Name: craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice
Uploaded: 2021-07-24T14:00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice at JoVE.com

نود أن نشكر جميع أعضاء مجموعة الهندسة الحيوية الجزيئية في جامعة ويستليك على كل المساعدة والمناقشة المفيدة. كما نشكر جينزي لي وجي مين جيا من جامعة ويستليك على المساعدة في تصوير العملية الجراحية.
وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من مؤسسة جامعة ويستليك، ومنحة المحقق الشاب لعام 2020 من BBRF، ومنحة المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين 32050410298 كل ذلك إلى K.D.P.

<ol>
	<li>Leutgeb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Codes+for+Spatial+and+Episodic+Memory+in+Hippocampal+Neuronal+Ensembles.">Independent Codes for Spatial and Episodic Memory in Hippocampal Neuronal Ensembles.</a> Science. 309 (5734), 619-623 (2005).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>Polanco, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+and+tau+complexity+-+towards+improved+biomarkers+and+targeted+therapies.">Amyloid-&#946; and tau complexity - towards improved biomarkers and targeted therapies.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2018).</li><li>Henneman, W. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+atrophy+rates+in+Alzheimer+disease.">Hippocampal atrophy rates in Alzheimer disease.</a> Added value over whole brain volume measures. 72 (11), 999-1007 (2009).</li><li>Camicioli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+is+associated+with+hippocampal+atrophy.">Parkinson's disease is associated with hippocampal atrophy.</a> Mov Disord. 18 (7), 784-790 (2003).</li><li>Piatkevich, K. D., Murdock, M. H., Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Engineering+and+Application+of+Optogenetic+Indicators+for+Neuroscience.">Advances in Engineering and Application of Optogenetic Indicators for Neuroscience.</a> Applied Sciences. 9 (3), 562 (2019).</li><li>Piatkevich, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+imaging+of+neural+activity+in+awake+behaving+mice.">Population imaging of neural activity in awake behaving mice.</a> Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).</li><li>Fan, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-Optical+Electrophysiology+Reveals+the+Role+of+Lateral+Inhibition+in+Sensory+Processing+in+Cortical+Layer+1.">All-Optical Electrophysiology Reveals the Role of Lateral Inhibition in Sensory Processing in Cortical Layer 1.</a> Cell. 180 (3), 521-535 (2020).</li><li>Shemesh, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+Calcium+Imaging+of+Dense+Neural+Populations+via+a+Cell-Body-Targeted+Calcium+Indicator.">Precision Calcium Imaging of Dense Neural Populations via a Cell-Body-Targeted Calcium Indicator.</a> Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).</li><li>Villa, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+Synapses+Are+Repeatedly+Assembled+and+Removed+at+Persistent+Sites+In+Vivo.">Inhibitory Synapses Are Repeatedly Assembled and Removed at Persistent Sites In Vivo.</a> Neuron. 89 (4), 756-769 (2016).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2013).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).</li><li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Genetically+Encoded+Bright+Positive+Calcium+Indicator+NCaMP7+Based+on+the+mNeonGreen+Fluorescent+Protein.">Novel Genetically Encoded Bright Positive Calcium Indicator NCaMP7 Based on the mNeonGreen Fluorescent Protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1644 (2020).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice.">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li><li>Kalmbach, A. S., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+surface+temperature+under+a+craniotomy.">Brain surface temperature under a craniotomy.</a> Journal of neurophysiology. 108 (11), 3138-3146 (2012).</li><li>Roche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+with+a+water+immersion+objective+affects+brain+temperature,+blood+flow+and+oxygenation.">In vivo imaging with a water immersion objective affects brain temperature, blood flow and oxygenation.</a> eLife. 8, 47324 (2019).</li><li>Watakabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analyses+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1,+2,+5,+8+and+9+in+marmoset,+mouse+and+macaque+cerebral+cortex.">Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex.</a> Neuroscience Research. 93, 144-157 (2015).</li><li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H., Manfredssonn, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Therapy for Neurological Disorders: Methods and Protocols. , 133-149 (2016).</li><li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+hippocampal+activity,+plasticity,+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition.">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li><li>Yashiro, H., Nakahara, I., Funabiki, K., Riquimaroux, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-endoscopic+system+for+functional+assessment+of+neural+circuits+in+deep+brain+regions:+Simultaneous+optical+and+electrical+recordings+of+auditory+responses+in+mouse's+inferior+colliculus.">Micro-endoscopic system for functional assessment of neural circuits in deep brain regions: Simultaneous optical and electrical recordings of auditory responses in mouse's inferior colliculus.</a> Neuroscience Research. 119, 61-69 (2017).</li><li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus.">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li><li>Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+In+Vivo+Imaging+of+Hippocampal+Dendrites+and+Spines.">High-Resolution In Vivo Imaging of Hippocampal Dendrites and Spines.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147 (2004).</li><li>Busche, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+soluble+amyloid-&#946;+for+early+hippocampal+hyperactivity+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Critical role of soluble amyloid-&#946; for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8740 (2012).</li><li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Consolidation+of+Ensemble+Neural+Plasticity+Patterns+in+Hippocampal+Area+CA1.">Long-Term Consolidation of Ensemble Neural Plasticity Patterns in Hippocampal Area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li><li>Castello-Waldow, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+neurons+with+stable+excitatory+connectivity+become+part+of+neuronal+representations.">Hippocampal neurons with stable excitatory connectivity become part of neuronal representations.</a> PLOS Biology. 18 (11), 3000928 (2020).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

