Name: craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice
Uploaded: 2021-07-24T14:00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice at JoVE.com

ברצוננו להודות לכל חברי קבוצת BioEngineering מולקולרית באוניברסיטת ווסטלייק על כל העזרה והדיון השימושי. אנו מודים גם לג'ינזה לי וג'יאה-מין ג'יה מאוניברסיטת ווסטלייק על העזרה בצילומי ההליך הכירורגי.
עבודה זו נתמכה על ידי מימון סטארט-אפ מקרן אוניברסיטת ווסטלייק, מענק החוקר הצעיר BBRF 2020, והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין להעניק 32050410298 הכל ל- K.D.P.

<ol>
	<li>Leutgeb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Codes+for+Spatial+and+Episodic+Memory+in+Hippocampal+Neuronal+Ensembles.">Independent Codes for Spatial and Episodic Memory in Hippocampal Neuronal Ensembles.</a> Science. 309 (5734), 619-623 (2005).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>Polanco, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+and+tau+complexity+-+towards+improved+biomarkers+and+targeted+therapies.">Amyloid-&#946; and tau complexity - towards improved biomarkers and targeted therapies.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2018).</li><li>Henneman, W. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+atrophy+rates+in+Alzheimer+disease.">Hippocampal atrophy rates in Alzheimer disease.</a> Added value over whole brain volume measures. 72 (11), 999-1007 (2009).</li><li>Camicioli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+is+associated+with+hippocampal+atrophy.">Parkinson's disease is associated with hippocampal atrophy.</a> Mov Disord. 18 (7), 784-790 (2003).</li><li>Piatkevich, K. D., Murdock, M. H., Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Engineering+and+Application+of+Optogenetic+Indicators+for+Neuroscience.">Advances in Engineering and Application of Optogenetic Indicators for Neuroscience.</a> Applied Sciences. 9 (3), 562 (2019).</li><li>Piatkevich, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+imaging+of+neural+activity+in+awake+behaving+mice.">Population imaging of neural activity in awake behaving mice.</a> Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).</li><li>Fan, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-Optical+Electrophysiology+Reveals+the+Role+of+Lateral+Inhibition+in+Sensory+Processing+in+Cortical+Layer+1.">All-Optical Electrophysiology Reveals the Role of Lateral Inhibition in Sensory Processing in Cortical Layer 1.</a> Cell. 180 (3), 521-535 (2020).</li><li>Shemesh, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+Calcium+Imaging+of+Dense+Neural+Populations+via+a+Cell-Body-Targeted+Calcium+Indicator.">Precision Calcium Imaging of Dense Neural Populations via a Cell-Body-Targeted Calcium Indicator.</a> Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).</li><li>Villa, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+Synapses+Are+Repeatedly+Assembled+and+Removed+at+Persistent+Sites+In+Vivo.">Inhibitory Synapses Are Repeatedly Assembled and Removed at Persistent Sites In Vivo.</a> Neuron. 89 (4), 756-769 (2016).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2013).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).</li><li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Genetically+Encoded+Bright+Positive+Calcium+Indicator+NCaMP7+Based+on+the+mNeonGreen+Fluorescent+Protein.">Novel Genetically Encoded Bright Positive Calcium Indicator NCaMP7 Based on the mNeonGreen Fluorescent Protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1644 (2020).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice.">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li><li>Kalmbach, A. S., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+surface+temperature+under+a+craniotomy.">Brain surface temperature under a craniotomy.</a> Journal of neurophysiology. 108 (11), 3138-3146 (2012).</li><li>Roche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+with+a+water+immersion+objective+affects+brain+temperature,+blood+flow+and+oxygenation.">In vivo imaging with a water immersion objective affects brain temperature, blood flow and oxygenation.</a> eLife. 8, 47324 (2019).</li><li>Watakabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analyses+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1,+2,+5,+8+and+9+in+marmoset,+mouse+and+macaque+cerebral+cortex.">Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex.</a> Neuroscience Research. 93, 144-157 (2015).</li><li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H., Manfredssonn, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Therapy for Neurological Disorders: Methods and Protocols. , 133-149 (2016).</li><li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+hippocampal+activity,+plasticity,+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition.">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li><li>Yashiro, H., Nakahara, I., Funabiki, K., Riquimaroux, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-endoscopic+system+for+functional+assessment+of+neural+circuits+in+deep+brain+regions:+Simultaneous+optical+and+electrical+recordings+of+auditory+responses+in+mouse's+inferior+colliculus.">Micro-endoscopic system for functional assessment of neural circuits in deep brain regions: Simultaneous optical and electrical recordings of auditory responses in mouse's inferior colliculus.</a> Neuroscience Research. 119, 61-69 (2017).</li><li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus.">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li><li>Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+In+Vivo+Imaging+of+Hippocampal+Dendrites+and+Spines.">High-Resolution In Vivo Imaging of Hippocampal Dendrites and Spines.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147 (2004).</li><li>Busche, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+soluble+amyloid-&#946;+for+early+hippocampal+hyperactivity+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Critical role of soluble amyloid-&#946; for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8740 (2012).</li><li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Consolidation+of+Ensemble+Neural+Plasticity+Patterns+in+Hippocampal+Area+CA1.">Long-Term Consolidation of Ensemble Neural Plasticity Patterns in Hippocampal Area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li><li>Castello-Waldow, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+neurons+with+stable+excitatory+connectivity+become+part+of+neuronal+representations.">Hippocampal neurons with stable excitatory connectivity become part of neuronal representations.</a> PLOS Biology. 18 (11), 3000928 (2020).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מתארים שיטה להדמיה ארוכת טווח של אזור CA1 ההיפוקמפוס בעכברים מתנהגים. השיטה מבוססת על השתלה כרונית של חלון הדמיה בהתאמה אישית, המאפשר גם ניהול ממוקד של וירוסים או תרופות ישירות לנוירונים בעלי עניין. הפרוטוקול הנוכחי מורכב מארבעה חלקים עיקריים: i) הרכבה של שתל הדמיה; ii) התקנה של שתל הדמיה; iii) הזרקת וירוסים באמצעות שתל הדמיה; iv) הדמיה תפקודית בעכברים מתנהגים. להלן אנו מתארים ודנים בשלבים קריטיים בפרוטוקול, פתרון בעיות, שינויים ומגבלות של השיטה. כמו כן, אנו דנים בחשיבות השיטה וביישומיה החלופיים הפוטנציאליים.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול המתואר החשובים למדי לניתוח מוצלח: (i) הכנת שתל הדמיה באיכות גבוהה; (ii) מצבים כירורגיים סטריליים; (iii) השאיפה של קליפת המוח; (iv) מיקום מדויק של שתל ההדמיה; (v) זריקה ויראלית. כפי ששלב 1.6 מציין, עודף פח הלחמה ידרוש גולגולת גדולה יותר ובכך מגדיל את הסיכון לדלקת. כמו כן חשוב מאוד להשתמש בכמות המתאימה של הדבק האופטי דבק בעת תיקון זכוכית הכיסוי לקנולה הדמיה, כפי שצוין בשלב 1.11, כמו כמות מספקת עלולה לגרום דליפה של נוזל השדרתי לתוך הצינורית הדמיה ולהפוך אותו אטום. מצד שני, עודף דבק אופטי יכול לגרום לירידה בשקיפות של חלון הזכוכית. זיהום אפשרי של שתל ההדמיה יכול לגרום לשגשוג פעיל של רקמת חיבור מתחת לחלון האופטי ו/או דלקת חמורה, שתוביל לסיום מוקדם של הניסוי. לכן, הדמיה השתל הרכבה והכנה לפני הניתוח הוא כמעט חשוב כמו ההליך הכירורגי עצמו.
במהלך הניתוח, החלק של קליפת המוח תחת גולגולת הוא ablated על ידי שאיפה עדינה, אשר גורם לדימום בלתי נמנע. דם באתר הכירורגי מפחית באופן משמעותי את הראות של רקמת המוח שיש להסיר. זה מסבך את ההערכה המדויקת של העומק הנדרש של אבלציה רקמות. שטיפה זהירה של האתר הכירורגי עם PBS בכל פעם לפני החלת יניקה כדי להסיר את החלק הבא של הרקמה מספק שליטה טובה יותר של עומק. יש להסיר תמיד את רקמת המוח בחלקים קטנים צעד אחר צעד המאשרים את עומק הרקמה המהותית לפני שתמשיך עם יניקה נוספת. שליטה עדינה יותר של יניקה יכולה להיות מושגת גם עם מחט קהה דק יותר. אנו ממליצים להשתמש במחט 26 G, עם זאת, קטן יותר מאשר 26 G קוטר נוטה יותר סתימת. יתר על כן, בדרך כלל נדרש תרגול רב כדי לקבוע את עומק השאיפה המדויק הנדרש עבור כל בעל חיים, שכן צבע קליפת המוח, כפיס המוח וההיפוקמפוס עשוי להשתנות מעכבר לעכבר (איור 3).
