Name: craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice
Uploaded: 2021-07-24T14:00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice at JoVE.com

Ringraziamo tutti i membri del Molecular BioEngineering Group della Westlake University per tutto l'aiuto e l'utile discussione. Ringraziamo anche Jinze Li e Jie-Min Jia della Westlake University per l'aiuto con le riprese della procedura chirurgica.
Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti per le start-up della Foundation of Westlake University, bbrf Young Investigator Grant 2020 e national natural science foundation of China grant 32050410298 all'K.D.P.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui descriviamo un metodo per l'imaging a lungo termine della regione dell'ippocampo CA1 nel comportarsi con i topi. Il metodo si basa sull'impianto cronico di una finestra di imaging su misura, che consente anche la somministrazione mirata di virus o farmaci direttamente ai neuroni di interesse. Il presente protocollo si compone di quattro parti principali: i) assemblaggio di impianti di imaging; ii) installazione di impianti di imaging; iii) iniezione di virus tramite impianto di imaging; iv) imaging funzionale nei topi che si comportano. Di seguito vengono descritti e descritti i passaggi critici del protocollo, la risoluzione dei problemi, le modifiche e le limitazioni del metodo. Discutiamo anche dell'importanza del metodo e delle sue potenziali applicazioni alternative.
Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo descritto che sono piuttosto importanti per un intervento chirurgico di successo: (i) preparazione di un impianto di imaging di alta qualità; — condizioni chirurgiche sterili; — aspirazione della corteccia; — posizionamento preciso dell'impianto di imaging; — iniezione virale. Come indica il passaggio 1.6, l'eccesso di stagno di saldatura richiederebbe una craniotomia più grande e quindi aumenta il rischio di infiammazione. È anche molto importante utilizzare una quantità appropriata della colla ottica adesiva quando si fissa il vetro di copertura alla cannula di imaging, come indicato nel passaggio 1.11, poiché una quantità insufficiente può causare perdite di liquido cerebrospinale nella cannula di imaging e renderla opaca. D'altra parte, l'eccesso di adesivo ottico può comportare la ridotta trasparenza della finestra di vetro. La possibile contaminazione dell'impianto di imaging può causare una proliferazione attiva del tessuto connettivo sotto la finestra ottica e / o grave infiammazione, che porterà alla fine anticipata dell'esperimento. Pertanto, l'assemblaggio e la preparazione dell'impianto di imaging prima dell'intervento chirurgico è quasi altrettanto importante della procedura chirurgica stessa.
Durante l'intervento chirurgico, la parte della corteccia sotto craniotomia è ablata da una delicata aspirazione, che si traduce in un inevitabile sanguinamento. Il sangue nel sito chirurgico riduce significativamente la visibilità del tessuto cerebrale che deve essere rimosso. Ciò complica la valutazione precisa della profondità richiesta di ablazione tissutale. Un attento lavaggio del sito chirurgico con PBS ogni volta prima di applicare l'aspirazione per rimuovere la porzione successiva di tessuto fornisce un migliore controllo della profondità. Il tessuto cerebrale deve sempre essere rimosso in piccole porzioni passo dopo passo confermando la profondità del tessuto alalato prima di procedere con più aspirazione. Un controllo più fine dell'aspirazione può essere ottenuto anche con un ago smussato più sottile. Si consiglia di utilizzare un ago da 26 G, tuttavia, un diametro inferiore a 26 G è più incline all'intasamento. Inoltre, di solito ci vuole molta pratica per determinare la profondità precisa di aspirazione richiesta per ogni animale, poiché il colore della corteccia, del corpo calloso e dell'ippocampo può variare da topo a topo(Figura 3).
L'inserimento e la messa in sicurezza dell'impianto di imaging devono essere eseguiti in modo molto preciso per garantire la posizione più vicina possibile della finestra di imaging alla superficie dorsale dell'ippocampo. La dimensione della craniotomia preparata dovrebbe corrispondere strettamente all'impianto e consentirne l'inserimento senza una resistenza significativa. Allo stesso tempo, non dovrebbe esserci spazio visibile tra il cranio e l'impianto per garantire una corretta sigillatura ed evitare l'esposizione del tessuto cerebrale. Pressione delicata e stabile deve essere applicata sulla parte superiore dell'impianto durante la sua sigillatura al cranio. È quasi inevitabile avere sangue sotto la finestra di imaging durante l'installazione dell'impianto. Se la procedura chirurgica viene eseguita correttamente, la finestra dovrebbe essere liberata in 3-7 giorni e la vascucolatura cerebrale diventa chiaramente visibile. È anche importante assicurarsi che il virus sia correttamente iniettato sotto la finestra. In caso di espressione non riuscita, il virus può essere reiniettato più volte.