هنا نصف طريقة للتصوير على المدى الطويل لمنطقة قرن آمون CA1 في الفئران behaving. وتستند هذه الطريقة على زرع مزمن من نافذة التصوير حسب الطلب، والتي تمكن أيضا الإدارة المستهدفة من الفيروسات أو الأدوية مباشرة إلى الخلايا العصبية ذات الاهتمام. يتكون هذا البروتوكول من أربعة أجزاء رئيسية: 1) تجميع زرع التصوير؛ و (2) تركيب الغرسات؛ و (2) زراعة الأسنان؛ و (3) زراعة الأسنان؛ و (3) زراعة الأسنان؛ و (ه 2) تركيب زرع التصوير؛ 3) حقن الفيروس عن طريق زرع التصوير؛ 4) التصوير الوظيفي في الفئران behaving. فيما يلي وصف ومناقشة الخطوات الهامة في البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها والتعديلات والقيود المفروضة على الأسلوب. كما نناقش أهمية الأسلوب وتطبيقاته البديلة المحتملة.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول الموصوف التي هي مهمة إلى حد ما لعملية جراحية ناجحة: (1) إعداد زرع التصوير عالية الجودة; '2' الحالات الجراحية العقيمة؛ '3' طموح القشرة؛ '4' وضع غرسة التصوير بدقة؛ '5' الحقن الفيروسي. وكما تشير الخطوة 1.6، فإن القصدير اللحام الزائد سيتطلب استئصال قرنية أكبر وبالتالي يزيد من خطر الالتهاب. من المهم جدا أيضا استخدام كمية مناسبة من الغراء البصري اللاصق عند تثبيت زجاج الغطاء إلى قنية التصوير ، كما هو مبين في الخطوة 1.11 ، حيث أن كمية غير كافية قد تؤدي إلى تسرب السائل النخاعي إلى قنية التصوير وجعلها مبهمة. من ناحية أخرى، يمكن أن يؤدي لاصق بصري الزائدة في انخفاض الشفافية من النافذة الزجاجية. يمكن أن يسبب التلوث المحتمل لزرع التصوير انتشارا نشطا للأنسجة الضامة تحت النافذة البصرية و / أو التهابا شديدا ، مما سيؤدي إلى الإنهاء المبكر للتجربة. لذلك ، فإن تجميع وإعداد غرسة التصوير قبل الجراحة لا يقل أهمية تقريبا عن العملية الجراحية نفسها.
أثناء الجراحة ، يتم استئصال جزء القشرة تحت استئصال القحف من خلال الطموح اللطيف ، مما يؤدي إلى نزيف لا مفر منه. الدم في موقع الجراحة يقلل بشكل كبير من رؤية أنسجة الدماغ التي يجب إزالتها. وهذا يعقد التقييم الدقيق للعمق المطلوب من استئصال الأنسجة. التنظيف الدقيق للموقع الجراحي مع برنامج تلفزيوني في كل مرة قبل تطبيق شفط لإزالة الجزء التالي من الأنسجة يوفر تحكما أفضل في العمق. يجب دائما إزالة أنسجة الدماغ في أجزاء صغيرة خطوة بخطوة مما يؤكد عمق الأنسجة الاجتثاث قبل الشروع في المزيد من الشفط. ويمكن أيضا السيطرة الدقيقة على الشفط يمكن أن يتحقق مع إبرة حادة أرق. نقترح استخدام إبرة 26 G، ومع ذلك، أصغر من قطر 26 G هو أكثر عرضة للانسداد. وعلاوة على ذلك، فإنه عادة ما يستغرق الكثير من الممارسة لتحديد عمق دقيق للطموح المطلوب لكل حيوان، كما لون القشرة، كالوسوم الجسم، وفرس النهر قد تختلف من الماوس إلى الماوس(الشكل 3).
يجب أن يتم إدخال وتأمين زرع التصوير بدقة شديدة لضمان أقرب موضع ممكن لنافذة التصوير إلى السطح الظهري للقرن آمون. يجب أن يتطابق حجم استئصال القحف المعد بشكل وثيق مع الغرسة ويسمح بإدخالها دون مقاومة كبيرة. وفي الوقت نفسه، لا ينبغي أن تكون هناك فجوة مرئية بين الجمجمة والزرع لضمان الختم السليم وتجنب التعرض لأنسجة الدماغ. يجب تطبيق ضغط لطيف ومستقر على الجزء العلوي من الزرع أثناء ختمه على الجمجمة. يكاد يكون من المحتم أن يكون الدم تحت نافذة التصوير أثناء تركيب زرع. إذا تم إجراء العملية الجراحية بشكل صحيح ، فيجب إزالة النافذة في غضون 3-7 أيام ، ويصبح الأوعية الدموية في الدماغ مرئية بوضوح. ومن المهم أيضا التأكد من أن الفيروس يتم حقنه بشكل صحيح تحت النافذة. في حالة فشل التعبير، يمكن إعادة حقن الفيروسات عدة مرات.