הכנסה ואבטחת שתל ההדמיה צריך להיעשות בדיוק רב כדי להבטיח את המיקום הקרוב ביותר האפשרי של חלון ההדמיה אל פני השטח הגביים של ההיפוקמפוס. גודל הגולגולת המוכנה צריך להתאים באופן הדוק את השתל ולאפשר החדרתו ללא התנגדות משמעותית. במקביל, לא צריך להיות פער גלוי בין הגולגולת לשתל כדי להבטיח איטום תקין ולהימנע מחשיפה לרקמות המוח. לחץ עדין ויציב צריך להיות מיושם על החלק העליון של השתל במהלך האיטום שלה לגולגולת. זה כמעט בלתי נמנע יש דם מתחת לחלון ההדמיה במהלך התקנת השתל. אם ההליך הכירורגי נעשה כראוי, החלון צריך לנקות ב 3-7 ימים, ואת כלי הדם במוח הופך גלוי בבירור. חשוב גם לוודא כי וירוס מוזרק כראוי מתחת לחלון. במקרה של ביטוי נכשל, וירוס ניתן reinjected מספר פעמים.
הסיבוך העיקרי שנתקלנו בו במקרים מסוימים הוא ראות מופחתת של חלון ההדמיה. ישנן מספר סיבות אפשריות לאיכות הדמיה ירודה: i) דלקת מתמשכת; ii) צמיחת רקמת חיבור על הזכוכית; iii) פער גדול בין החלון והיפוקמפוס. דלקת נגרמת בדרך כלל על ידי זיהום במהלך הניתוח או על ידי לא מעוקר כראוי השתל הדמיה. אנו ממליצים לחבוש אוטומטית את המכשירים הכירורגיים לפני ואחרי כל ניתוח, לחטא את אזור הניתוח ממש לפני ההליך, וללבוש ציוד מגן אישי נקי במהלך הניתוח. יש לנקות שתלי הדמיה לאחר ההרכבה, לעקר ולאחסן אותם בתנאים סטריליים. צמיחת רקמת החיבור על שתל ההדמיה יכולה לנבע מזיהום מכני על פני הזכוכית או מטראומה מוגזמת של רקמת המוח במהלך אבלציה של קליפת המוח. לאחר הרכבת השתל, חשוב לאשר את משטח הזכוכית נקי וחלק. כמו כן, יש להסיר בזהירות את כל חתיכות רקמת המוח הפגועה לפני החדרת שתל הדמיה לתוך הגולגולת. במקרים מסוימים, הפער בין חלון הזכוכית והיפוקמפוס גורם להצטברות של נוזל השדרתי, מה שמפחית את איכות ההדמיה. לכן, במהלך התקנת השתל, חיוני להכניס אותו כל הדרך בהבטחת מגע טוב בין ההיפוקמפוס לחלון הזכוכית. לפעמים, קשה לזהות את הסיבה המדויקת לחלון הדמיה אטום. אנו מציעים לבצע ניתוח שלאחר המוות כדי לחשוף את התנאים מתחת לחלון האופטי ולהתאים בהתאמה את הניתוחים הבאים.
לשיטה מספר מגבלות בסיסיות וטכניות שיש לקחת בחשבון לפני ובמהלך הדמיית vivo. אחת המגבלות העיקריות היא אבלציה קליפת המוח. חלק מקליפת המוח החזותית והחושית מוסר במהלך הניתוח. אמנם קשה להעריך במדויק את ההשפעה של אבלציה קליפת המוח, כמו רקמת המוח הוסר אינו מקרין ישירות על ההיפוקמפוס, מספר מחקרים הראו שום פגיעה ניכרת של למידה תלויי היפוקמפוס או פונקציות אחרות ההיפוקמפוס הרלוונטי15,16. יש לשקול גם את המגבלות האופטיות, במיוחד כאשר נעשה שימוש בעדשות אובייקטיביות גבוהות של NA. לדוגמה, במחקר זה השתמשנו בקנולה באורך 1.75 מ"מ בקוטר פנימי של 1.9 מ"מ. הגיאומטריה של קנולה זו לא תשמר את המטרה המלאה NA של האוויר עם NA יותר ~ 0.5 או מטרת מים עם NA יותר ~ 0.6 כפי שהוא יהיה קליפ חלק מהאור. מגבלה נוספת, הנפוצה בכל שתלי הדמיית המוח, היא שחלק מהמוח נחשף, ובכך מקדם אובדן חום17,18. עם זאת, טמפרטורת המוח הפיזיולוגית ניתן לשחזר בקלות במהלך הדמיה על ידי זלוף של חיץ חם.
ניתן לשנות או להתאים בקלות את השיטה המתוארת עבור יישומים אחרים. לדוגמה, ההכנה יכולה להיות מותאמת להדמיה של סטריאום7. כמו הסטריאטום שוכב קצת יותר עמוק מאשר ההיפוקמפוס, הצינורית הדמיה ארוכה יותר יש להשתמש להרכבת שתל הדמיה. אנו ממליצים להשתמש בקנולה הדמיה 2.0 מ"מ. יש להתאים את הקואורדינטות של הגולגולת בהתאמה (AP: +0.8 מ"מ, ML: -1.8 מ"מ). בנוסף, הזרקת וירוסים באמצעות קנולה עירוי מאפשרת להשיג את הביטוי של transgene בשכבה דקה של נוירונים בעת שימוש בסרוטיפ AAV עם התפשטות מוגבלת19,20. היא מועילה במיוחד להדמיית פוטון אחד עקב פלואורסצנטיות מופחתת מחוץ למיקוד משכבות עמוקות יותר, וכתוצאה מכך, הדמיה משופרת ברזולוציה של תא יחיד. יתר על כן, ניתן להשתמש בהזרקת קנולה גם במהלך הדמיה תפקודית לניהול תרופות או כימיקלים אחרים ישירות על הנוירונים ב- FOV (איור 5B). קנולה אינפוזיה הכוללת מוסיפה פונקציות שימושיות לשתל ההדמיה, משפרת את איכות ההדמיה בשל הביטוי הנגיפי הממוקד ומאפשרת גירוי תרופתי של נוירונים ב- FOV. לוחית הראש המשומשת מספקת יציבות יוצאת דופן של השתלת הדמיה הממזערת חפצי תנועה גם בבעלי חיים הנעים באופן פעיל על הליכון. צלחת הראש קטנה וקלילה, גורמת לאי נוחות מינימלית לבעלי חיים, ונשארת יציבה במשך מספר חודשים לאחר ההתקנה. שתל ההדמיה תואם גם להדמיה מולטי פוטון15,16,21 וניתן לשלבו עם מיקרו אנדוסקופים22,23. שתל הדמיה דומה שימש גם להדמיה מולטי פוטון של מבני ההיפוקמפוס העמוקים יותר, כולל רדיואטום שכבתי, סטראטום לקונוז, ו gyrus שקע16,24,25,26,27. עם זאת, מיקוד מבני ההיפוקמפוס העמוקים יותר עם AAVs באמצעות קנולה עירוי עשוי לדרוש אופטימיזציה נוספת של סרוטיפ AAV ונפח19.
אנו מאמינים כי הפרוטוקול המתואר יקל על מחקרים שמטרתם לחקור פעילות עצבית עם רזולוציה מרחבית גבוהה בהיפוקמפוס של עכברים מתנהגים באמצעות הגדרות הדמיה פוטון אחד פשוט ובמחיר סביר.

