Name: craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice
Uploaded: 2021-07-24T14:00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice at JoVE.com

웨스트레이크 대학의 분자 생물 공학 그룹의 모든 구성원에게 모든 도움과 유용한 토론을 감사드립니다. 웨스트레이크대학의 리진제와 지민지아에게도 수술 촬영에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다.
이 작품은 웨스트 레이크 대학, 2020 BBRF 젊은 조사관 그랜트, 중국 국립 자연 과학 재단이 K.D.P.에 모든 32050410298 보조금의 기초 기금에 의해 지원되었다.

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	<li>Leutgeb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Codes+for+Spatial+and+Episodic+Memory+in+Hippocampal+Neuronal+Ensembles.">Independent Codes for Spatial and Episodic Memory in Hippocampal Neuronal Ensembles.</a> Science. 309 (5734), 619-623 (2005).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>Polanco, J. 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저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기서 우리는 행동 마우스에서 해마 CA1 영역의 장기 화상 진찰을 위한 방법을 기술합니다. 이 방법은 맞춤형 이미징 창의 만성 이식에 기초하여, 이는 또한 관심의 뉴런에 직접 바이러스 또는 약물의 표적 투여를 가능하게. 본 프로토콜은 네 가지 주요 부분으로 구성됩니다: i) 이미징 임플란트의 조립; ii) 이미징 임플란트 설치; iii) 이미징 임플란트를 통한 바이러스 주입; iv) 면도 마우스에서 기능성 이미징. 아래에서 는 프로토콜의 중요한 단계, 문제 해결, 수정 및 메서드의 제한 사항을 설명하고 설명합니다. 우리는 또한 방법과 잠재적 인 대체 응용 프로그램의 중요성에 대해 논의합니다.
성공적인 수술을 위해 오히려 중요한 기술된 프로토콜에 있는 몇몇 중요한 단계가 있습니다: (i) 고품질 화상 진찰 임플란트의 준비; (ii) 멸균 수술 조건; (iii) 피질의 포부; (iv) 이미징 임플란트의 정확한 배치; (v) 바이러스 주사. 1.6 단계에서 말했듯이, 과도한 납땜 주석은 더 큰 두개 통 절제술을 필요로하므로 염증의 위험을 증가시킵니다. 또한 1.11단계에서 나타난 바와 같이, 이미징 캐뉼라에 커버 글래스를 고정할 때 적정량의 접착 광학 접착제를 사용하는 것이 매우 중요하며, 불충분한 양은 뇌척수액을 이미징 캐뉼라로 누출시키고 불투명하게 만들 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 한편, 과도한 광학 접착제는 유리 창의 투명도가 저하될 수 있다. 이미징 임플란트의 가능한 오염은 광학 창 및/또는 심한 염증 하에서 결합 조직의 활성 증식을 일으킬 수 있으며, 이는 실험의 조기 종료로 이어질 것입니다. 따라서 수술 전에 임플란트 조립 및 준비를 이미징하는 것은 수술 자체만큼이나 중요합니다.
수술 도중, 두개골 절제술의 밑에 피질의 부분은 피할 수 없는 출혈을 초래하는 온화한 포부에 의해 abD됩니다. 수술 부위의 혈액은 제거해야 하는 뇌 조직의 가시성을 크게 감소시킵니다. 이것은 조직 절제의 요구되는 깊이의 정확한 평가를 복잡하게 합니다. 조직의 다음 부분을 제거하기 위해 흡입을 적용하기 전에 매번 PBS와 수술 부위의 주의 깊은 홍조는 깊이의 더 나은 제어를 제공합니다. 뇌 조직은 항상 더 많은 흡입을 진행하기 전에 ablated 조직의 깊이를 확인하는 단계별로 작은 부분에서 제거해야합니다. 흡입의 미세한 제어는 또한 얇은 무딘 바늘로 달성 될 수있다. 우리는 26 G 바늘을 사용하는 것이 좋습니다, 그러나, 26 G 직경보다 작은 막히는 경향이있다. 더욱이, 피질, 코퍼스 캘로섬 및 해마의 색이 마우스에서 마우스로 다를 수 있기 때문에, 각 동물에게 필요한 포부의 정확한 깊이를 결정하기 위해 많은 연습이필요하다(그림 3).
