Name: craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice
Uploaded: 2021-07-24T14:00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice at JoVE.com

Wir danken allen Mitgliedern der Molecular BioEngineering Group an der Westlake University für die Hilfe und die nützliche Diskussion. Wir danken auch Jinze Li und Jie-Min Jia von der Westlake University für die Hilfe beim Filmen des chirurgischen Eingriffs.
Diese Arbeit wurde durch Eine Anschubfinanzierung der Foundation of Westlake University, den BBRF Young Investigator Grant 2020 und den Zuschuss der National Natural Science Foundation of China 32050410298 alle an K.D.P.

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+neurons+with+stable+excitatory+connectivity+become+part+of+neuronal+representations.">Hippocampal neurons with stable excitatory connectivity become part of neuronal representations.</a> PLOS Biology. 18 (11), 3000928 (2020).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Langzeitbildgebung der Hippocampus CA1-Region bei sich verhaltenden Mäusen. Die Methode basiert auf der chronischen Implantation eines maßgeschneiderten Bildgebungsfensters, das auch die gezielte Verabreichung von Viren oder Medikamenten direkt an die interessierenden Neuronen ermöglicht. Das vorliegende Protokoll besteht aus vier Hauptteilen: i) Montage des bildgebenden Implantats; ii) Installation eines bildgebenden Implantats; iii) Virusinjektion über bildgebendes Implantat; iv) funktionelle Bildgebung bei sich verhaltenden Mäusen. Im Folgenden beschreiben und diskutieren wir kritische Schritte im Protokoll, die Fehlerbehebung, Änderungen und Einschränkungen der Methode. Wir diskutieren auch die Bedeutung der Methode und ihre möglichen alternativen Anwendungen.
Es gibt mehrere kritische Schritte im beschriebenen Protokoll, die für eine erfolgreiche Operation ziemlich wichtig sind: (i) Vorbereitung eines hochwertigen bildgebenden Implantats; ii) sterile chirurgische Bedingungen; iii) Aspiration des Kortex; iv) genaue Platzierung des bildgebenden Implantats; v) Virusinjektion. Wie Schritt 1.6 zeigt, würde überschüssiges Lötzinn eine größere Kraniotomie erfordern und somit das Entzündungsrisiko erhöhen. Es ist auch sehr wichtig, eine angemessene Menge des adhäsiven optischen Klebstoffs zu verwenden, wenn das Deckglas an der bildgebenden Kanüle befestigt wird, wie in Schritt 1.11 angegeben, da eine unzureichende Menge dazu führen kann, dass Zerebrospinalflüssigkeit in die bildgebende Kanüle austritt und diese undurchsichtig macht. Auf der anderen Seite kann überschüssiger optischer Klebstoff zu einer verminderten Transparenz des Glasfensters führen. Eine mögliche Kontamination des bildgebenden Implantats kann zu einer aktiven Proliferation von Bindegewebe unter dem optischen Fenster und/oder zu schweren Entzündungen führen, die zu einem vorzeitigen Abbruch des Experiments führen. Daher ist die bildgebende Implantation und Vorbereitung vor der Operation fast so wichtig wie der chirurgische Eingriff selbst.
Während der Operation wird der Teil des Kortex unter Kraniotomie durch sanfte Aspiration abgetragen, was zu unvermeidlichen Blutungen führt. Blut an der Operationsstelle reduziert signifikant die Sichtbarkeit des Hirngewebes, das entfernt werden muss. Dies erschwert die genaue Beurteilung der erforderlichen Gewebeablationstiefe. Eine sorgfältige Spülung der Operationsstelle mit PBS jedes Mal vor dem Absaugen, um den nächsten Teil des Gewebes zu entfernen, sorgt für eine bessere Kontrolle der Tiefe. Das Hirngewebe sollte immer in kleinen Portionen Schritt für Schritt entfernt werden, um die Tiefe des abgetragenen Gewebes zu bestätigen, bevor mit mehr Absaugung fortgefahren wird. Eine feinere Kontrolle der Absaugung kann auch mit einer dünneren stumpfen Nadel erreicht werden. Wir empfehlen die Verwendung einer 26-G-Nadel, jedoch ist ein Durchmesser von weniger als 26 G anfälliger für Verstopfungen. Darüber hinaus erfordert es in der Regel viel Übung, um die genaue Tiefe der Aspiration zu bestimmen, die für jedes Tier erforderlich ist, da die Farbe des Kortex, des Corpus callosum und des Hippocampus von Maus zu Maus variieren kann (Abbildung 3).
Das Einsetzen und Sichern des bildgebenden Implantats sollte sehr präzise erfolgen, um eine möglichst nahe Position des Bildgebungsfensters zur dorsalen Oberfläche des Hippocampus zu gewährleisten. Die Größe der vorbereiteten Kraniotomie sollte eng mit dem Implantat übereinstimmen und sein Einsetzen ohne nennenswerten Widerstand ermöglichen. Gleichzeitig sollte es keine sichtbare Lücke zwischen dem Schädel und dem Implantat geben, um eine ordnungsgemäße Abdichtung zu gewährleisten und eine Exposition des Gehirngewebes zu vermeiden. Während der Versiegelung des Schädels sollte ein sanfter und stabiler Druck auf die Oberseite des Implantats ausgeübt werden. Es ist fast unvermeidbar, während der Implantatinstallation Blut unter dem Bildgebungsfenster zu haben. Wenn der chirurgische Eingriff richtig durchgeführt wird, sollte sich das Fenster in 3-7 Tagen aufräumen und das Gefäßsystem des Gehirns wird deutlich sichtbar. Es ist auch wichtig sicherzustellen, dass der Virus ordnungsgemäß unter das Fenster injiziert wird. Im Falle eines fehlgeschlagenen Ausdrucks kann der Virus mehrmals neu ausgelöst werden.