المضاعفات الرئيسية التي واجهناها في بعض الحالات هي انخفاض الرؤية لنافذة التصوير. هناك عدة أسباب محتملة لضعف جودة التصوير: '1' الالتهاب المستمر؛ '2' الالتهاب المستمر؛ '2' الإصابة بالالتهاب؛ '2' الإصابة بالالتهاب؛ '2' ال 2) نمو النسيج الضام على الزجاج؛ 3) فجوة كبيرة بين النافذة والحصين. وعادة ما يحدث الالتهاب بسبب التلوث أثناء الجراحة أو عن طريق زرع التصوير غير المعقم بشكل صحيح. نقترح الاستئصال التلقائي للأدوات الجراحية قبل وبعد كل عملية جراحية، وتطهير منطقة الجراحة قبل العملية مباشرة، وارتداء معدات الحماية الشخصية النظيفة أثناء الجراحة. يجب تنظيف غرسات التصوير بعد التجميع والتعقيم وتخزينها في ظروف معقمة. يمكن أن يكون نمو النسيج الضام على زجاج زرع التصوير بسبب التلوث الميكانيكي على سطح الزجاج أو الصدمة المفرطة لأنسجة الدماغ أثناء استئصال القشرة. بعد تجميع الزرع ، من المهم التأكد من أن السطح الزجاجي نظيف وسلس. أيضا، يجب إزالة جميع قطع أنسجة الدماغ التالفة بعناية قبل إدخال زرع التصوير في استئصال القحف. في بعض الحالات، تؤدي الفجوة بين النافذة الزجاجية والحصين إلى تراكم السائل النخاعي، مما يقلل من جودة التصوير. لذلك، أثناء تركيب الزرع، من المهم إدراج كل ذلك في ضمان اتصال جيد بين قرن آمون ونافذة زجاجية. في بعض الأحيان ، من الصعب تحديد السبب الدقيق لنافذة التصوير المبهمة. نقترح إجراء تحليل ما بعد الوفاة للكشف عن الظروف تحت النافذة البصرية وتعديل العمليات الجراحية اللاحقة.
وبهذه الطريقة عدة قيود أساسية وتقنية ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار قبل وأثناء التصوير في الجسم الحي. أحد القيود الرئيسية هو استئصال القشرة. تتم إزالة جزء من القشرة البصرية والحسية أثناء الجراحة. في حين أنه من الصعب تقييم تأثير استئصال القشرة بدقة ، حيث أن أنسجة الدماغ التي تمت إزالتها لا تظهر مباشرة على قرن آمون ، أظهرت العديد من الدراسات عدم وجود ضعف ملحوظ في التعلم المعتمد على فرس النهر أو وظائف قرن آمون الأخرى ذات الصلة15،16. وينبغي أيضا النظر في القيود البصرية ، وخصوصا عندما تستخدم العدسات عالية NA الهدف. على سبيل المثال، في هذه الدراسة، استخدمنا قنية طولها 1.75 مم بقطر داخلي 1.9 ملم. هندسة هذه القنية لن تحافظ على NA الكامل من هدف الهواء مع NA أكثر من ~ 0.5 أو هدف المياه مع NA أكثر من ~ 0.6 كما أنها سوف مقطع بعض الضوء. وهناك قيد آخر، شائع لجميع يزرع تصوير الدماغ، هو أن جزءا من الدماغ هو الحصول على يتعرض، وبالتالي تعزيز فقدان الحرارة17،18. ومع ذلك، يمكن استعادة درجة حرارة الدماغ الفسيولوجية بسهولة أثناء التصوير عن طريق التشوه من عازل دافئ.
يمكن تعديل الطريقة الموصوفة بسهولة أو تعديلها للتطبيقات الأخرى. على سبيل المثال، يمكن تكييف التحضير لتصوير المخطط7. كما يضع المخطط أعمق قليلا من قرن آمون، وينبغي استخدام قنية التصوير أطول لتجميع زرع التصوير. نقترح استخدام قنية تصوير 2.0 مم. يجب تعديل إحداثيات استئصال القحف في المقابل (AP: +0.8 مم، ML: −1.8 مم). وبالإضافة إلى ذلك، حقن الفيروس عن طريق ضخ cannula يسمح تحقيق التعبير عن متحولة في طبقة رقيقة من الخلايا العصبية عند استخدام النمط المصلي AAV مع انتشار مقيد19،20. وهو مفيد بشكل خاص للتصوير الفوتون الواحد بسبب انخفاض الفلورسينس خارج التركيز من الطبقات العميقة ، ونتيجة لذلك ، تحسين التصوير بدقة الخلية الواحدة. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدام قنية الحقن أثناء التصوير الوظيفي لإدارة الأدوية أو غيرها من المواد الكيميائية مباشرة على الخلايا العصبية في FOV(الشكل 5B). يضيف القنية التسريبية بشكل عام وظائف مفيدة لزرع التصوير ، مما يحسن جودة التصوير بسبب التعبير الفيروسي المستهدف وتمكين التحفيز الدوائي للخلايا العصبية في FOV. لوحة الرأس المستخدمة يوفر الاستقرار غير عادية من زرع التصوير التقليل من القطع الأثرية الحركة حتى في الحيوانات تتحرك بنشاط على حلقة مفرغة. لوحة الرأس صغيرة وخفيفة ، مما يسبب الحد الأدنى من عدم الراحة للحيوانات ، ويظل مستقرا لعدة أشهر بعد التثبيت. كما تتوافق عملية زرع التصوير مع التصوير المتعدد الفوتون15و16و21 ويمكن دمجها مع المناظير الدقيقة22و23. كما تم استخدام زرع تصوير مماثل للتصوير متعدد الفوتون لهياكل قرن آمون الأعمق ، بما في ذلك stratum radiatum ، لاكونوز ستراتوم ، وgyrus dentate16،24،25،26،27. ومع ذلك، قد استهداف هياكل قرن آمون أعمق مع AAVs عن طريق قنية التسريب تتطلب المزيد من التحسين من النمط المصلي AAV وحجم19.
ونحن نعتقد أن البروتوكول الموصوف سيسهل الدراسات التي تهدف إلى التحقيق في نشاط الخلايا العصبية مع ارتفاع دقة الصدغية في قرن آمون من الفئران behaving باستخدام بسيطة وبأسعار معقولة واحد فوتون التصوير الاجهزة.