La maggiore complicazione che abbiamo riscontrato in alcuni casi è la ridotta visibilità della finestra di imaging. Ci sono diverse possibili ragioni per una scarsa qualità dell'imaging: i) infiammazione in corso; ii) crescita del tessuto connettivo sul vetro; iii) grande divario tra la finestra e l'ippocampo. L'infiammazione è solitamente causata da contaminazione durante l'intervento chirurgico o da impianto di imaging non adeguatamente sterilizzato. Suggeriamo di autoclavare gli strumenti chirurgici prima e dopo ogni intervento chirurgico, disinfettare l'area dell'intervento chirurgico subito prima della procedura e indossare dispositivi di protezione individuale puliti durante l'intervento chirurgico. Gli impianti di imaging devono essere puliti dopo l'assemblaggio, sterilizzati e conservati in condizioni sterili. La crescita del tessuto connettivo sul vetro dell'impianto di imaging può essere dovuta a contaminazione meccanica sulla superficie del vetro o a un trauma eccessivo del tessuto cerebrale durante l'ablazione della corteccia. Dopo aver assemblato l'impianto, è importante confermare che la superficie del vetro è pulita e liscia. Inoltre, tutti i pezzi di tessuto cerebrale danneggiato devono essere accuratamente rimossi prima di inserire l'impianto di imaging nella craniotomia. In alcuni casi, lo spazio tra la finestra di vetro e l'ippocampo si traduce nell'accumulo di liquido cerebrospinale, riducendo la qualità dell'imaging. Pertanto, durante l'installazione dell'impianto, è fondamentale inserirlo fino in fondo per garantire un buon contatto tra ippocampo e finestra di vetro. A volte, è difficile identificare il motivo esatto della finestra di imaging opaca. Si consiglia di eseguire analisi post mortem per rivelare le condizioni sotto la finestra ottica e di conseguenza regolare gli interventi chirurgici successivi.
Il metodo presenta diverse limitazioni fondamentali e tecniche che dovrebbero essere prese in considerazione prima e durante l'imaging in vivo. Uno dei principali limiti è l'ablazione della corteccia. Parte della corteccia visiva e sensoriale viene rimossa durante l'intervento chirurgico. Mentre è difficile valutare con precisione l'impatto dell'ablazione della corteccia, poiché il tessuto cerebrale rimosso non si proietta direttamente sull'ippocampo, diversi studi non hanno dimostrato alcuna compromissione evidente dell'apprendimento dipendente dall'ippocampo o di altre funzioni ippocampopertinenti 15,16. Dovrebbero essere prese in considerazione anche le limitazioni ottiche, specialmente quando vengono utilizzate lenti oggettive NA elevate. Ad esempio, in questo studio, abbiamo usato una cannula lunga 1,75 mm con un diametro interno di 1,9 mm. La geometria di questa cannula non conserverà l'obiettivo NA completo dell'aria con NA più di ~0,5 o obiettivo acqua con NA più di ~0,6 in quanto ritaglierà un po 'di luce. Un'altra limitazione, comune per tutti gli impianti di imaging cerebrale, è che parte del cervello viene esposta, promuovendo così la perditadi calore 17,18. Tuttavia, la temperatura fisiologica del cervello può essere facilmente ripristinata durante l'imaging per perfusione di un tampone caldo.