Die Hauptkomplikation, auf die wir in einigen Fällen gestoßen sind, ist die eingeschränkte Sichtbarkeit des Bildgebungsfensters. Es gibt mehrere mögliche Gründe für eine schlechte Bildqualität: i) anhaltende Entzündung; ii) Auswachsen von Bindegewebe auf dem Glas; iii) große Lücke zwischen Fenster und Hippocampus. Entzündungen werden in der Regel durch Kontamination während der Operation oder durch nicht ordnungsgemäß sterilisierte bildgebende Implantate verursacht. Wir empfehlen, die chirurgischen Instrumente vor und nach jeder Operation zu autoklavieren, den Operationsbereich direkt vor dem Eingriff zu desinfizieren und während der Operation eine saubere persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Bildgebende Implantate sollten nach der Montage gereinigt, sterilisiert und unter sterilen Bedingungen gelagert werden. Das Auswachsen von Bindegewebe auf dem Glas des bildgebenden Implantats kann auf eine mechanische Kontamination auf der Oberfläche des Glases oder ein übermäßiges Trauma des Hirngewebes während der Kortexablation zurückzuführen sein. Nach der Montage des Implantats ist es wichtig zu bestätigen, dass die Glasoberfläche sauber und glatt ist. Außerdem müssen alle Teile des beschädigten Hirngewebes sorgfältig entfernt werden, bevor das bildgebende Implantat in die Kraniotomie eingesetzt wird. In bestimmten Fällen führt die Lücke zwischen dem Glasfenster und dem Hippocampus zur Ansammlung von Zerebrospinalflüssigkeit, was die Qualität der Bildgebung verringert. Daher ist es bei der Implantation wichtig, es ganz einzusetzen, um einen guten Kontakt zwischen Hippocampus und Glasfenster zu gewährleisten. Manchmal ist es schwierig, den genauen Grund für das undurchsichtige Imaging-Fenster zu identifizieren. Wir empfehlen, eine Post-Mortem-Analyse durchzuführen, um die Bedingungen unter dem optischen Fenster aufzudecken und nachfolgende Operationen entsprechend anzupassen.
Die Methode weist mehrere grundlegende und technische Einschränkungen auf, die vor und während der In-vivo-Bildgebung berücksichtigt werden sollten. Eine der Haupteinschränkungen ist die Kortexablation. Ein Teil des visuellen und sensorischen Kortex wird während der Operation entfernt. Während es schwierig ist, die Auswirkungen der Kortexablation genau zu bewerten, da entferntes Hirngewebe nicht direkt auf den Hippocampus projiziert wird, zeigten mehrere Studien keine merkliche Beeinträchtigung des hippocampusabhängigen Lernens oder anderer relevanter Hippocampus-Funktionen15,16. Die optischen Einschränkungen sollten ebenfalls berücksichtigt werden, insbesondere wenn Objektive mit hohem NA-Objektiv verwendet werden. Zum Beispiel haben wir in dieser Studie eine 1,75 mm lange Kanüle mit einem Innendurchmesser von 1,9 mm verwendet. Die Geometrie dieser Kanüle bewahrt nicht den vollen NA des Luftobjektivs mit NA mehr als ~ 0,5 oder das Wasserobjektiv mit NA mehr als ~ 0,6, da es etwas Licht abschneiden wird. Eine weitere Einschränkung, die für alle bildgebenden Implantate des Gehirns üblich ist, ist, dass ein Teil des Gehirns exponiert wird, wodurch der Wärmeverlust gefördert wird17,18. Die physiologische Gehirntemperatur kann jedoch während der Bildgebung durch Durchblutung eines warmen Puffers leicht wiederhergestellt werden.
Das beschriebene Verfahren kann leicht modifiziert oder für andere Anwendungen angepasst werden. Beispielsweise kann das Präparat für die Bildgebung von Striatum7angepasst werden. Da das Striatum etwas tiefer liegt als der Hippocampus, sollte die längere bildgebende Kanüle für die Montage des bildgebenden Implantats verwendet werden. Wir empfehlen die Verwendung von 2,0 mm Bildkanüle. Die Koordinaten der Kraniotomie sollten entsprechend angepasst werden (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Darüber hinaus ermöglicht die Virusinjektion über Infusionskanüle die Expression eines Transgens in einer dünnen Schicht von Neuronen bei Verwendung des AAV-Serotyps mit eingeschränkter Ausbreitung19,20. Es ist besonders vorteilhaft für die Ein-Photonen-Bildgebung aufgrund der reduzierten unsauzenten Fluoreszenz aus tieferen Schichten und infolgedessen einer verbesserten Einzelzellauflösung. Darüber hinaus kann die Injektionskanüle auch während der funktionellen Bildgebung zur Verabreichung von Medikamenten oder anderen Chemikalien direkt auf die Neuronen im FOV verwendet werden (Abbildung 5B). Die gesamte Infusionskanüle fügt dem bildgebenden Implantat nützliche Funktionalitäten hinzu, verbessert die Bildgebungsqualität aufgrund der gezielten Virusexpression und ermöglicht die pharmakologische Stimulation von Neuronen im FOV. Die verwendete Kopfplatte bietet eine außergewöhnliche Stabilität des bildgebenden Implantats und minimiert Bewegungsartefakte auch bei sich aktiv bewegenden Tieren auf einem Laufband. Die Kopfplatte ist klein und leicht, verursacht minimale Beschwerden für Tiere und bleibt nach der Installation mehrere Monate lang stabil. Das bildgebende Implantat ist auch kompatibel mit multiphotonenbildenden Bildgebung15,16,21 und kann mit Mikroendoskopen22,23kombiniert werden. Ein ähnliches bildgebendes Implantat wurde auch für die Multiphotonenbildgebung der tieferen Hippocampusstrukturen verwendet, einschließlich Stratum radiatum, Stratum lacunose und Gyrus dentatus16,24,25,26,27. Das Targeting der tieferen Hippocampus-Strukturen mit AAVs über Infusionskanülen kann jedoch eine weitere Optimierung des AAV-Serotyps und des Volumens19erfordern.
Wir glauben, dass das beschriebene Protokoll Studien erleichtern wird, die darauf abzielen, die neuronale Aktivität mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung im Hippocampus von sich verhaltenden Mäusen mit einfachen und erschwinglichen Ein-Photonen-Bildgebungsaufbauten zu untersuchen.