الحصين هو منطقة الدماغ الرئيسية المسؤولة عن التعلم والذاكرة1 وكذلك للملاحة المكانية2. ويرتبط ضمور فرس النهر مع الاضطرابات العصبية والنفسية التي تنطوي على فقدان الذاكرة والتدهور المعرفي3,4,5. في الفئران، قرن آمون هو نموذج راسخ جدا لدراسة المكانية والسياقية، والتعلم النقابي وتكوين الذاكرة على مستويات الخلوية والشبكة4،5. تتطلب الدراسات الميكانيكية للتعلم والذاكرة استجوابا طوليا للبنية العصبية والوظيفة في سلوك الفئران. التصوير الفلوري في تركيبة مع المجسات المشفرة وراثيا6 يوفر قدرات غير مسبوقة لتسجيلدينامياتالجهد الغشاء 7،8، عابري الكالسيوم9، والتغيرات الهيكلية10 على مجموعات فرعية كبيرة من الخلايا العصبية intravitally. ومع ذلك ، يتم إعاقة الوصول البصري إلى قرن آمون في الفئران من قبل القشرة ، والتي يمكن أن تصل إلى أكثر من 1 مم في السماكة. هنا ، وصفنا إجراء لتجميع جهاز تصوير مصنوع خصيصا وزرعه المزمن في رأس الماوس للوصول البصري على المدى الطويل إلى منطقة CA1 دون الإقليمية في قرن آمون الظهري في الفئران behaving. ضخ cannula متكاملة في زرع التصوير يسمح إدارة الفيروسات أو الأدوية مباشرة على الخلايا العصبية في مجال الرؤية. الإعداد الموصوف في تركيبة مع المجهر واسعة المجال تمكن التصوير المتكرر للمجموعات الفرعية الكبيرة من الخلايا العصبية في الفئران تتصرف على مدى فترات طويلة من الزمن. لقد استخدمنا هذا الإعداد للتعبير عن مؤشرات الكالسيوم والجهد المشفرة وراثيا في منطقة فرس النهر CA1 عن طريق الحقن المستهدف للفيروس المرتبط بال أدينو المؤتلف (rAAV) لتسجيلات نشاط الخلايا العصبية بدقة خلية واحدة. كما قمنا بتصوير الكالسيوم الطولي للمجموعات الفرعية العصبية المقابلة بدقة عالية في سلوك الحيوانات. بالإضافة إلى ذلك ، يتوافق هذا الإعداد مع المجهر متعدد الفوتون والتنظير الدقيق ، وبالتالي توسيع مجموعة أدوات تقنيات التصوير لدراسة شبكات الخلايا العصبية على المستويات الخلوية ودون الخلوية في الفئران behaving. وصفنا الخطوات الهامة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للبروتوكول. كما ناقشنا المزالق والقيود المحتملة للطريقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Deckgl&#228;ser</td>
			<td>72296-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denture&#160;base resin</td>
			<td>ShangHai New Centery Dentel Material</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Type I, self-solidifying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dummy Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62102</td>
			<td>OD 0.30mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62003</td>
			<td>26G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Fork</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Cannula</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62203</td>
			<td>&#160;0.30*0.14 (OD*ID, mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBond C&#38;B</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SuperBond C&#38;B kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill Kit</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-cured Adhesive</td>
			<td>NORLAND PRODUCTS</td>
			<td>NOA 60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice

تصوير الأنشطة العصبية في قرار خلية واحدة في الحيوانات يتصرف مستيقظا هو نهج قوي جدا للتحقيق في وظائف الدائرة العصبية في نظم علم الأعصاب. ومع ذلك، فإن ارتفاع امتصاص وتناثر الضوء في أنسجة الثدييات يحد من التصوير داخل الجسم في الغالب إلى مناطق الدماغ السطحية، مما يترك مناطق الدماغ العميق، مثل قرن آمون، بعيدة المنال لإجراء المجهر البصري. في هذا الفيديو، نعرض إعداد وزرع نافذة التصوير المصنوعة خصيصا لتمكين التصوير المزمن في الجسم الحي لمنطقة فرس النهر الظهري CA1 في الفئران التي تتصرف بشكل ثابت. يتم استكمال النافذة المصنوعة خصيصا بقنية ضخ تسمح بالتسليم المستهدف لناقلات الفيروس والأدوية إلى منطقة التصوير. من خلال الجمع بين هذا الإعداد والتصوير على نطاق واسع المجال، قمنا بتسجيل طويل الأجل لنشاط الخلايا العصبية باستخدام مؤشر الكالسيوم الفلوري من مجموعات فرعية كبيرة من الخلايا العصبية في الفئران behaving على مدى عدة أسابيع. كما أظهرنا إمكانية تطبيق هذا الإعداد للتصوير الجهد مع قرار ارتفاع واحد. سمحت المؤشرات المشفرة وراثيا عالية الأداء لنشاط الخلايا العصبية وكاميرات CMOS العلمية بالتصور المتكرر للتفاصيل المورفولوجية دون الخلوية للخلايا العصبية الفردية بدقة زمنية عالية. كما نناقش مزايا والقيود المحتملة للطريقة الموصوفة وتوافقها مع تقنيات التصوير الأخرى.

