, extravasation ו- colonization בגידולים באגף, שאחרת לא היו אפשריים עם גידולים אורתוטופיים במוח. באופן כללי, הוא ציין כי השתלת אגף היא שיטה מתאימה לחקר ביולוגיה גרורות CNS וניהול מחקרים פרה-קליניים.
הזרקה תוך לבבית משמשת לרוב לחקר טרופיזם איברים ופוטנציאל גרורתי של גידולים. תאי הגידול המוזרקים יצטרכו לעבור מספר שלבים של המפל הגרורתי, כולל הישרדות במחזור הדם, אקסטרווסציה והתיישבות של האתר הגרורתי. בדומה להזרקה אורתוטופית למוח, ייתכן שיהיה קשה לעקוב אחר התקדמות גרורות סרטניות ללא הדמיה רדיולוגית או תיוג תאים. עם זאת, כמו בהשתלה אורתוטופית, חיסון מוצלח גורם להידרדרות במצבם של בעלי החיים לאורך זמן עם התפשטות הגידול. איור 3A מדגים גרורות למוח לאחר הזרקה תוך-לבבית במודל PDX של גרורות במערכת העצבים המרכזית, M2, שמקורן במלנומה. הזרקה תוך-לבבית של גידול PDX (CM04) גרמה לגרורות לחלל הבטן ולכבד (איור 3B). לאיברים אחרים שנבדקו, כגון הריאה, הכליות והשחלות לא היו גרורות נראות לעין.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig01.jpg"> איור 1: תרשים זרימה המציג את זרימת העבודה הכללית של הקמה, הפצה ושימוש ב-PDX עבור מחקרים פרה-קליניים. עבור כל שיטת חיסון, שלבים של המפל הגרורתי המעורב מפורטים מתחת לכל שיטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig02.jpg"> איור 2: היסטולוגיה של גידולי PDX בשיטות חיסון שונות. המטוקסילין ואאוזין (H&E) צביעה של גרורות במערכת העצבים המרכזית גידול PDX שמקורו בסרטן ריאה של תאים קטנים (CM04) שהושתל בעכברים מדוכאי חיסון על ידי שלוש השיטות הוא בעל מאפיינים פתולוגיים ומורפולוגיים דומים של סרטן ריאה של תאים קטנים, עם גרעינים קטנים וציטופלסמה דלה. לוח ההזרקה התוך לבבי מראה גרורות בבטן. קנים של תאים קטנים ויחס גרעיני לציטופלזמי גבוה ניכרים בכל שלוש התמונות. התמונות צולמו בסורק שקופיות והוגדלו ל-10x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig03.jpg"> איור 3: גרורות שנצפו לאחר הזרקה תוך-לבבית. צביעת H&E של רקמות עם גרורות נראות לעין במהלך הערכה על ידי נקרופסי לאחר הזרקה תוך לבבית של (A) M2 ו- (B) CM04. התמונות צולמו (A) בסורק שקופיות והוגדלו ל-1x (שמאל) או 20x (מימין) או (B) במיקרוסקופ רגיל בהגדלה של פי 10. נתון זה שונה מהפרסום הקודם שלנו12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis at JoVE.com

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

גרורות במערכת העצבים המרכזית מודלים PDX מייצגים את המאפיינים הפנוטיפיים והמולקולריים של גרורות אנושיות, מה שהופך אותם למודלים מצוינים למחקרים פרה-קליניים. מתואר כאן כיצד לבסס מודלים PDX ואת מסלולי החיסון המשמשים בצורה הטובה ביותר למחקרים פרה-קליניים.