Der Hippocampus ist eine schlüsselschwere Hirnregion, die für Lernen und Gedächtnis1 sowie für die räumliche Navigation 2 verantwortlichist. Hippocampus-Atrophie ist mit neurologischen und psychiatrischen Störungen verbunden, die Gedächtnisverlust und kognitiven Verfallbeinhalten 3,4,5. Bei Mäusen ist der Hippocampus ein sehr gut etabliertes Modell zur Untersuchung des räumlichen, kontextuellen und assoziativen Lernens und der Gedächtnisbildung auf der Zell- und Netzwerkebene4,5. Die mechanistischen Studien des Lernens und des Gedächtnisses erfordern eine longitudinale Befragung der neuronalen Struktur und Funktion bei sich verhaltenden Mäusen. Die Fluoreszenzbildgebung in Kombination mit genetisch kodierten Sonden6 bietet beispiellose Möglichkeiten, die Dynamik der Membranspannung7,8, Kalziumtransienten9und strukturelle Veränderungen10 über große Untergruppen von Neuronen intravital aufzuzeichnen. Der optische Zugang zum Hippocampus bei Mäusen wird jedoch durch den Kortex behindert, der eine Dicke von über 1 mm erreichen kann. Hier beschrieben wir ein Verfahren zum Zusammenbau eines maßgeschneiderten Bildgebungsgeräts und dessen chronische Implantation in den Mauskopf für den langfristigen optischen Zugang zur CA1-Subregion des dorsalen Hippocampus bei sich verhaltenden Mäusen. Die in das bildgebende Implantat integrierte Infusionskanüle ermöglicht die Verabreichung von Viren oder Medikamenten direkt auf die Neuronen im Sichtfeld. Das beschriebene Präparat in Kombination mit der Weitfeldmikroskopie ermöglicht die wiederkehrende Abbildung der großen Untergruppen von Neuronen in sich verhaltenden Mäusen über lange Zeiträume. Wir verwendeten dieses Präparat, um kalzium- und spannungsgenaue genetisch kodierte Indikatoren in der HIPPOCAMPUS-CA1-Region durch gezielte Injektion des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) für neuronale Aktivitätsaufzeichnungen mit Einzelzellauflösung zu exprimieren. Wir führten auch eine longitudinale Kalziumbildgebung der entsprechenden neuronalen Untergruppen mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung bei sich verhaltenden Tieren durch. Darüber hinaus ist dieses Präparat mit der Multiphotonenmikroskopie und Mikroendoskopie kompatibel und erweitert so die Toolbox der bildgebenden Verfahren zur Untersuchung neuronaler Netzwerke auf zellulärer und subzellulärer Ebene in sich verhaltenden Mäusen. Wir haben kritische Schritte und die Fehlerbehebung des Protokolls beschrieben. Wir diskutierten auch die möglichen Fallstricke und Grenzen der Methode.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Deckgl&#228;ser</td>
			<td>72296-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denture&#160;base resin</td>
			<td>ShangHai New Centery Dentel Material</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Type I, self-solidifying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dummy Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62102</td>
			<td>OD 0.30mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62003</td>
			<td>26G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Fork</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Cannula</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62203</td>
			<td>&#160;0.30*0.14 (OD*ID, mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBond C&#38;B</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SuperBond C&#38;B kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill Kit</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-cured Adhesive</td>
			<td>NORLAND PRODUCTS</td>
			<td>NOA 60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice

Die Abbildung neuronaler Aktivitäten mit Einzelzellauflösung bei wachen Tieren ist ein sehr leistungsfähiger Ansatz für die Untersuchung neuronaler Schaltkreisfunktionen in den Systemneurowissenschaften. Eine hohe Absorption und Streuung von Licht im Gewebe von Säugetieren beschränkt die intravitale Bildgebung jedoch hauptsächlich auf oberflächliche Hirnregionen, so dass tiefe Hirnareale wie der Hippocampus für die optische Mikroskopie unerreichbar sind. In diesem Video zeigen wir die Vorbereitung und Implantation des maßgeschneiderten Bildgebungsfensters, um eine chronische In-vivo-Bildgebung der dorsalen Hippocampus-CA1-Region bei kopffixierten Mäusen zu ermöglichen. Das maßgeschneiderte Fenster wird durch eine Infusionskanüle ergänzt, die eine gezielte Abgabe von viralen Vektoren und Medikamenten in den Bildbereich ermöglicht. Durch die Kombination dieses Präparats mit der Weitfeldbildgebung führten wir eine Langzeitaufzeichnung der neuronalen Aktivität mit einem fluoreszierenden Kalziumindikator von großen Untergruppen von Neuronen in sich verhaltenden Mäusen über mehrere Wochen durch. Wir haben auch die Anwendbarkeit dieses Präparats für die Spannungsbildgebung mit Single-Spike-Auflösung demonstriert. Leistungsstarke genetisch kodierte Indikatoren neuronaler Aktivität und wissenschaftliche CMOS-Kameras ermöglichten die wiederkehrende Visualisierung subzellulärer morphologischer Details einzelner Neuronen mit hoher zeitlicher Auflösung. Wir diskutieren auch die Vorteile und möglichen Einschränkungen der beschriebenen Methode und ihre Kompatibilität mit anderen bildgebenden Verfahren.