في تصوير الجسم الحي للنشاط العصبي باستخدام مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا. في المتوسط ، يبدأ التصوير في الجسم الحي بعد 3-4 أسابيع من الزرع إذا تم تحقيق مستوى كاف من التعبير المتحول. بحلول هذا الوقت ، عادة ما يتم حل الوذمة الدماغية والنزيف تماما ، ويمكن ملاحظة الأوعية الدموية في الدماغ بسهولة من خلال النافذة البصرية. هنا استخدمنا الإعداد الموصوف لأداء التسجيلات المتكررة للنشاط العصبي في منطقة فرس النهر الظهري CA1 في تصرف الفئران تحت المجهر الفلوري واسع المجال. لتسجيل نشاط الخلايا العصبية، استخدمنا مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا مشرق، واسمه NCaMP713،والذي يظهر حساسية الكالسيوم مماثلة والقرار الزمني لتلك التي GCaMP6s14. للتعبير عن مؤشر NCaMP7 في قرن آمون، حقننا فيروس rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 باستخدام قنية التسريب وبدأنا تصوير خط الطول في 14 يوما بعد الحقن. لتسجيل نشاط الخلايا العصبية، استخدمنا عدسة هدف الهواء 10x NA 0.3 وكاميرا هاماماتسو أوركافوسيون SCMOS التي سمحت بالتصوير عند ~1.5x1.5 مم FOV بتردد يصل إلى 100 هرتز. كانت الفلورسينس الخضراء متحمسة من خلال LED 470 نانومتر متاح تجاريا باستخدام مجموعة فلتر GFP قياسية. متوسط عمق التصوير الذي تحقق في القناة الخضراء حوالي 50-120 ميكرومتر ، والذي يسمح بتسجيل نشاط الخلايا العصبية بشكل رئيسي في طبقة الأوريان والطبقات الهرمية. يمكن أن يصل عمق التصوير في القنوات القريبة من الأشعة تحت الحمراء إلى 200 ميكرومتر للوصول إلى الطبقات الأعمق من قرن آمون8. وكان متوسط وقت التسجيل لكل FOV 6-12 دقيقة، على الرغم من أن جلسات التصوير أطول بكثير ممكنة كما يتميز NCaMP7 من قبل phototability عالية للغاية ولوحظت أي سمية ضوئية يمكن الكشف عنها (الشكل 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig06.jpg"> الشكل 6:تسجيل النشاط العصبي في الخلايا العصبية فرس النهر باستخدام مضان أخضر مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا. (أ) FOV مختارة صورت تحت المجهر الفلوري واسعة المجال في القناة الخضراء. (ب) 15 ROIs المقابلة للخلايا العصبية واحد هو مبين في A واختار باستخدام إسقاط الانحراف المعياري للتسجيل كله. (ج) ممثل مضان آثار تجربة واحدة من الخلايا العصبية المختارة 15 في B. (D)عرض ممثل التكبير في 2 آثار الكالسيوم هو مبين في مربعات اللون المقابلة هو مبين في شريط مقياس C. ، 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig06large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
للحصول على آثار الفلورية ، تم تقسيم المناطق ذات الاهتمام (ROIs) المقابلة ل somas العصبية يدويا وتحليلها بواسطة برنامج ImageJ. قبل تصحيح حركة تحليل الصور ، لم تكن هناك حاجة إلى إجراءات شائعة بعد التسجيل في الحيوانات المستيقظة لأن مجموعات البيانات المكتسبة لم تعرض القطع الأثرية للحركة بسبب الاستقرار العالي لزرع التصوير. يتم تقديم تسجيل بصري تمثيلي لتجربة واحدة لأنشطة الخلايا العصبية من قرن آمون في فأر يتصرف مستيقظا في الشكل 6. 15 تم اختيار ROIs المقابلة لs somas الخلايا العصبية يدويا من نفس FOV هو مبين في الشكل 6B، وتظهر آثار مضان تجربة واحدة داخل كل عائد الاستثمار في الشكل 6C. ويبين الشكل 6D جزأين تمثيليين من آثار الفلورسينس من اثنين من ROIs مختلفة. قمنا بإجراء 4 جلسات تصوير متتالية لنفس FOV مع فترات 3 أيام. كان من الممكن تحديد وتصوير نفس الخلايا العصبية في بعض FOVs لمدة أسبوعين على الأقل (لم يتم إجراء جلسات تصوير أطول لهذه الدراسة ، ومع ذلك ، تم استخدام نفس التحضير لدراسة تصوير تصل إلى 6 أشهر في الفئران سابقا7؛ الشكل 7). في هذه الدراسة، استخدمنا AAV / DJ-CAG ناقلات، الذي كان يقود تعبيرا قويا عن جين الفائدة حتى بعد 21 يوما من تسليم الفيروس(الشكل التكميلي 1). التعبير المستمر معقدة على المدى الطويل تحديد نفس الخلايا العصبية بسبب زيادة خلفية مضان وظهور الخلايا العصبية الجديدة التي تعبر عن مؤشر الكالسيوم. لذلك ، يجب أن يكون اختيار النمط المصلي AAV والمروج لدفع التعبير الجيني المستهدف أحد الاعتبارات الهامة أثناء التصميم التجريبي على وجه الخصوص إذا كان التصوير الطولي لنفس المجموعة الفرعية من الخلايا العصبية مطلوبا. تسمح جودة التصوير بحل التشعبات القريبة وكذلك تصور الأوعية الدموية.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig07v2.jpg"> الشكل 7: تسلسل صورة من أربعة FOVs مختلفة من منطقة فرس النهر تتبع أكثر من 12 يوما. تم زرع الحيوان مع النافذة في اليوم 0 وتم حقنه بفيروس rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 في اليوم السابع. تشير رؤوس الأسهم إلى الخلايا العصبية التي تم تعقبها داخل FOV. أشرطة المقياس: 80 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig07large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
في التصوير الحي للنشاط العصبي باستخدام جهاز استشعار الجهد المشفرة وراثيا. في هذه الدراسة، استخدمنا أيضا جهاز استشعار الجهد المشفرة وراثيا رواية، واسمه SomArchon7،والذي يسمح للتصوير الجهد مع خلية واحدة واحد ارتفاع القرار في سلوكالحيوانات 7،8. للتعبير عن SomArchon ، حقننا فيروس rAAV / DJ-CAG-SomArchon باستخدام قنية التسريب وأجرينا تصوير الجهد في فأرة سلوك ثابتة الرأس بعد عدة أيام من الحقن. لتسجيل نشاط الخلايا العصبية، استخدمنا عدسة 40x NA 0.8 الهدف وكاميرا هاماماتسو أوركافوسيون SCMOS التي سمحت لنا بتصوير 150x40 ميكرومتر FOV بمعدل اكتساب يصل إلى 830 هرتز. يمكن تصوير بروتين GFP ، الذي هو جزء من بناء SomArchon لتسهيل تصور التعبير في النطاق المرئي للطيف ، بسهولة في القناة الخضراء (الإثارة LED عند 470/20 نانومتر ، الانبعاثات 525/50 نانومتر) لتحديد الخلايا ذات الأهمية للتصوير الجهد. تم إجراء تسجيلات الجهد البصري في قناة الأشعة تحت الحمراء القريبة (الإثارة بالليزر 637 نانومتر في 3.4 واط / ملم2، الانبعاثات 665 نانومتر تمريرة طويلة) مع 4 × 4 binning بمعدل اكتساب 830 هرتز. سجلنا النشاط العفوي للخلية العصبية فرس النهر في فأر مستيقظا مع متوسط SNR من 7 لكل عمل المحتملة (الشكل 8). 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig08.jpg"> الشكل 8: تسجيل النشاط العصبي في الخلايا العصبية فرس النهر باستخدام مضان الأشعة تحت الحمراء القريبة من مؤشر الجهد المشفرة وراثيا SomArchon. (أ)FOV مختارة مصورة تحت المجهر الفلوري واسع المجال في قناة الأشعة تحت الحمراء القريبة. (ب) تتبع مضان تجربة واحدة من الخلايا العصبية في A. (C) عرض ممثل التكبير في تتبع الجهد في المربع المقابل هو مبين في شريط مقياس B. : 25 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig08large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
علم الأنسجة بعد إجراء دراسة التصوير الوظيفي ، يتم استخدام تحليل ما بعد الوفاة لتأكيد الموضع الصحيح للزرع ، ومنطقة التعبير عن الفيروس ، وتوطين بروتين ذي أهمية في الخلايا العصبية المصورة. للتحقق النسيجي من التعبير عن الفيروس ووضع الزرع، تم فحص المقاطع التاجية من الدماغ الثابت PFA تحت المجهر الفلوري واسع المجال(الشكل 9A، C). تم استخدام مجهر كونفوجكال للحصول على صور عالية الدقة للخلايا العصبية الفردية التي تعبر عن مؤشر الكالسيوم ، وكذلك مؤشر الجهد(الشكل 9B، D). تم استخدام تلطيخ DAPI لتصور مورفولوجيا العام لشريحة الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم شرائح الدماغ باستخدام الكيمياء المناعية للتحقق من الإصابة بخلايا الأستروغليز أو الدبقية الناجمة عن زرع النافذة والتعبير الفيروسي. أظهرت دراساتنا السابقة أن الإجراء لم يحفز جليوسيس ملحوظ7.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig09.jpg"> الشكل 9: التحقق النسيجي من موضع النافذة البصرية والتعبير عن الفيروس. (أ) صورة فلورية تمثيلية لشريحة الدماغ القسم التاجي تظهر موضع النافذة البصرية من الماوس NCaMP التعبير. شريط المقياس: 1 مم (B) صورة كونفوجكال تمثيلية للخلايا العصبية تعبر عن مؤشرات NCaMP7. شريط المقياس: 25 ميكرومتر (C) صورة مضانة تمثيلية لشريحة الدماغ القسم التاجي تظهر موضع النافذة البصرية من فأرة التعبير عن SomArchon. شريط المقياس: 1 مم (D) صورة كونفوجكال تمثيلية للخلايا العصبية تعبر عن مؤشرات SomArchon. شريط المقياس: 25 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig09large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي 1:التحليل الكمي لشدة الفلورسينس النسبية جنبا إلى جنب مع وقت التعبير. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice at JoVE.com