Il metodo descritto può essere facilmente modificato o regolato per altre applicazioni. Ad esempio, la preparazione può essere adattata per l'imaging dello striato7. Poiché lo striato si trova leggermente più in profondità dell'ippocampo, la cannula di imaging più lunga dovrebbe essere utilizzata per assemblare l'impianto di imaging. Si consiglia di utilizzare cannula di imaging da 2,0 mm. Le coordinate della craniotomia devono essere regolate di conseguenza (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Inoltre, l'iniezione di virus tramite cannula per infusione consente di ottenere l'espressione di un transgene in un sottile strato di neuroni quando si utilizza sierotipo AAV con diffusionelimitata 19,20. È particolarmente utile per l'imaging con un fotone a causa della ridotta fluorescenza fuori fuoco da strati più profondi e, di conseguenza, di una migliore imaging a risoluzione a singola cellula. Inoltre, la cannula a iniezione può essere utilizzata anche durante l'imaging funzionale per la somministrazione di farmaci o altre sostanze chimiche direttamente sui neuroni in FOV (Figura 5B). La cannula per infusione complessiva aggiunge funzionalità utili all'impianto di imaging, migliorando la qualità dell'imaging grazie all'espressione virale mirata e consentendo la stimolazione farmacologica dei neuroni nei FOV. La piastra della testa utilizzata fornisce una straordinaria stabilità dell'impianto di imaging riducendo al minimo gli artefatti del movimento anche negli animali in movimento attivo su un tapis roulant. La piastra della testa è piccola e leggera, causando un minimo disagio agli animali, e rimane stabile per diversi mesi dopo l'installazione. L'impianto di imaging è anche compatibile con l'imaging multifotono15,16,21 e può essere combinato con micro-endoscopi22,23. Un impianto di imaging simile è stato utilizzato anche per l'imaging multifotonica delle strutture dell'ippocampo più profonde, tra cui strato radio, lacunosi dello strato e giro dentato16,24,25,26,27. Tuttavia, il targeting delle strutture di ippocampo più profonde con AAV tramite cannula per infusione può richiedere un'ulteriore ottimizzazione del sierotipo AAV e del volume19.
Crediamo che il protocollo descritto faciliterà gli studi che mirano a indagare l'attività neuronale con alta risoluzione spaziotemporale nell'ippocampo di comportarsi con topi utilizzando configurazioni di imaging un-fotone semplici e convenienti.

L'ippocampo è una regione cerebrale chiave responsabile dell'apprendimento edella memoria 1, nonché della navigazionespaziale 2. L'atrofia ippocampale è associata a disturbi neurologici e psichiatrici che coinvolgono la perdita di memoria e ildeclino cognitivo 3,4,5. Nei topi, l'ippocampo è un modello molto consolidato per studiare l'apprendimento spaziale, contestuale e associativo e la formazione della memoria sui livelli cellulare edi rete 4,5. Gli studi meccanicistici sull'apprendimento e la memoria richiedono l'interrogatorio longitudinale della struttura neuronale e della funzione nel comportarsi con i topi. L'imaging a fluorescenza in combinazione con sondegeneticamente codificate 6 fornisce capacità senza precedenti per registrare la dinamica della tensione della membrana7,8, transitori di calcio9e cambiamenti strutturali10 su grandi sottoinsiemi di neuroni intravitally. Tuttavia, l'accesso ottico all'ippocampo nei topi è ostruito dalla corteccia, che può raggiungere oltre 1 mm di spessore. Qui, abbiamo descritto una procedura per assemblare un dispositivo di imaging su misura e il suo impianto cronico nella testa del topo per l'accesso ottico a lungo termine alla sottoregione CA1 dell'ippocampo dorsale nei topi che si comportano. La cannula per infusione integrata nell'impianto di imaging consente la somministrazione di virus o farmaci direttamente sui neuroni nel campo visivo. La preparazione descritta in combinazione con la microscopia a campo largo consente l'imaging ricorrente dei grandi sottoinsiemi di neuroni nel comportarsi con i topi per lunghi periodi di tempo. Abbiamo utilizzato questa preparazione per esprimere indicatori geneticamente codificati di calcio e tensione nella regione ippocampale CA1 attraverso l'iniezione mirata di virus adeno-associato ricombinante (rAAV) per registrazioni di attività neuronali a risoluzione a singola cellula. Abbiamo anche eseguito l'imaging longitudinale del calcio dei corrispondenti sottoinsiemi neuronali ad alta risoluzione spaziotemporale nel comportamento degli animali. Inoltre, questa preparazione è compatibile con la microscopia multifotonica e la microscopia, espandendo così ulteriormente la cassetta degli attrezzi delle tecniche di imaging per studiare le reti neuronali a livello cellulare e subcellulare nel comportamento dei topi. Sono stati descritti i passaggi critici e la risoluzione dei problemi del protocollo. Abbiamo anche discusso delle possibili insidie e limitazioni del metodo.