In-vivo-Bildgebung der neuronalen Aktivität mit einem genetisch kodierten Kalziumindikator. Im Durchschnitt beginnt die In-vivo-Bildgebung 3-4 Wochen nach der Implantation, wenn eine ausreichende Transgenexpression erreicht wird. Zu diesem Zeitpunkt sind Hirnödeme und Blutungen in der Regel vollständig aufgelöst, und Gehirngefäße können leicht durch das optische Fenster beobachtet werden. Hier nutzten wir das beschriebene Präparat, um die wiederholten Aufzeichnungen der neuronalen Aktivität in der dorsalen Hippocampus-CA1-Region bei sich verhaltenden Mäusen unter dem Fluoreszenz-Weitfeldmikroskop durchzuführen. Um die neuronale Aktivität aufzuzeichnen, verwendeten wir einen hellen genetisch kodierten Kalziumindikator namens NCaMP713, der eine ähnliche Kalziumempfindlichkeit und zeitliche Auflösung wie GCaMP6s14aufweist. Um den NCaMP7-Indikator im Hippocampus zu exprimierenden, injizierten wir das rAAV/DJ-CAG-NCaMP7-Virus mit einer Infusionskanüle und leiteten 14 Tage nach der Injektion eine Längengradbildgebung ein. Um die neuronale Aktivität aufzuzeichnen, verwendeten wir ein 10-faches NA 0,3-Luftobjektiv und eine Hamamatsu OrcaFusion sCMOS-Kamera, die eine Bildgebung bei ~ 1,5 x 1,5 mm FOV bei bis zu 100 Hz Frequenz ermöglichte. Die grüne Fluoreszenz wurde durch eine kommerziell erhältliche 470-nm-LED mit einem Standard-GFP-Filterset angeregt. Die durchschnittliche Tiefe der Bildgebung im grünen Kanal beträgt etwa 50-120 μm, was die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität hauptsächlich in Stratum Oriens und Stratum Pyramidale ermöglicht. Die Bildtiefe in Nahinfrarotkanälen kann bis zu 200 μm bis zu den tieferen Schichten des Hippocampus8 erreichen. Die durchschnittliche Aufnahmezeit pro Sichtfeld betrug 6-12 min, obwohl viel längere Bildgebungssitzungen möglich sind, da NCaMP7 durch eine extrem hohe Photostabilität gekennzeichnet ist und keine nachweisbare Phototoxizität beobachtet wurde (Abbildung 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig06.jpg"> Abbildung 6: Aufzeichnung der neuronalen Aktivität in den Neuronen des Hippocampus unter Verwendung eines genetisch kodierten Calciumindikators für grüne Fluoreszenz. (A) Ein ausgewähltes Sichtfeld, das unter einem Weitfeldfluoreszenzmikroskop im grünen Kanal abgebildet wurde. (B) Die 15 ROIs, die den einzelnen Neuronen entsprechen, die in A dargestellt und unter Verwendung der Standardabweichungsprojektion der gesamten Aufzeichnung ausgewählt wurden. (C) Repräsentative Fluoreszenz-Einzelversuchsspuren der 15 ausgewählten Neuronen in B. (D) Eine repräsentative Zoom-in-Ansicht von 2 Kalziumspuren in entsprechenden Farbfeldern in C. Scale bar, 100 μm. Bitte klicken <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig06large.jpg" target="_blank">Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Um Fluoreszenzspuren zu erhalten, wurden die Regionen von Interesse (ROIs), die neuronalen Somen entsprechen, manuell segmentiert und von der ImageJ-Software analysiert. Vor der Bewegungskorrektur der Bildanalyse waren gängige Post-Recording-Verfahren bei wachen Tieren nicht erforderlich, da die erfassten Datensätze aufgrund der hohen Stabilität des bildgebenden Implantats keine Bewegungsartefakte aufwiesen. Eine repräsentative optische Einzelstudie zur Aufzeichnung neuronaler Aktivitäten aus dem Hippocampus in einer sich wach verhaltenden Maus ist in Abbildung 6 dargestellt. 15 ROIs, die neuronalen Somen entsprechen, wurden manuell aus demselben FOV ausgewählt, das in Abbildung 6Bgezeigt ist, und die Fluoreszenzspuren innerhalb jedes ROI in Einzelversuchen sind in Abbildung 6Cdargestellt. Abbildung 6D zeigt zwei repräsentative Teile von Fluoreszenzspuren aus zwei verschiedenen ROIs. Wir führten 4 aufeinanderfolgende Bildgebungssitzungen für dasselbe FOV mit 3-Tage-Intervallen durch. Es war möglich, die gleichen Neuronen in bestimmten FOVs für mindestens zwei Wochen zu identifizieren und abbilden (die längeren Bildgebungssitzungen wurden für diese Studie nicht durchgeführt, jedoch wurde das gleiche Präparat für bis zu 6-monatige Bildgebungsstudien an Mäusen zuvorverwendet 7; Abbildung 7). In dieser Studie verwendeten wir den AAV/DJ-CAG-Vektor, der auch 21 Tage nach der Virusabgabe eine starke Expression des interessierenden Gens antreibt (Ergänzende Abbildung 1). Die kontinuierliche Expression erschwerte die langfristige Identifizierung der gleichen Neuronen aufgrund des erhöhten Fluoreszenzhintergrunds und des Auftretens neuer Neuronen, die den Kalziumindikator exprimieren. Daher sollte die Auswahl des AAV-Serotyps und des Promotors zur Förderung der Zielgenexpression eine der wichtigen Überlegungen während des experimentellen Designs sein, insbesondere wenn eine longitudinale Bildgebung derselben Untergruppe von Neuronen erforderlich ist. Die Bildqualität ermöglichte es, proximale Dendriten aufzulösen und Blutgefäße zu visualisieren.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig07v2.jpg"> Abbildung 7: Bildsequenz von vier verschiedenen FOVs aus dem Hippocampus-Bereich, die über 12 Tage verfolgt wurden. Dem Tier wurde an Tag 0 das Fenster implantiert und an Tag 7 das rAAV/DJ-CAG-NCaMP7-Virus injiziert. Pfeilspitzen zeigen das Neuron an, das im FOV verfolgt wird. Maßstabsbalken: 80 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