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

توضح هذه المقالة إعداد نافذة تصوير مصنوعة خصيصا تكملها قنية التسريب وزرعها على منطقة CA1 في قرن آمون في الفئران.

إجراء استئصال القحف لتصور الأنشطة العصبية في قرن آمون من الفئران Behaving

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

يا رفاق، اسمي وانغ يانغدونغ، وأنا من مختبر الدكتور كيريل بياتكيفيتش للهندسة الحيوية الجزيئية في جامعة ويستليك. اليوم، سأريك الإجراء لتصوير أنشطة الخلايا العصبية من قرن آمون في الفئران، في الجسم الحي. قم بتشغيل آلة اللحام وسخنيها إلى درجة الحرارة المطلوبة.ضبط موقف قنية التصوير وقنية الحقن باستخدام يد العون كما هو مبين في الشكل. باستخدام الحقنة مع الإبرة، وتطبيق كمية صغيرة من النوع المناسب من تدفق على البقع اتصال بين التصوير وحقن القنية لمدة خمس ثوان، ومن ثم إزالة القطيرات. جبل لحام القصدير وتطبيقه على بقعة اتصال تعامل مع تدفق.تجنب زيادة القصدير لحام لأنها سوف تتطلب أكبر الجمجمة لا لزوم لها لجعل أثناء الجراحة. انتظر القصدير لحام لتهدئة. عادة، يستغرق عدة ثوان.تأكد من عدم حظر قنية الحقن عن طريق إدخال القنية الوهمية من كلا الاتجاهين. تطبيق الأشعة فوق البنفسجية علاج لاصق بصري على الجانب السفلي من قنية التصوير باستخدام مسواك أو إبرة حقنة قياس 26. استخدام ملاقط غرامة لوضع بعناية غطاء الزجاج من حجم المقابلة لقنية التصوير.علاج لاصق لمدة ساعة على الأقل عن طريق إضاءة الأشعة فوق البنفسجية من مصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة القياسية. تخدير الماوس مع isoflurane وفقا للإجراءات المعتمدة IACUC. ضع الماوس في إطار ستيريوتاكسيك على لوحة التدفئة الجراحة.قم بتأمين الرأس بقضبان الأذن. دفع الرأس قليلا في جميع الاتجاهات للتأكد من تأمين الرأس بحزم. ضعي مرهم العين لمنع جفاف عيون الحيوان أثناء الجراحة.استخدم كريم التشذيب أو مزيل الشعر لإزالة الفراء من الجزء الخلفي من الرقبة حتى العينين. تعقيم الموقع الجراحي مع بيتادين تليها 70٪ الإيثانول ثلاث مرات قبل إجراء شق. إزالة الجلد على الجزء العلوي من الجمجمة، بدءا من قطع الأفقي في جميع أنحاء قاعدة الرأس، تليها قطعتين في الاتجاه الوردي، والوصول تقريبا الجفون.ثم اثنين من التخفيضات المائلة التي تتلاقى في منتصف الخط. مع مسحتين من القطن المعقم ، تراجع عن النسيج الرابط ، وكذلك عضلات الجزء الخلفي من الرقبة إلى حواف الجمجمة. تطبيق قطرة من محلول الليدوكائين على سطح periosteum لمدة دقيقتين لتجنب الألم المفرط.كشط بلطف كامل المنطقة المكشوفة من الجمجمة مع مشرط لخلق سطح جاف وخام. ضع طرف الإبرة على لامبدا لمعرفة ما إذا كان تنسيق AP صفرا لتأكيد أن موضع الرأس عمودي ، وكذلك إذا كان تنسيق ML صفرا ، لتأكيد وضع الرأس أفقيا. إذا لم يكن الأمر كذلك، قم بضبط مقابض المراسل على المحطة المجسمة حتى تكون إحداثيات AP و ML على حد سواء ضمن 0.1 ملليمتر.تحريك غيض من الإبرة للعثور على النقاط المقابلة لاستئصال القحف ووضع علامة على مواقفها على الجمجمة، وذلك باستخدام علامة غرامة. رسم دائرة على أساس أربع نقاط ملحوظ، فضلا عن الخطوط العريضة لمنطقة قنية الحقن على الجانب القنية من الدائرة. استخدم مثقاب هوائي بسرعة 10,000 طلقة في الدقيقة للحفر برفق على طول المخطط المحدد على الجمجمة.حفر الجمجمة حتى يتم ترك طبقة رقيقة جدا من العظام، والتي عادة ما يبدأ في تذبذب تحت لمسة لطيف في المركز. تطبيق قطرة من برنامج تلفزيوني عقيمة إلى مركز استئصال القحف. رفع رفرف العظام من الجمجمة مع ملقط يميل رقيقة جدا أو اثنين من الإبر قياس 26 تقترب منه من الجانبين المعاكس.تطبيق برنامج تلفزيوني تليها تطلعات لطيف، من خلال إبرة قياس 26 حادة عدة مرات لتنظيف سطح دورا. تطبيق شفط لطيف ل ablate القشرة وكذلك كالوسوم كوربوس فوق قرن آمون. القشرة غالبا ما تكون أكثر اصفرارا من كوربوس كالوسوم.و(كوربوس كالوسوم) عادة ما يكون أوسع من قرن آمون الى جانب ذلك ، فإن كوربوس كالوسوم من السهل حقا التمييز بين الألياف العصبية تسير في الاتجاهات الرأسية والأفقية عند ملاحظتها من الأعلى. النزيف في هذه المرحلة سيؤثر على رؤية أنسجة الدماغ في عملية استئصال القحف.تطبيق برنامج تلفزيوني، تليها شفط لطيف، بينما كنت سبيرينج القشرة للتخلص من الدم، يمكن التعرف على كوربوس كالوسوم من خلال اتجاه الألياف البيضاء كما هو مبين تخطيطيا في الرسم البياني. إزالة الألياف كالوسوم كوربوس طبقة طبقة عن طريق تطبيق شفط لطيف في حركة دائرية. يتم تطبيق برنامج تلفزيوني باستمرار للتخلص من تراكم الدم فوق أنسجة الدماغ المكشوفة.