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		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Deckgl&#228;ser</td>
			<td>72296-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denture&#160;base resin</td>
			<td>ShangHai New Centery Dentel Material</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Type I, self-solidifying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dummy Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62102</td>
			<td>OD 0.30mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62003</td>
			<td>26G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Fork</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Cannula</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62203</td>
			<td>&#160;0.30*0.14 (OD*ID, mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBond C&#38;B</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SuperBond C&#38;B kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill Kit</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-cured Adhesive</td>
			<td>NORLAND PRODUCTS</td>
			<td>NOA 60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice

L'imaging delle attività neuronali a risoluzione a singola cellula negli animali che si comportano svegli è un approccio molto potente per lo studio delle funzioni del circuito neurale nelle neuroscienze dei sistemi. Tuttavia, l'elevata assorbanza e dispersione della luce nei tessuti dei mammiferi limita l'imaging intravitale principalmente alle regioni cerebrali superficiali, lasciando le aree cerebrali profonde, come l'ippocampo, fuori dalla portata della microscopia ottica. In questo video, mostriamo la preparazione e l'impianto della finestra di imaging su misura per consentire l'imaging cronico in vivo della regione CA1 ippocampale dorsale nei topi che si comportano a testa fissa. La finestra su misura è integrata da una cannula per infusione che consente la consegna mirata di vettori virali e farmaci all'area di imaging. Combinando questa preparazione con l'imaging a campo largo, abbiamo eseguito una registrazione a lungo termine dell'attività neuronale utilizzando un indicatore di calcio fluorescente da grandi sottoinsiemi di neuroni nel comportarsi con topi per diverse settimane. Abbiamo anche dimostrato l'applicabilità di questa preparazione per l'imaging a tensione con risoluzione a picco singolo. Gli indicatori geneticamente codificati ad alte prestazioni dell'attività neuronale e le telecamere CMOS scientifiche hanno permesso la visualizzazione ricorrente dei dettagli morfologici subcellulari dei singoli neuroni ad alta risoluzione temporale. Discutiamo anche dei vantaggi e delle potenziali limitazioni del metodo descritto e della sua compatibilità con altre tecniche di imaging.

Imaging in vivo dell'attività neuronale utilizzando un indicatore di calcio geneticamente codificato. In media, l'imaging in vivo inizia 3-4 settimane dopo l'impianto se si ottiene un livello sufficiente di espressione transgena. A questo punto, l'edema cerebrale e l'emorragia sono solitamente completamente risolti e la vascucolatura cerebrale può essere facilmente osservata attraverso la finestra ottica. Qui abbiamo utilizzato la preparazione descritta per eseguire le registrazioni ripetute dell'attività neuronale nella regione dorsale ipcampale CA1 nel comportarsi con topi al microscopio a campo largo a fluorescenza. Per registrare l'attività neuronale, abbiamo usato un indicatore di calcio geneticamente codificato luminoso, chiamato NCaMP713, che mostra una sensibilità al calcio e una risoluzione temporale simili a quella di GCaMP6s14. Per esprimere l'indicatore NCaMP7 nell'ippocampo, abbiamo iniettato il virus rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 utilizzando una cannula per infusione e iniziato l'imaging a longitudine a 14 giorni dopo l'iniezione. Per registrare l'attività neuronale, abbiamo usato un obiettivo d'aria NA 0.3 10x e una fotocamera sCMOS Hamamatsu OrcaFusion che ha permesso l'imaging a ~ 1,5x1,5 mm FOV a una frequenza fino a 100 Hz. La fluorescenza verde era eccitata da un LED a 470 nm disponibile in commercio utilizzando un set di filtri GFP standard. La profondità