In-vivo-Bildgebung der neuronalen Aktivität mit einem genetisch kodierten Spannungssensor. In dieser Studie haben wir auch einen neuartigen genetisch kodierten Spannungssensor namens SomArchon7verwendet, der eine Spannungsbildgebung mit Einzelzell-Single-Spike-Auflösung bei sich verhaltenden Tieren ermöglicht7,8. Um SomArchon auszudrücken, injizierten wir das rAAV/DJ-CAG-SomArchon-Virus mit einer Infusionskanüle und führten mehrere Tage nach der Injektion eine Spannungsbildgebung in einer kopffixierten Maus durch. Um die neuronale Aktivität aufzuzeichnen, verwendeten wir ein 40-faches NA 0,8-Objektiv und eine Hamamatsu OrcaFusion sCMOS-Kamera, mit der wir 150x40 μm FOV mit einer Erfassungsrate von bis zu 830 Hz abbilden konnten. Das GFP-Protein, das ein Teil von SomArchon konstruiert, um die Visualisierung der Expression im sichtbaren Bereich des Spektrums zu erleichtern, kann leicht im grünen Kanal abgebildet werden (LED-Anregung bei 470/20 nm, Emission 525/50 nm), um Zellen zu lokalisieren, die für die Spannungsbildgebung von Interesse sind. Optische Spannungsaufzeichnungen wurden im Nahinfrarotkanal (Laseranregung 637 nm bei 3,4 W/mm2,Emission 665 nm Long Pass) mit 4 x 4 Binning bei 830 Hz Erfassungsrate durchgeführt. Wir haben die spontane Aktivität eines Hippocampus-Neurons in einer wachen Maus mit durchschnittlichem SNR von 7 pro Aktionspotential aufgezeichnet (Abbildung 8). 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig08.jpg"> Abbildung 8: Aufzeichnung der neuronalen Aktivität in den Neuronen des Hippocampus mit einem genetisch kodierten Nahinfrarot-Fluoreszenzindikator SomArchon. (A) Ein ausgewähltes Sichtfeld, das unter einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop im Nahinfrarotkanal abgebildet wurde. (B) Einzelversuchs-Fluoreszenzspur des Neurons in A. (C) Eine repräsentative Zoom-in-Ansicht der Spannungsspur in der entsprechenden Box in B. Maßstabsbalken: 25 μm. Bitte klicken <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig08large.jpg" target="_blank">Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Histologie Nach der funktionellen Bildgebungsstudie wird die Post-mortem-Analyse verwendet, um die korrekte Platzierung des Implantats, den Bereich der Virusexpression und die Lokalisation eines Proteins von Interesse in abgebildeten Neuronen zu bestätigen. Zur histologischen Überprüfung der Virusexpression und Platzierung des Implantats wurden koronale Abschnitte des PFA-fixierten Gehirns unter einem Fluoreszenz-Weitfeldmikroskop untersucht (Abbildung 9A, C). Ein konfokales Mikroskop wurde verwendet, um hochauflösende Bilder von einzelnen Neuronen zu erfassen, die den Kalziumindikator sowie den Spannungsindikator exprimieren (Abbildung 9B, D). DaPI-Färbung wurde verwendet, um die Gesamtmorphologie der Gehirnscheibe zu visualisieren. Darüber hinaus können die Hirnschnitte mittels Immunhistochemie beurteilt werden, um Astrogliose oder Gliose durch Fensterimplantation und virale Expression zu überprüfen. Unsere früheren Studien zeigten, dass das Verfahren keine merkliche Glioseinduzierte 7.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig09.jpg"> Abbildung 9: Histologische Überprüfung der optischen Fensterposition und der Virusexpression. (A) Ein repräsentatives fluoreszierendes Bild des koronalen Abschnitts des Gehirnschnitts, das die Platzierung des optischen Fensters von einer NCaMP-exprimierenden Maus zeigt. Maßstabsbalken: 1 mm. (B) Ein repräsentatives konfokales Bild von Neuronen, die die NCaMP7-Indikatoren exprimieren. Maßstabsleiste: 25 μm. (C) Ein repräsentatives Fluoreszenzbild des koronalen Abschnitts Gehirnschnitts, das die Platzierung des optischen Fensters einer SomArchon-exprimierenden Maus zeigt. Maßstabsbalken: 1 mm. (D) Ein repräsentatives konfokales Bild von Neuronen, die die SomArchon-Indikatoren exprimieren. Maßstabsleiste: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Quantitative Analyse der relativen Fluoreszenzintensität zusammen mit der Expressionszeit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Dieser Artikel zeigt die Vorbereitung eines maßgeschneiderten Bildgebungsfensters, ergänzt mit Infusionskanüle und deren Implantation in die CA1-Region des Hippocampus bei Mäusen.