ההיפוקמפוס הוא אזור מוח מרכזי האחראי על למידה וזיכרון1, כמו גם לניווט מרחבי2. ניוון היפוקמפוס קשורה להפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות הכרוכות באובדן זיכרון וירידה קוגניטיבית3,4,5. בעכברים, ההיפוקמפוס הוא מודל מבוסס מאוד ללמוד היווצרות למידה מרחבית, הקשרית ואסוציאטיבית וזיכרון ברמות התא והרשת4,5. המחקרים המכניסטיים של למידה וזיכרון דורשים חקירה אורך של מבנה עצבי ותפקוד בעכברים מתנהגים. הדמיית פלואורסצנטיות בשילוב עם בדיקות מקודדותגנטית 6 מספקת יכולות חסרות תקדים לתיעוד דינמיקת מתח ממברנה7,8, סידן חולף9, ושינויים מבניים10 על תת קבוצות גדולות של נוירונים תוך ורידי. עם זאת, גישה אופטית להיפוקמפוס בעכברים נחסמת על ידי קליפת המוח, אשר יכול להגיע מעל 1 מ"מ עובי. כאן, תיארנו הליך להרכבת מכשיר הדמיה בהתאמה אישית וההשתלה הכרונית שלו בראש העכבר לגישה אופטית ארוכת טווח לתיבת המשנה CA1 של ההיפוקמפוס הגבי בעכברים מתנהגים. קנולה עירוי משולב שתל הדמיה מאפשר ניהול של וירוסים או תרופות ישירות על הנוירונים בתחום הראייה. ההכנה המתוארת בשילוב עם מיקרוסקופיה רחבת שדה מאפשרת הדמיה חוזרת ונשנית של תת-קבוצות גדולות של נוירונים בהתנהגות עכברים לאורך תקופות זמן ארוכות. השתמשנו בהכנה זו כדי לבטא אינדיקטורים מקודדים גנטית סידן ומתח באזור CA1 ההיפוקמפוס באמצעות הזרקה ממוקדת של וירוס הקשורים אדנו רקומביננטי (rAAV) עבור הקלטות פעילות עצבית ברזולוציה של תא יחיד. ביצענו גם הדמיית סידן אורך של תת-קבוצות העצבים המתאימות ברזולוציה גבוהה של מרחבי ספטיו-טמפורל בבעלי חיים מתנהגים. בנוסף, הכנה זו תואמת מיקרוסקופיה מולטי פוטון ומיקרואנדוסקופיה, ובכך להרחיב עוד יותר את ארגז הכלים של טכניקות הדמיה ללמוד רשתות עצביות ברמות הסלולר והתת-תאיות בעכברים מתנהגים. תיארנו שלבים קריטיים ופתרון בעיות בפרוטוקול. כמו כן דנו בחסרונות ובמגבלות האפשריות של השיטה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Deckgl&#228;ser</td>
			<td>72296-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denture&#160;base resin</td>
			<td>ShangHai New Centery Dentel Material</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Type I, self-solidifying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dummy Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62102</td>
			<td>OD 0.30mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62003</td>
			<td>26G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Fork</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Cannula</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62203</td>
			<td>&#160;0.30*0.14 (OD*ID, mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBond C&#38;B</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SuperBond C&#38;B kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill Kit</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-cured Adhesive</td>
			<td>NORLAND PRODUCTS</td>
			<td>NOA 60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice

הדמיית פעילויות עצביות ברזולוציה של תא יחיד בבעלי חיים מתנהגים ערים היא גישה חזקה מאוד לחקירת פונקציות מעגל עצבי במערכות מדעי המוח. עם זאת, ספיגה גבוהה ופיזור של אור ברקמת יונקים מגבילים את ההדמיה התוך-וורידית בעיקר לאזורי מוח שטחיים, ומשאירים אזורים במוח עמוק, כגון ההיפוקמפוס, מחוץ להישג ידם של מיקרוסקופיה אופטית. בסרטון זה, אנו מראים את ההכנה וההשתלה של חלון ההדמיה המותאם אישית כדי לאפשר הדמיה כרונית ב- vivo של אזור CA1 ההיפוקמפוס הגבי בעכברים מתנהגים עם ראש קבוע. החלון בהתאמה אישית מתווסף קנולה עירוי המאפשר משלוח ממוקד של וקטורים ויראליים וסמים לאזור ההדמיה. על ידי שילוב הכנה זו עם הדמיה שדה רחב, ביצענו הקלטה ארוכת טווח של פעילות עצבית באמצעות מחוון סידן פלואורסצנטי מתת-קבוצות גדולות של נוירונים בעכברים מתנהגים במשך מספר שבועות. הדגמנו גם את הישימות של הכנה זו להדמיית מתח ברזולוציה חד-פעמית. אינדיקטורים מקודדים גנטית בעלי ביצועים גבוהים של פעילות עצבית ומצלמות CMOS מדעיות אפשרו הדמיה חוזרת ונשנית של פרטים מורפולוגיים תת-תאיים של נוירונים בודדים ברזולוציה זמנית גבוהה. כמו כן, אנו דנים ביתרונות ובמגבלות הפוטנציאליות של השיטה המתוארת ובתאימותה לטכניקות הדמיה אחרות.