הקמה וניצול של מודלים Xenograft נגזר המטופל של גרורות במערכת העצבים המרכזית

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

הפיתוח של טיפולים חדשניים עבור גרורות CNS כבר מעוכב על ידי היעדר מודלים פרה-קליניים טובים. מודלי xenograft שמקורם במטופל שלנו משחזרים גרורות במערכת העצבים המרכזית טוב יותר מאשר מודלים של קו תאים בשימוש היסטורי. על ידי שימוש במסלולים שונים של חיסון הגידול, אתה יכול לחקור היבטים שונים של מפל גרורתי.לכל מסלול יש יתרונות שניתן למנף לצורך הלימודים. מי שידגים את ההליך יהיה בן יי טו, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. להשתלה תת-עורית של גידולי PDX בהקפאה, יש להפשיר במהירות את רקמת הגידול הקפואה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, שטפו אותו בחמישה מיליליטר של DPBS בצלחת תרבית רקמות. לאחר מכן, לאחר אישור הרדמה בעכבר NOG נקבה בת שלושה עד שמונה שבועות, בצע חתך של 0.5 עד סנטימטר אחד בצד שמאל או ימין והכנס חתיכה אחת בגודל 2x2x2 מילימטר מרקמת הגידול עמוק לתוך הכיס. לאחר סגירת החתך, לאפשר לעכבר להתאושש מהרדמה עם ניטור עד שהוא אמבולטורי.ברגע שהגידול מתחיל לגדול, מדדו את הגידול שלוש פעמים בשבוע עם קליפר. בנקודת הסיום הניסויית המתאימה, זהה גרורות באמצעות נקרופסי ואשר את נוכחותם של גידולים בתוך איבר המטרה באמצעות ניתוח היסטולוגי. הניחו את הגידול PDX שנכרת ב-DMEM על קרח.לשטוף את הגידול בחמישה מיליליטר של DPBS בצלחת תרבית רקמות ולהסיר את האזורים הנמק אם יש. חותכים את הגידול לחתיכות קטנות באורך שניים עד ארבעה מילימטר ומעבירים את החתיכות לצינור המכיל תמיסת דיסוציאציה. באמצעות התוכנית המתאימה על דיסוציאטור, לנתק מכנית את הרקמה ולאמץ את תרחיף התא שנוצר באמצעות מסננת תאים 70 מיקרומטר.השתמש 20 מיליליטר של DMEM כדי לשטוף את כל התאים שנותרו מן המסננת צנטריפוגה את תרחיף התא מנותק. לאחר מכן, להשעות מחדש את התאים ואת DPBS לספירה ולהתאים את התאים לריכוז של חמש עד 10 פעמים 10 לתאים הרביעי לכל אחד עד שני מיקרוליטר של DPBS. כדי להכין את אזור הניתוח, לגלח את הפרווה על ראש העכבר כדי לחשוף את הקרקפת.לאחר מכן, מקם את העכבר במסגרת סטריאוטקסית, מאבטח היטב את ראש העכבר באמצעות מוטות אוזניים. הקפד גם לנהל משכך כאבים מתאים. יש לחטא את הקרקפת בשלושה פילינג לסירוגין של פובידון-יוד ו-70% אתנול.בצע חתך אורכי של חמישה עד שבעה מ"מ כדי לחשוף את הגולגולת ולמשוך את הקרקפת. לגרד את periosteum עם מלקחיים כדי לאתר את bregma. מקם את המחט של המסגרת הסטריאוטקטית על גבי הברגמה ואפס את הקואורדינטות לאפס.הזיזו את הזרוע מילימטר אחד אחורי ומילימטר אחד לרוחב מימין לקו האמצע, וסמנו מיקום זה בטוש קבוע. לאחר מכן, קדח חור בור קטן בגולגולת במיקום המסומן, תוך הקפדה לא לקדוח לתוך המוח. יש להעמיס לחמישה מיקרוליטר 26 מד מזרק המילטון עם מיקרוליטר אחד עד שניים של תאים ולחבר את המזרק לזרוע הסטריאוטקסית.להחדיר לאט את המחט שני מילימטרים לתוך המוח ולהתחיל להזריק תאים בקצב הרצוי. לאחר שכל התאים נמסרו, משכו לאט את המחט, מלאו את חור הבור בשעוות עצם וסגרו את החתך. החזירו את העכבר לכלוב עם ניטור עד להחלמה מההרדמה.לאחר המתת חסד החיה בנקודת הקצה הניסויית המתאימה, לאשר את נוכחותם של גידולים במוח באמצעות ניתוח היסטולוגי. כדי להשתיל גידולי PDX על ידי הזרקה תוך לבבית, הכינו את תאי הגידול כפי שהודגם והניחו את העכבר המושתל המרדם במצב שכיבה. יש לגלח את הפרווה על חזה החיה ולחטא את העור החשוף בפובידון-יוד ובאתנול 70%.צייר 0.5 עד 10 פעמים 10 לתאי הגידול החמישי ועד 100 מיקרוליטר של DPBS לתוך מזרק מצויד מחט 28 מד. אתר את אתר ההזרקה מעט משמאל לעצם החזה באמצע הדרך בין החריץ של עצם החזה לבין תהליך הקסיפואיד. לאחר מכן, הכנס את המחט אנכית לתוך העכבר באתר ההזרקה.לאחר שנצפתה זרימה חוזרת, המעידה על כניסה מוצלחת של המחט לחדר השמאלי, שחררו לאט לאט את מתלה הגידול לחדר השמאלי מבלי להזיז את המחט. לאחר שכל התאים נמסרו, לאט ואנכית למשוך את המחט ולהחיל חתיכת גזה סטרילית על אתר ההזרקה במשך כדקה עד הדימום מפסיק. אפשר לעכבר להתאושש על כרית מחוממת עם ניטור עד שהוא אמבולטורי.בנקודת הסיום הניסויית המתאימה, זהה גרורות באמצעות נקרופסי ואשר את נוכחותם של גידולים בתוך איבר המטרה באמצעות ניתוח היסטולוגי. למרות ההבדלים במיקרו-סביבה של הגידול, גידולי PDX מדגימים מורפולוגיות דומות המכילות תאים עם גרעינים קטנים וציטופלסמה דלה, ללא קשר לאתר ההשתלה. בניתוח זה, הזרקה תוך-לבבית של תאי מלנומה אנושיים הביאה לגרורות של תאי הגידול למוח העכבר, ואילו הזרקה תוך-לבבית של תאי סרטן ריאה אנושיים גרורות במוח הביאה לגרורות לחלל הבטן ולכבד של העכבר.פרוטוקולים אלה מאפשרים הקמת מחקרים פרה-קליניים לבדיקת טיפולים ושילובי טיפול חדשים, ויכולים לסייע בחקר תהליכים ביולוגיים וגרורות גידוליות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

פיתוח ותחזוקה של גידול נגזר החולה פרה xenograft דגם לחקירת Novel טיפולים נגד סרטן

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

תיוג של xenografts הנגזר חולה סרטן השד עם כתבים לעקיבים עבור צמיחת גידולים וגרורים מחקרים

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Cell הזרקת הסרטן Intracarotid לייצר מודלי עכבר של המוח גרור

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

ניצול של אולטרסאונד מודרכת מכוון רקמות השרשה הסלולר להקמתה של גידול גרורתי רלוונטי מבחינה ביולוגית Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

מטופל-נגזר אורתוטופית מודלים של תאים האדם Urothelial קרצינומה של סרטן המעי הגס ואת הגידול גרורות ספונטנית

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

מטופל-נגזר הטרוגנית מודל Xenograft של סרטן הלבלב באמצעות הזחלים Zebrafish כפונדקאים עבור הערכת סמים השוואתי

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

מלנומה מטופלת-נגזר מודל Xenograft

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...