media dell'imaging raggiunta nel canale verde è di circa 50-120 μm, che consente la registrazione dell'attività neuronale principalmente negli oriens dello strato e nello strato pyramidale. La profondità di imaging nei canali del vicino infrarosso può arrivare fino a 200 μm raggiungendo gli strati più profondi dell'ippocampo8. Il tempo medio di registrazione per FOV è stato di 6-12 minuti, anche se sono possibili sessioni di imaging molto più lunghe in quanto NCaMP7 è caratterizzato da una fototabilità estremamente elevata e non è stata osservata alcuna fototossicità rilevabile(Figura 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig06.jpg"> Figura 6: Registrazione dell'attività neuronale nei neuroni ippocampali utilizzando un indicatore di calcio geneticamente codificato a fluorescenza verde. (A) Un FOV selezionato registrato sotto un microscopio a fluorescenza a campo largo in canale verde. (B) I 15 ROM corrispondenti ai singoli neuroni mostrati in A e selezionati utilizzando la proiezione di deviazione standard dell'intera registrazione. (C) Tracce rappresentative a prova singola a fluorescenza dei 15 neuroni selezionati in B. (D) Una vista di zoom rappresentativa di 2 tracce di calcio mostrate nelle corrispondenti caselle di colore mostrate nella barra di scala C. , 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig06large.jpg" target="_blank">questa figura.</a>
Per ottenere tracce di fluorescenza, le regioni di interesse (ROM) corrispondenti ai somi neuronali sono state segmentate manualmente e analizzate dal software ImageJ. Prima della correzione del movimento dell'analisi delle immagini, non erano necessarie procedure comuni di post-registrazione negli animali svegli in quanto i set di dati acquisiti non mostravano artefatti di movimento a causa dell'elevata stabilità dell'impianto di imaging. Una registrazione ottica rappresentativa a prova singola delle attività neuronali dall'ippocampo in un topo che si comporta sveglio è presentata nella figura 6. 15 ROI corrispondenti ai somi neuronali sono stati selezionati manualmente dallo stesso FOV mostrato nella figura 6Be le tracce di fluorescenza a prova singola all'interno di ciascun ROI sono mostrate nella figura 6C. La figura 6D mostra due parti rappresentative di tracce di fluorescenza di due diverse ROM. Abbiamo eseguito 4 sessioni di imaging consecutive per lo stesso FOV con intervalli di 3 giorni. È stato possibile identificare e identificare gli stessi neuroni in alcuni DOM per almeno due settimane (le sessioni di imaging più lunghe non sono state eseguite per questo studio, tuttavia, la stessa preparazione è stata utilizzata per uno studio di imaging fino a 6 mesi su topiprecedentemente 7; Figura 7). In questo studio, abbiamo utilizzato il vettore AAV / DJ-CAG, che stava guidando una forte espressione del gene di interesse anche 21 giorni dopo la consegna del virus (Figura complementare 1). L'espressione continua complicava l'identificazione a lungo termine degli stessi neuroni a causa dell'aumento dello sfondo di fluorescenza e della comparsa di nuovi neuroni che esprimevano l'indicatore del calcio. Pertanto, la selezione del sierotipo AAV e del promotore per guidare l'espressione genica bersaglio dovrebbe essere una delle considerazioni importanti durante la progettazione sperimentale, in particolare se è richiesta l'imaging longitudinale dello stesso sottoinsieme di neuroni. La qualità dell'imaging ha permesso di risolvere i dendriti prossimali e di visualizzare i vasi sanguigni.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig07v2.jpg"> Figura 7: Sequenza di immagini di quattro diversi PV dell'area ippocampale tracciati nell'area di 12 giorni. L'animale è stato impiantato con la finestra il giorno 0 ed è stato iniettato con il virus rAAV / DJ-CAG-NCaMP7 il giorno 7. Le punte delle frecce indicano il neurone tracciato all'interno del FOV. Barre di scala: 80 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Imaging in vivo dell'attività neuronale utilizzando un sensore di tensione geneticamente codificato. In questo studio, abbiamo anche utilizzato un nuovo sensore di tensione geneticamente codificato, chiamato SomArchon7, che