בהדמיה vivo של פעילות עצבית באמצעות מחוון סידן מקודד גנטית. בממוצע, הדמיה vivo מתחיל 3-4 שבועות לאחר ההשתלה אם רמה מספקת של ביטוי transgene מושגת. בשלב זה, בצקת מוחית ודימום נפתרים בדרך כלל לחלוטין, ואת כלי הדם במוח ניתן לראות בקלות דרך החלון האופטי. כאן ניצלנו את ההכנה המתוארת כדי לבצע את ההקלטות החוזרות ונשנות של פעילות עצבית באזור CA1 ההיפוקמפוס הגבי בהתנהגות עכברים תחת מיקרוסקופ שדה רחב פלואורסצנטי. כדי לתעד פעילות עצבית, השתמשנו מחוון סידן מקודד גנטית בהיר, בשם NCaMP713, אשר מציג רגישות סידן דומה ורזולוציה זמנית לזו של GCaMP6s14. כדי לבטא את מחוון NCaMP7 בהיפוקמפוס, הזרקנו את וירוס rAAV / DJ-CAG-NCaMP7 באמצעות קנולה עירוי ויזמנו הדמיית קו אורך ב 14 ימים לאחר ההזרקה. כדי לתעד פעילות עצבית, השתמשנו בעדשת יעד אוויר 10x NA 0.3 ובמצלמת SCMOS של Hamamatsu OrcaFusion שאפשרה הדמיה ב- FOV של ~ 1.5x1.5 מ"מ בתדר של עד 100 הרץ. פלואורסצנטיות ירוקה התרגשה על ידי LED מסחרי זמין 470 ננומטר באמצעות ערכת מסנן GFP סטנדרטית. העומק הממוצע של הדמיה מושגת בערוץ ירוק הוא כ 50-120 מיקרומטר, המאפשר הקלטה של פעילות עצבית בעיקר בשכבות oriens ו pyramidale שכבה. עומק ההדמיה בערוצי אינפרא אדום כמעט יכול להיות עד 200 מיקרומטר להגיע לשכבות העמוקות יותר של ההיפוקמפוס8. זמן ההקלטה הממוצע ל-FOV היה 6-12 דקות, אם כי מפגשי הדמיה ארוכים בהרבה אפשריים מכיוון ש-NCaMP7 מאופיין בפוטו יציבות גבוהה במיוחד ולא נצפתה פוטוטוקסיות ניתנת לגילוי (איור 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig06.jpg"> איור 6: הקלטה של הפעילות העצבית בנוירונים ההיפוקמפוסים באמצעות מחוון סידן מקודד גנטית פלואורסצנטי ירוק. (A) FOV נבחר בתמונה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה בערוץ ירוק. (B)15 ההחזרים על ההשקעה המתאימים לנוירונים הבודדים המוצגים ב- A ונבחרים באמצעות הקרנת סטיית התקן של ההקלטה כולה. (C) עקבות פלואורסצנטיות מייצגות של 15 תאי העצב שנבחרו ב- B.(D)תצוגה מייצגת של 2 עקבות סידן המוצגות בתיבות צבע תואמות המוצגות ב- C. Scale bar, 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig06large.jpg" target="_blank"></a>
כדי להשיג עקבות פלואורסצנטיות, אזורי העניין (ROIs) המתאימים לסומות עצביות חולקו באופן ידני ונותחו על ידי תוכנת ImageJ. לפני תיקון תנועה ניתוח תמונה, נהלים נפוצים שלאחר הקלטה בבעלי חיים ערים לא נדרשו כמו datasets שנרכשו לא הפגינו חפצי תנועה בשל היציבות הגבוהה של השתל הדמיה. באיור 6מוצגת הקלטה אופטית מייצגת של פעילויות עצביות מההיפוקמפוס בעכבר ער . באיור 6B נבחרו באופן ידני 15 החזרי על ההשקעה המתאימים לסומאס עצבי מאותו FOV המוצג באיור 6B, ועקבות הפלואורסצנטיות של ניסוי יחיד בתוך כל החזר על ההשקעה מוצגות באיור 6C. איור 6D מציג שני חלקים מייצגים של עקבות פלואורסצנטיות משני ROIs שונים. ביצענו 4 הפעלות הדמיה רצופות עבור אותו FOV עם מרווחי זמן של 3 ימים. ניתן היה לזהות ולצלם את אותם נוירונים ב FOVs מסוימים לפחות שבועיים (מפגשי הדמיה ארוכים יותר לא בוצעו עבור מחקר זה, עם זאת, הכנה זהה שימשה עד 6 חודשים מחקר הדמיה בעכברים בעבר7; איור 7). במחקר זה השתמשנו בווקטור AAV/DJ-CAG, אשר גרם לביטוי חזק של גן העניין גם 21 יום לאחר מסירת הנגיף (איור משלים 1). הביטוי המתמשך סיבך זיהוי ארוך טווח של אותם נוירונים עקב רקע פלואורסצנטי מוגבר ומראה של נוירונים חדשים המבטאים את מחוון הסידן. לכן, הבחירה של Serotype AAV ו מקדם כדי לנהוג ביטוי גנים היעד צריך להיות אחד השיקולים החשובים במהלך תכנון ניסיוני בפרט אם הדמיה אורך של אותה תת קבוצה של נוירונים נדרש. איכות ההדמיה מותרת לפתור דנדריטים פרוקסימליים, כמו גם לדמיין את כלי הדם.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig07v2.jpg"> איור 7: רצף תמונות של ארבעה FOVs שונים מאזור ההיפוקמפוס במעקב במשך 12 ימים. החיה הושתלה עם החלון ביום 0 והוזרקה עם וירוס rAAV / DJ-CAG-NCaMP7 ביום 7. ראשי חץ מציינים את הנוירון במעקב בתוך FOV. סרגלי קנה מידה: 80 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig07large.jpg" target="_blank">מיקרומטר.</a>
בהדמיה vivo של פעילות עצבית באמצעות חיישן מתח מקודד גנטית. במחקר זה, השתמשנו גם בחיישן מתח מקודדגנטיתחדשני, בשם SomArchon 7 , המאפשר הדמיית מתח ברזולוציה חד-תאית חד-תאית בבעליחייםמתנהגים 7,8. כדי לבטא SomArchon, הזרקנו וירוס rAAV / DJ-CAG-SomArchon באמצעות קנולה עירוי וביצע הדמיית מתח בעכבר התנהגות קבוע ראש מספר ימים לאחר ההזרקה. כדי לתעד פעילות עצבית, השתמשנו בעדשה אובייקטיבית 40x NA 0.8 ובמצלמת SCMOS של Hamamatsu OrcaFusion שאיפשרה לנו לדמיין 150x40 מיקרומטר FOV בקצב רכישה של עד 830 הרץ. חלבון GFP, אשר חלק SomArchon לבנות כדי להקל על הדמיה של ביטוי בטווח הנראה של הספקטרום, ניתן לדמיין בקלות בערוץ הירוק (עירור LED ב 470/20 ננומטר, פליטה 525/50 ננומטר) כדי לאתר תאים מעניינים עבור הדמיית מתח. הקלטות מתח אופטי בוצעו בערוץ כמעט אינפרא אדום (עירור לייזר 637 ננומטר ב 3.4 W / מ"מ2, פליטה 665 ננומטר מעבר ארוך) עם 4 x 4 binning בקצב רכישה 830 הרץ. תיעדנו את הפעילות הספונטנית של נוירון בהיפוקמפוס בעכבר ער עם ממוצע SNR של 7 לכל פוטנציאל פעולה (איור 8). 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig08.jpg"> איור 8: הקלטה של הפעילות העצבית בנוירונים ההיפוקמפוסים באמצעות פלואורסצנטיות כמעט אינפרא אדום מקודד גנטית מחוון מתח SomArchon. (A)FOV נבחר בתמונה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה בערוץ כמעט אינפרא אדום. (B) עקבות פלואורסצנטיות של הנוירון ב- A. (C) תצוגה זום מייצג של עקבות המתח בתיבה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig08large.jpg" target="_blank">המתאימה</a> המוצגת ב B. סרגל קנה מידה: 25 מיקרומטר.
היסטולוגיה לאחר מחקר הדמיה תפקודית נעשה, ניתוח שלאחר המוות משמש כדי לאשר את המיקום הנכון של השתל, את האזור של ביטוי וירוס, לוקליזציה של חלבון של עניין נוירונים בתמונה. לצורך אימות היסטולוגי של ביטוי הנגיף ומיקום השתל, נבדקו חלקים מהמוח הקבוע של PFA תחת מיקרוסקופ שדה רחב פלואורסצנטי (איור 9A, C). מיקרוסקופ קונפוקל שימש לרכישת תמונות ברזולוציה גבוהה של נוירונים בודדים המבטאים את מחוון הסידן, כמו גם את מחוון המתח (איור 9B, D). כתמי DAPI שימשו כדי לדמיין את המורפולוגיה הכוללת של פרוסת המוח. בנוסף, ניתן להעריך את פרוסות המוח באמצעות אימונוהיסטוכימיה כדי לאמת אסטרוליוזיס או גליוזה הנגרמת על ידי השתלת חלון וביטוי ויראלי. המחקרים הקודמים שלנו הראו כי ההליך לא לגרוםהמורגשת 7.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig09.jpg"> איור 9: אימות היסטולוגי של מיקום החלון האופטי וביטוי הווירוס. (A) תמונה פלואורסצנטית מייצגת של פרוסת המוח החלקית של הכתר המציגה את מיקום החלון האופטי מעכבר מבטא NCaMP. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ.(B)תמונה קונפוקלית מייצגת של נוירונים המבטאים את מחווני NCaMP7. סרגל קנה מידה: 25 מיקרומטר (C) תמונת פלואורסצנטיות מייצגת של פרוסת המוח של החלק הקרונל המציגה את מיקום החלון האופטי מעכבר מבטא SomArchon. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ.(D)תמונה קונפוקלית מייצגת של נוירונים המבטאים את מחווני SomArchon. סרגל קנה מידה: 25 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig09large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: ניתוח כמותי של עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית יחד עם זמן הביטוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice at JoVE.com