أدخل الغرسة برفق في عملية استئصال القحف. اضغط بقوة على رأس الغرسة مع إبرة على شكل حرف L لوضع النافذة البصرية للزرع في أقرب وقت ممكن إلى السطح المكشوف من قرن آمون. تطبيق برنامج تلفزيوني مرارا وتكرارا على ندبة حول زرع، تليها شفط لإزالة الدم قدر الإمكان أثناء زرع الإدراج.ضعي طبقة رقيقة من الفقمة السريعة بين الغرسة والجمجمة لمنع أسمنت الأسنان من الاختراق تحت الجمجمة. بمجرد شفاء الختم السريع ، ضع رابطة فائقة بالتساوي على سطح الجمجمة وسطح الختم السريع وسطح الغرسة. مرة واحدة يتم علاج السندات السوبر، وتطبيق الراتنج قاعدة طقم الأسنان فوق السندات السوبر، فضلا عن الجلد حول شق المحرز في بداية الجراحة.بعد علاج راتنج قاعدة طقم الأسنان ، ضع لوحة الرأس على الراتنج حول الغرسة وجعلها تركز مع قنية التصوير. تطبيق المزيد من الراتنج قاعدة طقم الأسنان حول وفوق لوحة الرأس لإصلاح موقفها. دعه يشفي لعدة دقائق.تجنب بناء طبقة سميكة من الاسمنت حول القنية لضمان وصول أفضل إلى نافذة التصوير هو العدسة الهدف. تمييع الراتنج قاعدة طقم الأسنان لتقليل لزوجته، مما يسمح لها لملء التجاويف التي يصعب الوصول إليها مع قضيب. ضع شريط مطاطي معزول بلطف فوق النافذة لحماية النافذة من التلوث المحتمل من النطاقات الحيوانية.إضافة سريع الأخضر صبغ الأسهم حل حل الفيروس تمييعه إلى titer المطلوب في نسبة 1-9، في أنبوب PCR. سحب 600 نانو لتر من محلول الفيروس، وإزالة قنية وهمية وإدراج القنية الداخلية توصيله إلى حقنة الحقن في قنية دليل. غرس الفيروس بسرعة 15 نانو لتر في الدقيقة الواحدة، لمدة 10 دقائق في المجموع.الحفاظ على القنية الداخلية متصلة لمدة 10 دقائق للسماح للفيروس بالانتشار تحت النافذة. إزالة بلطف القنية الداخلية من قنية دليل وتلخيص ذلك مع قنية وهمية. حث الماوس مع 4٪ isoflurane لبضع دقائق.إصلاح لوحة الرأس إلى شوكة الرأس، ومن ثم إصلاح شوكة الرأس إلى حلقة مفرغة. استخدم عدسة موضوعية منخفضة التكبير للعثور على أفضل عرض لتصفية التصوير الوظيفي. ثم، قم بالتبديل إلى عدسة موضوعية أعلى لتسجيل الأنشطة العصبية بدقة خلية واحدة.لتصوير الكالسيوم، كان الفلورسنت الأخضر متحمسا من خلال 470 نانومتر LED متوفر تجاريا باستخدام إحساس فلتر GFP قياسي. للحصول على آثار الفلورسنت، تم تقسيم المناطق ذات الاهتمامات، المقابلة لكتلة الخلايا العصبية يدويا وتحليلها من قبل برنامج ImageJ. لتصوير الجهد باستخدام 40 X عدسة تسجيلات الجهد البصري تم تنفيذها في قناة الأشعة تحت الحمراء القريبة في 830 معدلات اكتساب هيرتز.استمر تسجيل النشاط العصبي التلقائي بشكل مستمر لمدة تصل إلى 25,000 إطار. هنا، ونحن نصف طريقة للتصوير على المدى الطويل من قرن آمون كمنطقة A1 في سلوك الفئران. وتستند هذه الطريقة على زرع المزمن.الآن نافذة التصوير حسب الطلب ، والتي تمكن أيضا الإدارة المستهدفة للفيروسات أو الأدوية مباشرة إلى الخلايا العصبية ذات الاهتمام. ونحن نعتقد أن البروتوكول الموصوف سيسهل الدراسات التي تهدف إلى التحقيق في نشاط الخلايا العصبية مع ارتفاع الدقة الزمنية المكانية في قرن آمون من الفئران behaving باستخدام بسيطة وبأسعار معقولة 1 فوتون التصوير المنبثقة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

نظام آلي بالكامل وذات استخدامات متعددة لاختبار متعدد الوظائف المعرفية وتسجيل أنشطة الخلايا العصبية في القوارض

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

إجراء لغرس صالحة المنظمة من Microwires للتسجيلات واحدة وحدة في استيقظ، تتصرف الحيوانات

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

تسجيلات في وقت واحد على المدى الطويل في مرحلتين العصبية في معالجة يتصرفون نحل العسل

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

إجراء حج القحف الجانبي الكبير ل ميسوسكيل التصوير البصري الميداني واسعة النطاق من نشاط الدماغ

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice

تسجيل الطباعة الداخلي لقياس النوم في الفئران

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

أوبتوجينيتيك الرائعة للذبذبات ثيتا هيبوكامبال في التصرف الفئران

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

تسجيل مكانياً مقيد التذبذبات في قرن آمون التصرف الفئران

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

الصراع الحسي طويلة الأجل في التصرف بحرية الفئران

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...