consente l'imaging di tensione con risoluzione a un solo picco a singola cella negli animali dacomportamento 7,8. Per esprimere SomArchon, abbiamo iniettato il virus rAAV/DJ-CAG-SomArchon utilizzando una cannula per infusione ed eseguito l'imaging di tensione in un topo comportamentale fissato dalla testa diversi giorni dopo l'iniezione. Per registrare l'attività neuronale, abbiamo utilizzato un obiettivo NA 0.8 40x e una fotocamera sCMOS Hamamatsu OrcaFusion che ci ha permesso di immaginare FOV 150x40 μm a una velocità di acquisizione fino a 830 Hz. La proteina GFP, che una parte del costrutto SomArchon costruisce per facilitare la visualizzazione dell'espressione nella gamma visibile dello spettro, può essere facilmente immaginata nel canale verde (eccitazione LED a 470/20 nm, emissione 525/50 nm) per localizzare le cellule di interesse per l'imaging di tensione. Le registrazioni di tensione ottica sono state eseguite nel canale del vicino infrarosso (eccitazione laser 637 nm a 3,4 W/mm2,emissione 665 nm di passaggio lungo) con 4 x 4 binning a velocità di acquisizione di 830 Hz. Abbiamo registrato l'attività spontanea di un neurone ippocampale in un topo sveglio con SNR medio di 7 per potenziale d'azione(Figura 8). 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig08.jpg"> Figura 8: Registrazione dell'attività neuronale nei neuroni ippocampali utilizzando un indicatore di tensione geneticamente codificato a fluorescenza nel vicino infrarosso SomArchon. (A) Un FOV selezionato è stato immaginato al microscopio a fluorescenza a campo largo nel canale del vicino infrarosso. (B) Traccia a fluorescenza a prova singola del neurone in A. (C) Una vista di zoom rappresentativa della traccia di tensione nella casella corrispondente mostrata in B. Barra di scala: 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig08large.jpg" target="_blank">questa figura.</a>
istologia Dopo aver effettuato lo studio di imaging funzionale, l'analisi post mortem viene utilizzata per confermare il corretto posizionamento dell'impianto, l'area di espressione del virus e la localizzazione di una proteina di interesse nei neuroni immagine. Per la verifica istologica dell'espressione del virus e del posizionamento dell'impianto, le sezioni coronali del cervello fisso della PFA sono state esaminate al microscopio a campo largo a fluorescenza(Figura 9A, C). Un microscopio confocale è stato utilizzato per acquisire immagini ad alta risoluzione di singoli neuroni che esprimono l'indicatore di calcio, così come l'indicatore di tensione (Figura 9B, D). La colorazione DAPI è stata utilizzata per visualizzare la morfologia complessiva della fetta cerebrale. Inoltre, le fette cerebrali possono essere valutate utilizzando l'immunoistochimica per verificare l'astrogliosi o la gliosi causata dall'impianto della finestra e dall'espressione virale. I nostri studi precedenti hanno dimostrato che la procedura non ha indotto una notevolegliosi 7.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig09.jpg"> Figura 9: Verifica istologica della posizione ottico della finestra e dell'espressione del virus. (A) Immagine fluorescente rappresentativa della fetta cerebrale della sezione coronale che mostra il posizionamento della finestra ottica da un mouse che esprime NCaMP. Barra di scala: 1 mm. (B) Un'immagine confocale rappresentativa dei neuroni che esprimono gli indicatori NCaMP7. Barra di scala: 25 μm. (C) Un'immagine rappresentativa di fluorescenza della fetta cerebrale della sezione coronale che mostra il posizionamento della finestra ottica da un mouse che esprime SomArchon. Barra di scala: 1 mm. (D) Un'immagine confocale rappresentativa dei neuroni che esprimono gli indicatori somarchon. Barra di scala: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig09large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura complementare 1: Analisi quantitativa dell'intensità relativa della fluorescenza insieme al tempo di espressione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Questo articolo dimostra la preparazione di una finestra di imaging su misura integrata con cannula per infusione e il suo impianto sulla regione CA1 dell'ippocampo nei topi.