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

מאמר זה מדגים את הכנת חלון הדמיה בהתאמה אישית בתוספת קנולה עירוי והשתלתו על אזור CA1 של ההיפוקמפוס בעכברים.

הליך גולגולתי להדמיית פעילויות עצביות בהיפוקמפוס של עכברים מתנהגים

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

היי, חבר'ה, קוראים לי וואנג יאנג-דונג, ואני ממעבדת הביו-הנדסה המולקולרית של ד"ר קיריל פיאטקוביץ' באוניברסיטת ווסטלייק. היום, אני אראה לך את ההליך להדמיית פעילויות עצביות של היפוקמפוס בעכברים, ב-vivo. הפעל את מכונת הריתוך וחמם אותה לטמפרטורה הנדרשת.להתאים את המיקום של הצינורית הדמיה ואת הצינורית ההזרקה באמצעות ידיים עוזרות כפי שמוצג באיור. באמצעות המזרק עם המחט, להחיל כמות קטנה של סוג מתאים של שטף על כתמי החיבור בין הדמיה והזרקת קנולה במשך חמש שניות, ולאחר מכן להסיר את הטיפה. הר פח הלחמה ולהחיל אותו על נקודת החיבור שטופלו בשטף.הימנע פח הלחמה עודף כפי שהוא ידרוש גולגולת גדולה מיותרת לעשות במהלך הניתוח. חכה לפח הלחמה להתקרר. בדרך כלל, זה לוקח כמה שניות.ודא כי הצינורית ההזרקה אינה חסומה על ידי החדרת הצינורית דמה משני הכיוונים. החל דבק אופטי ריפוי UV בצד התחתון של הצינורית הדמיה באמצעות קיסם או מחט מזרק 26-מד. השתמש פינצטה בסדר בזהירות למקם כיסוי בגודל המתאים קנולה הדמיה.לרפא את הדבק לפחות שעה על ידי תאורת UV ממנורה UV כף יד סטנדרטית. יש למרדים את העכבר באמצעות isoflurane בהתאם לנוהל שאושר על-ידי IACUC. הנח את העכבר במסגרת סטראוטקסית מעל כרית חימום לניתוח.אבטחו את הראש עם מוטות אוזניים. מעט לדחוף את הראש לכל הכיוונים כדי לוודא את הראש מאובטח בחוזקה. יש למרוח משחת עיניים כדי למנוע מעיני החיה להתייבש במהלך הניתוח.השתמש גוזם או קרם depilatory כדי להסיר את הפרווה מהחלק האחורי של הצוואר עד העיניים. לעקר את האתר הכירורגי עם betadine ואחריו 70% אתנול שלוש פעמים לפני ביצוע חתך. הסר את העור מעל החלק העליון של הגולגולת, החל עם חתך אופקי סביב בסיס הראש, ואחריו שני חתכים בכיוון rostral, כמעט להגיע העפעפיים.ואז שני חתכים אלכסוניים שמתכנסים בקו האמצע. עם שתי ספוגיות כותנה סטריליות, לסגת הרקמה המחברת, כמו גם את השרירים של החלק האחורי של הצוואר אל קצות הגולגולת. החל טיפה של פתרון לידוקאין על פני השטח של periosteum במשך שתי דקות, כדי למנוע כאב מוגזם.בעדינות לגרד את כל האזור החשוף של הגולגולת עם אזמל כדי ליצור משטח יבש ומחוספס. הנח קצה המחט על למבדה כדי לראות אם קואורדינטת AP היא אפס כדי לאשר כי מיקום הראש הוא אנכי, כמו גם אם קואורדינטת ML הוא אפס, כדי לאשר את הראש ממוקם אופקית. אם לא, כוונן את ידיות הכתב בתחנה הסטראוטקסית עד שנקודות הציון AP ו- ML יתאימו ל- 0.1 מילימטרים.להזיז את קצה המחט כדי למצוא את הנקודות המתאימות עבור craniotomy ולסמן את מיקומם על הגולגולת, באמצעות סמן עדין. צייר עיגול המבוסס על ארבע נקודות מסומנות, כמו גם את קווי המתאר של אזור הצינורית ההזרקה בצד הצינורית של העיגול. השתמש במקדחה פנאומטית במהירות של 10,000 סיבובים לדקה כדי לקדוח בעדינות לאורך קווי המתאר המסומנים בגולגולת.לקדוח את הגולגולת עד שכבה דקה מאוד של העצם נשאר, אשר בדרך כלל מתחיל להתנועע תחת מגע עדין במרכז. החל טיפה של PBS סטרילי למרכז הגולגולת. הרם את דש העצם מהגולגולת עם מלקחיים דקים מאוד או שני מחטים 26-מד מתקרבים אליו מהצדדים הנגדיים.החל PBS ואחריו שאיפות עדינות, באמצעות מחט קהה 26 מד מספר פעמים כדי לנקות את פני השטח של הדורה. החל יניקה עדינה כדי להבליט את קליפת המוח, כמו גם את כפיס המוח קורפוס מעל ההיפוקמפוס. קורטקס הוא לעתים קרובות צהוב יותר מאשר כפיס המוח קורפוס.וקאלוסום קורפוס הוא בדרך כלל רחב יותר מאשר ההיפוקמפוס. חוץ מזה, כפיס המוח הוא באמת קל להבחין על ידי סיבים עצביים הולך בכיוונים אנכיים ואופקיים כאשר נצפה מלמעלה. דימום בשלב זה ישפיע על הראות של רקמת המוח בגולגולת.החל PBS, ואחריו יניקה עדינה, בזמן שאתה מזיע את קליפת המוח כדי להיפטר מהדם, קורפוס קלוסום ניתן לזהות על ידי הכיוון של הסיבים הלבנים כפי שמוצג באופן סכמטי בתרשים. הסר סיבי כפיס המוח שכבה אחר שכבה על ידי החלת יניקה עדינה בתנועה מעגלית. PBS מוחל כל הזמן כדי להיפטר דם מצטבר מעל רקמת המוח חשופה.