Kraniotomie-Verfahren zur Visualisierung neuronaler Aktivitäten im Hippocampus von sich benehmenden Mäusen

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Hey, Leute, mein Name ist Wang Yangdong, und ich komme von Dr. Kiryl Piatkevich molecular bio-engineering lab an der Westlake University. Heute werde ich Ihnen das Verfahren zur Abbildung neuronaler Aktivitäten des Hippocampus bei Mäusen in vivo zeigen. Schalten Sie das Schweißgerät ein und erhitzen Sie es auf die erforderliche Temperatur.Passen Sie die Position der Bildkanüle und der Injektionskanüle mit helfenden Händen an, wie in der Abbildung gezeigt. Tragen Sie mit der Spritze mit der Nadel fünf Sekunden lang eine kleine Menge geeigneter Art von Flussmittel auf die Verbindungspunkte zwischen Bildgebung und Injektionskanüle auf und entfernen Sie dann den Tropfen. Lötzinn montieren und auf die mit dem Flussmittel behandelte Verbindungsstelle auftragen.Vermeiden Sie überschüssiges Lötzinn, da es während der Operation unnötig größere Schädel erfordert. Warten Sie, bis die Lötdose abgekühlt ist. Normalerweise dauert es mehrere Sekunden.Vergewissern Sie sich, dass die Injektionskanüle nicht blockiert ist, indem Sie die Dummy-Kanüle aus beiden Richtungen einführen. Tragen Sie uv-härtenden optischen Klebstoff mit einem Zahnstocher oder einer 26-Gauge-Spritzennadel auf die Unterseite der bildgebenden Kanüle auf. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um vorsichtig ein Deckglas der entsprechenden Größe auf die Bildkanüle zu legen.Härten Sie den Klebstoff mindestens eine Stunde lang durch UV-Beleuchtung einer Standard-Handheld-UV-Lampe aus. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran nach IACUC-zugelassenem Verfahren. Platzieren Sie die Maus in einem stereotaxischen Rahmen über einem Operationsheizkissen.Befestmen Sie den Kopf mit Ohrbügeln. Drücken Sie den Kopf leicht in alle Richtungen, um sicherzustellen, dass der Kopf fest gesichert ist. Tragen Sie Augensalbe auf, um zu verhindern, dass die Augen des Tieres während der Operation austrocknen.Verwenden Sie einen Trimmer oder eine Enthaarungscreme, um das Fell vom Nacken bis zu den Augen zu entfernen. Sterilisieren Sie die Operationsstelle dreimal mit Betadin gefolgt von 70% Ethanol, bevor Sie einen Schnitt machen. Entfernen Sie die Haut über der Oberseite des Schädels, beginnend mit dem horizontalen Schnitt um die Basis des Kopfes, gefolgt von zwei Schnitten in Rostralrichtung, die fast die Augenlider erreichen.Dann zwei schräge Schnitte, die an der Mittellinie zusammenlaufen. Ziehen Sie mit zwei sterilen Wattestäbchen das Verbindungsgewebe sowie die Muskulatur des Nackens bis zu den Schädelrändern zurück. Tragen Sie einen Tropfen Lidocainlösung für zwei Minuten auf die Oberfläche des Periosts auf, um übermäßige Schmerzen zu vermeiden.Kratzen Sie vorsichtig den gesamten freiliegenden Bereich des Schädels mit einem Skalpell ab, um eine trockene und raue Oberfläche zu schaffen. Legen Sie die Nadelspitze auf den Lambda, um zu sehen, ob die AP-Koordinate Null ist, um zu bestätigen, dass die Kopfposition vertikal ist, sowie wenn die ML-Koordinate Null ist, um zu bestätigen, dass der Kopf horizontal positioniert ist. Wenn nicht, stellen Sie die entsprechenden Knöpfe an der stereotaxischen Station ein, bis die AP- und ML-Koordinaten beide innerhalb von 0,1 Millimetern liegen.Bewegen Sie die Spitze der Nadel, um die entsprechenden Punkte für die Kraniotomie zu finden, und markieren Sie ihre Positionen auf dem Schädel mit einem feinen Marker. Zeichnen Sie einen Kreis basierend auf vier markierten Punkten sowie den Umriss des Injektionskanülenbereichs auf der Kanülenseite des Kreises. Verwenden Sie einen pneumatischen Bohrer mit einer Geschwindigkeit von 10.000 Schuss pro Minute, um sanft entlang des auf dem Schädel markierten Umrisses zu bohren.Bohren Sie den Schädel, bis eine sehr dünne Knochenschicht übrig ist, die normalerweise unter sanfter Berührung in der Mitte zu wackeln beginnt. Tragen Sie einen Tropfen steriles PBS auf die Mitte der Kraniotomie auf. Heben Sie die Knochenklappe mit einer sehr dünnen Zange oder zwei 26-Gauge-Nadeln, die sich ihm von den gegenüberliegenden Seiten nähern, vom Schädel ab.Tragen Sie PBS gefolgt von sanften Abungen mehrmals durch eine stumpfe Nadel mit 26 Gauge auf, um die Oberfläche der Dura zu reinigen. Wenden Sie sanftes Absaugen an, um den Kortex sowie das Corpus Callosum über dem Hippocampus abzutragen. Cortex ist oft gelber als der Corpus Callosum.Und der Corpus Callosum ist in der Regel breiter als der Hippocampus. Außerdem ist das Corpus Callosum wirklich leicht durch neuronale Fasern zu unterscheiden, die in vertikaler und horizontaler Richtung gehen, wenn sie von oben beobachtet werden. Blutungen an diesem Punkt beeinflussen die Sichtbarkeit des Hirngewebes in der Kraniotomie.Tragen Sie PBS auf, gefolgt von einem sanften Absaugen, während Sie den Kortex absaugen, um das Blut loszuwerden, Corpus Callosum kann an der Richtung der weißen Fasern erkannt werden, wie schematisch im Diagramm gezeigt. Entfernen Sie Corpus Callosum-Fasern Schicht für Schicht, indem Sie in einer kreisförmigen Bewegung sanftes Absaugen anwenden. PBS wird ständig angewendet, um Blut loszuwerden, das sich