Procedura craniotomia per la visualizzazione delle attività neuronali nell'ippocampo dei topi che si comportano

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Ehi, ragazzi, mi chiamo Wang Yangdong, e sono del laboratorio di bioingegetamica molecolare dr.Kiryl Piatkevich della Westlake University. Oggi vi mostrerò la procedura per l'imaging delle attività neuronali dell'ippocampo nei topi, in vivo. Accendere la saldatrice e riscaldarla fino alla temperatura richiesta.Regolare la posizione della cannula di imaging e della cannula di iniezione usando le mani di aiuto come mostrato nella figura. Utilizzando la siringa con l'ago, applicare una piccola quantità di flusso appropriato sui punti di connessione tra l'imaging e l'iniezione di cannula per cinque secondi, quindi rimuovere la goccia. Montare lo stagno di saldatura e applicarlo al punto di connessione trattato con il flusso.Evitare l'eccesso di stagno di saldatura in quanto richiederà un inutile cranial più grande da fare durante l'intervento chirurgico. Aspetta che la lattina di saldatura si raffredda. Di solito, ci vogliono diversi secondi.Verificare che la cannula di iniezione non sia bloccata inserendo la cannula fittizia da entrambe le direzioni. Applicare l'adesivo ottico di polimerizzazione UV sul lato inferiore della cannula di imaging utilizzando uno stuzzicadenti o un ago per siringhe calibro 26. Utilizzare una pinzetta fine per posizionare con cura un vetro di copertura della dimensione corrispondente alla cannula di imaging.Polimerizzare l'adesivo per almeno un'ora con l'illuminazione UV da una lampada UV portatile standard. Anestetizzare il mouse con isoflurane secondo la procedura approvata dalla IACUC. Posizionare il mouse in un telaio stereotassico sopra un tappetino riscaldante chirurgico.Fissare la testa con le barre auricolari. Spingere leggermente la testa in tutte le direzioni per assicurarsi che la testa sia fissata saldamente. Applicare unguento per gli occhi per evitare che gli occhi dell'animale si asciughino durante l'intervento chirurgico.Utilizzare un trimmer o una crema depilatoria per rimuovere la pelliccia dalla parte posteriore del collo fino agli occhi. Sterilizzare il sito chirurgico con betadina seguita dal 70% di etanolo tre volte prima di fare un'incisione. Rimuovere la pelle sopra la parte superiore del cranio, iniziando con il taglio orizzontale intorno alla base della testa, seguito da due tagli nella direzione rostrale, quasi raggiungendo le palpebre.Poi due tagli obliqui che convergono sulla linea mediana. Con due tamponi di cotone sterili, ritrarre il tessuto di collegamento, così come la muscolatura della parte posteriore del collo ai bordi del cranio. Applicare una goccia di soluzione di lidocaina sulla superficie del periostio per due minuti per evitare dolori eccessivi.Raschiare delicatamente l'intera area esposta del cranio con un bisturi per creare una superficie asciutta e ruvida. Posizionare la punta dell'ago sulla Lambda per vedere se la coordinata AP è zero per confermare che la posizione della testa è verticale, così come se la coordinata ML è zero, per confermare che la testa è posizionata orizzontalmente. In caso meno, regolare le manopole corrispondenti sulla stazione stereotassica fino a quando le coordinate AP e ML sono entrambe entro 0,1 millimetri.Spostare la punta dell'ago per trovare i punti corrispondenti per la craniotomia e contrassegnare le loro posizioni sul cranio, usando un pennarello fine. Disegnare un cerchio basato su quattro punti contrassegnati, così come il contorno dell'area della cannula di iniezione sul lato della cannula del cerchio. Utilizzare un trapano pneumatico alla velocità di 10.000 colpi al minuto per praticare delicatamente lungo il contorno contrassegnato sul cranio.Perforare il cranio fino a quando non viene lasciato uno strato molto sottile di osso, che di solito inizia a muoversi sotto un tocco delicato al centro. Applicare una goccia di PBS sterile al centro della craniotomia. Sollevare il lembo osseo dal cranio con pini con punta molto sottile o due aghi calibro 26 che si avvicinano dai lati opposti.Applicare PBS seguito da aspirazioni delicate, attraverso un ago smussato calibro 26 più volte per pulire la superficie della dura. Applicare un'aspirazione delicata per abiurare la corteccia e il Corpus Calloso sopra l'ippocampo. Cortex è spesso più gialla del Corpus Calloso.E il Corpus Calloso è solitamente più largo dell'ippocampo. Inoltre, il Corpus Calloso è davvero facile da distinguere per le fibre neuronali che vanno