הכנס בעדינות את השתל לתוך הגולגולת. לחץ בחוזקה על גבי השתל עם המחט בצורת L כדי למקם את החלון האופטי של השתל קרוב ככל האפשר לפני השטח החשופים של ההיפוקמפוס. שוב ושוב להחיל PBS על הצלקת סביב השתל, ואחריו יניקה כדי להסיר דם ככל האפשר במהלך החדרת השתל.יש למרוח שכבה דקה של חותם מהיר בין השתל לגולגולת כדי למנוע חדירה של מלט דנטלי מתחת לגולגולת. לאחר החותם המהיר נרפא, להחיל קשר סופר באופן שווה על פני השטח של הגולגולת, את פני השטח של החותם המהיר ואת פני השטח של השתל. לאחר הקשר סופר נרפא, להחיל שף בסיס תותבת מעל קשר סופר, כמו גם את העור סביב החתך שנעשה בתחילת הניתוח.לאחר שצורף בסיס התותבת נרפא, מניחים את צלחת הראש על השרף סביב השתל ולהפוך אותו להתרכז עם הצינורית הדמיה. החל יותר משרף בסיס תותבת סביב ומעל צלחת הראש כדי לתקן את מיקומו. תן לזה תרופה לכמה דקות.הימנע מבניית שכבה עבה של מלט סביב הצינורית כדי להבטיח גישה טובה יותר לחלון ההדמיה היא העדשה האובייקטיבית. לדלל את שרף בסיס התותבת כדי להקטין את צמיגותו, ובכך לאפשר לו למלא את החללים אשר קשה להגיע עם אפליקטור. מניחים בעדינות סרט גומי מבודד מעל החלון כדי להגן על החלון מפני זיהום אפשרי מפני פסים של בעלי חיים.הוסף פתרון מלאי צבע ירוק מהיר לפתרון וירוס לדלל אותו טיטר הרצוי ביחס של אחד עד תשע, בצינור PCR. למשוך 600 ננו ליטר של פתרון הנגיף, להסיר את הצינורית דמה ולהכניס את הצינורית הפנימית לחבר אותו מזרק הזרקה לתוך הצינורית מדריך. להחדיר את הנגיף במהירות של 15 ננו ליטר לדקה, במשך 10 דקות בסך הכל.שמור את הצינורית הפנימית מחובר במשך 10 דקות כדי לאפשר את הנגיף להתפשט מתחת לחלון. הסר בעדינות את הצינורית הפנימית מהקנולה המנחה וסכם אותה מחדש עם הצינורית הבובה. לגרום לעכבר עם 4% isoflurane במשך כמה דקות.תקן את צלחת הראש שלו למזלג הראש, ולאחר מכן לתקן את מזלג הראש להליכון. השתמש בעדשת יעד הגדלה נמוכה כדי למצוא את התצוגה הטובה ביותר לסינון עבור דימות פונקציונלי. לאחר מכן, עבור לעדשה אובייקטיבית גבוהה יותר כדי לתעד את הפעילויות העצביות ברזולוציית תא בודד.להדמיית סידן, פלואורסצנט ירוק התרגש על ידי LED מסחרי זמין 470 ננומטר באמצעות חוש מסנן GFP סטנדרטי. כדי להשיג עקבות פלואורסצנטיים, אזורי האינטרסים, המתאימים למסת תא עצבי חולקו באופן ידני וניתחו על ידי תוכנת ImageJ. להדמיית מתח באמצעות הקלטות מתח אופטי של עדשת X 40 בוצעו בערוץ האינפרא-אדום הקרוב בשיעורי רכישה של 830 הרץ.הקלטת פעילות עצבית ספונטנית נמשכה ברציפות עד 25,000 מסגרות. כאן, אנו מתארים שיטה להדמיה ארוכת טווח של ההיפוקמפוס כאזור A1 בעכברים מתנהגים. השיטה מבוססת על ההשתלה הכרונית.עכשיו חלון ההדמיה בהתאמה אישית, המאפשר גם ניהול ממוקד של וירוסים או תרופות ישירות לנוירונים בעלי עניין. אנו מאמינים כי הפרוטוקול המתואר יקל על המחקרים שמטרתם לחקור פעילות עצבית עם רזולוציה זמנית מרחבית גבוהה בהיפוקמפוס של עכברים מתנהגים באמצעות סטים פשוטים ובמחיר סביר של הדמיית פוטון 1.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

מערכת אוטומטי לחלוטין תכליתי מאוד עבור בדיקת ריבוי פונקציות קוגניטיביות ורישום פעילות עצבית במכרסמים

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

הליך השתלת מערכים מאורגנים של Microwires להקלטות יחידה אחת בAwake, מתנהגת בעלי חיים

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

הקלטות ארוכות טווח בו זמנית בשני שלבים עצביים עיבוד במתנהגים דבורי דבש

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

נוהל Craniotomy Lateral גדול עבור דימות אופטי Mesoscale רחב בתחום של פעילות המוח

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice

נוהל הקלטת פוליגרפים למדידת שינה בעכברים

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

הקלטה במרחב מוגבל תנודות בהיפוקמפוס מתנהגים באופן עכברים

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

הקונפליקט חושי לטווח ארוך באופן חופשי להתנהג עכברים

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...