über exponiertem Hirngewebe ansammelt.Setzen Sie das Implantat vorsichtig in die Kraniotomie ein. Drücken Sie mit der L-förmigen Nadel fest auf das Implantat, um das optische Fenster des Implantats so nah wie möglich an der freiliegenden Oberfläche des Hippocampus zu positionieren. Tragen Sie PBS wiederholt auf die Narbe um das Implantat herum auf, gefolgt von einer Absaugung, um während des Einsetzens des Implantats so weit wie möglich Blut zu entfernen.Tragen Sie eine dünne Schicht schnell zwischen Implantat und Schädel auf, um zu verhindern, dass Zahnzement unter den Schädel eindringt. Sobald die Schnellversiegelung ausgehärtet ist, tragen Sie super bond gleichmäßig auf die Oberfläche des Schädels, die Oberfläche der Schnellversiegelung und die Oberfläche des Implantats auf. Sobald die Superbindung ausgehärtet ist, tragen Sie Prothesenbasisharz über super bond sowie die Haut um den Schnitt zu Beginn der Operation auf.Nachdem das Prothesenbasisharz ausgehärtet ist, legen Sie die Kopfplatte auf das Harz um das Implantat herum und konzentrieren Sie es mit der bildgebenden Kanüle. Tragen Sie mehr Prothesenharz um und über der Kopfplatte auf, um ihre Position zu fixieren. Lassen Sie es für einige Minuten aushärten.Vermeiden Sie es, eine dicke Zementschicht um die Kanüle herum aufzubauen, um einen besseren Zugang zum Bildfenster der Objektivlinse zu gewährleisten. Verdünnen Sie das Prothesenbasisharz, um seine Viskosität zu verringern, so dass es die Hohlräume füllen kann, die mit einem Applikator schwer zu erreichen sind. Legen Sie vorsichtig ein isoliertes Gummiband über das Fenster, um das Fenster vor möglichen Verunreinigungen durch Tierbänder zu schützen.Fügen Sie fast Green Farbstoff-Stammlösung zu Viruslösung hinzu, verdünnen Sie sie in einem PCR-Röhrchen auf den gewünschten Titer im Verhältnis von eins zu neun. Ziehen Sie 600 Nanoliter der Viruslösung ab, entfernen Sie die Dummy-Kanüle und führen Sie die interne Kanüle ein, um sie mit der Injektionsspritze in die Führungskanüle zu verbinden. Infundieren Sie das Virus mit einer Geschwindigkeit von 15 Nanolitern pro Minute, insgesamt 10 Minuten.Halten Sie die interne Kanüle 10 Minuten lang verbunden, damit sich das Virus unter dem Fenster ausbreiten kann. Entfernen Sie vorsichtig die innere Kanüle von der Führungskanüle und rekapitulieren Sie sie mit der Dummy-Kanüle. Induzieren Sie die Maus mit 4% Isofluran für einige Minuten.Befestigen Sie die Kopfplatte an der Kopf gabel und befestigen Sie dann die Kopf gabel am Laufband. Verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung, um die am besten zu filterende Ansicht für eine funktionale Bildgebung zu finden. Wechseln Sie dann zu einer Objektivlinse mit höherem Objektiv, um die neuronalen Aktivitäten mit Einzelzellauflösung aufzuzeichnen.Für die Kalziumbildgebung wurde grün fluoreszierend durch eine kommerziell erhältliche 470-Nanometer-LED mit einem Standard-GFP-Filtersinn angeregt. Um fluoreszierende Spuren zu erhalten, wurden die Regionen von Interesse, die der neuronalen Zellmasse entsprechen, manuell segmentiert und von der ImageJ-Software analysiert. Für die Spannungsbildgebung mit einer 40-fachen Linse wurden optische Spannungsaufzeichnungen im nahen Infrarotkanal mit 830 Hertz-Erfassungsraten durchgeführt.Die spontane neuronale Aktivitätsaufzeichnung dauerte kontinuierlich bis zu 25.000 Frames. Hier beschreiben wir eine Methode zur Langzeitbildgebung des Hippocampus als A1-Region bei sich verhaltenden Mäusen. Die Methode basiert auf der chronischen Implantation.Nun das maßgeschneiderte Bildgebungsfenster, das auch die gezielte Verabreichung von Viren oder Medikamenten direkt an die interessierenden Neuronen ermöglicht. Wir glauben, dass das beschriebene Protokoll die Studien erleichtern wird, die darauf abzielen, die neuronale Aktivität mit hoher räumlicher zeitlicher Auflösung im Hippocampus von sich verhaltenden Mäusen mit einfachen und erschwinglichen 1-Photonen-Bildgebungsaufstellungen zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

Ein vollautomatisiertes und vielseitig verwendbares System zum Testen von Multi-kognitiven Funktionen und Aufnahme neuronaler Aktivitäten bei Nagetieren

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Ein Verfahren für die Implantation von Mikrodrähte Organisierte Arrays für Einzel-Einheit Recordings in Awake, Behaving Tiere

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Gleichzeitige Langzeit-Aufnahmen auf zwei neuronale Verarbeitungsstufen in Behaving Honigbienen

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Ein Großer Lateral Craniotomy Verfahren für Mesoskalige Breitfeld Optical Imaging von Hirnaktivität

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice

Polygraphic Recording Verfahren zur Messung von Schlaf bei Mäusen

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetische Mitnahme von Hippocampal Theta Schwingungen im Verhalten der Mäuse

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

Aufzeichnung von räumlich eingeschränkt Schwingungen im Hippocampus Verhalten der Mäuse

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Langfristige sensorischen Konflikt in Mäusen frei Verhalten

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...