in direzione verticale e orizzontale quando osservate dall'alto. Il sanguinamento a questo punto influenzerà la visibilità del tessuto cerebrale nella craniotomia.Applicare PBS, seguito da una leggera aspirazione, mentre si aspira la corteccia per sbarazzarsi del sangue, Corpus Callosum può essere riconosciuto dalla direzione delle fibre bianche come schematicamente mostrato nel diagramma. Rimuovere le fibre di Corpus Callosum strato per strato applicando un'aspirazione delicata con un movimento circolare. Pbs viene costantemente applicato per sbarazzarsi del sangue che si accumula sopra il tessuto cerebrale esposto.Inserire delicatamente l'impianto nella craniotomia. Premere saldamente sopra l'impianto con l'ago a forma di L per posizionare la finestra ottica dell'impianto il più vicino possibile alla superficie esposta dell'ippocampo. Applicare ripetutamente PBS sulla cicatrice intorno all'impianto, seguito dall'aspirazione per rimuovere il sangue il più possibile durante l'inserimento dell'impianto.Applicare un sottile strato di tenuta rapida tra l'impianto e il cranio per evitare che il cemento dentale penei sotto il cranio. Una volta che la tenuta rapida è polimeri, applicare il super legame uniformemente sulla superficie del cranio, sulla superficie della tenuta rapida e sulla superficie dell'impianto. Una volta che il super legame è guarito, applicare la resina di base della protesi sopra il super legame, così come la pelle intorno all'incisione effettuata all'inizio dell'intervento chirurgico.Dopo aver polimerizzata la resina di base della protesi, posizionare la piastra della testa sulla resina intorno all'impianto e farlo concentrare con la cannula di imaging. Applicare più resina di base della protesi intorno e sopra la piastra della testa per fissarne la posizione. Lascialo curare per diversi minuti.Evitare di costruire uno spesso strato di cemento intorno alla cannula per garantire un migliore accesso alla finestra di imaging è l'obiettivo. Diluire la resina di base della protesi per diminuirne la viscosità, permettendogli così di riempire le cavità difficili da raggiungere con un applicatore. Posizionare delicatamente un nastro di gomma isolato sopra la finestra per proteggere la finestra da possibili contaminazioni da bande animali.Aggiungere la soluzione fast green dye stock alla soluzione antivirus diluirla al timone desiderato nel rapporto da uno a nove, in un tubo PCR. Prelevare 600 nano litri della soluzione virale, rimuovere la cannula fittizia e inserire la cannula interna collegarla alla siringa di iniezione nella cannula guida. Infondere il virus alla velocità di 15 nano litri al minuto, per 10 minuti in totale.Mantenere la cannula interna collegata per 10 minuti per consentire al virus di diffondersi sotto la finestra. Rimuovere delicatamente la cannula interna dalla cannula guida e riacquisirla con la cannula fittizia. Indurre il mouse con il 4% di isoflurane per alcuni minuti.Fissare la piastra della testa alla forcella della testa, quindi fissare la forcella della testa al tapis roulant. Usa un obiettivo a basso ingrandimento per trovare il meglio per filtrare la vista per l'imaging funzionale. Quindi, passare a una lente obiettiva più alta per registrare le attività neuronali a risoluzione a singola cellula.Per l'imaging del calcio, il fluorescente verde era eccitato da un LED da 470 nanometri disponibile in commercio utilizzando un senso di filtro GFP standard. Per ottenere tracce fluorescenti, le regioni di interesse, corrispondenti alla massa cellulare neuronale, sono state segmentate manualmente e analizzate dal software ImageJ. Per l'imaging di tensione utilizzando un obiettivo 40 X sono state eseguite registrazioni di tensione ottica nel canale del vicino infrarosso a velocità di acquisizione di 830 Hertz.La registrazione spontanea dell'attività neurale è durata continuamente fino a 25.000 fotogrammi. Qui descriviamo un metodo per l'imaging a lungo termine dell'ippocampo come regione A1 nel comportarsi con i topi. Il metodo si basa sull'impianto cronico.Ora la finestra di imaging su misura, che consente anche la somministrazione mirata di virus o farmaci direttamente ai neuroni di interesse. Crediamo che il protocollo descritto faciliterà gli studi che mirano a indagare l'attività neuronale con alta risoluzione temporale spaziale nell'ippocampo di comportarsi con topi utilizzando semplici e convenienti set-up di imaging a 1 fotone.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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