이미징 임플란트의 삽입 및 고정은 해마의 등대 표면에 이미징 창의 가장 가까운 위치를 보장하기 위해 매우 정확하게 수행해야합니다. 준비된 두개골 절제술의 크기는 임플란트와 밀접하게 일치하고 상당한 저항없이 삽입을 허용해야합니다. 동시에, 적절한 밀봉을 보장하고 뇌 조직 노출을 피하기 위해 두개골과 임플란트 사이에 눈에 보이는 간격이 없어야합니다. 부드럽고 안정적인 압력은 두개골에 밀봉하는 동안 임플란트의 상단에 적용해야합니다. 임플란트 설치 중 이미징 창 아래에 혈액이 있는 것은 거의 피할 수 없습니다. 외과 적 수술이 제대로 완료되면 창은 3-7 일 후에 꺼져야하며 뇌 혈관이 명확하게 보입니다. 바이러스가 창 아래에 제대로 주입되도록하는 것도 중요합니다. 발현이 실패하면 바이러스를 여러 번 재주입할 수 있다.
어떤 경우에는 우리가 만난 주요 합병증은 이미징 창의 가시성을 감소시면 됩니다. 가난한 이미징 품질에 대 한 몇 가지 가능한 이유가 있다: i) 지속적인 염증; ii) 유리에 결합 조직의 파생; iii) 창과 해마 사이의 큰 간격. 염증은 일반적으로 수술 중 또는 제대로 살균되지 않은 이미징 임플란트에 의해 오염에 의해 발생합니다. 우리는 각 수술 전후 수술 기구를 자동화하고, 수술 직전에 수술 부위를 소독하고, 수술 중에 깨끗한 개인 보호 장비를 착용하는 것이 좋습니다. 이미징 임플란트는 조립, 살균 및 멸균 상태로 저장한 후 세척해야 합니다. 화상 진찰 임플란트의 유리에 결합 조직의 파생은 피질 절제 도중 유리의 표면에 기계적 오염 또는 과도한 외상 때문일 수 있습니다. 임플란트를 조립한 후 유리 표면이 깨끗하고 매끄럽게 유지되도록 하는 것이 중요합니다. 또한, 손상된 뇌 조직의 모든 조각은 두개골 절제술에 이미징 임플란트를 삽입하기 전에 주의 깊게 제거해야합니다. 경우에 따라 유리 창과 해마 사이의 간격으로 뇌척수액이 축적되어 이미징의 품질이 저하됩니다. 따라서 임플란트 설치 시 해마와 유리 창 사이의 좋은 접촉을 보장하는 데 모든 방법을 삽입하는 것이 중요합니다. 때로는 불투명한 이미징 창의 정확한 이유를 식별하기가 어렵습니다. 우리는 광학 창에서 조건을 드러내고 그에 상응하는 후속 수술을 조정하기 위하여 사후 분석을 능력을 발휘하는 것이 좋습니다.
이 방법은 생체 내 이미징 전과 도중 고려해야 할 몇 가지 기본 및 기술적 한계가 있습니다. 주요 한계 중 하나는 피질 절제입니다. 시각 및 감각 피질의 일부가 수술 중에 제거됩니다. 피질 절제의 영향을 정확하게 평가하기는 어렵지만, 제거된 뇌 조직이 해마에 직접 투사하지 않기 때문에, 여러 연구는 해마 의존학습 또는 기타 관련 해마기능(15,16)의눈에 띄는 손상을 입증하지 못했다. 특히 높은 NA 객관적렌즈를 사용할 때광학적 한계도 고려해야 합니다. 예를 들어, 이 연구에서는 1.9mm 의 내경을 가진 1.75mm 길이의 캐뉼라를 사용했습니다. 이 캐뉼라의 지오메트리는 NA ~0.5 이상의 공기 목표 또는 NA가 ~0.6 이상의 빛으로 표시되기 때문에 물 목표의 전체 NA를 보존하지 않습니다. 모든 뇌 이미징 임플란트에 대한 일반적인 또 다른 제한은 뇌의 일부가 노출되어 열 손실17,18을촉진한다는 것입니다. 그러나, 생리적 뇌 온도는 따뜻한 완충제의 관류에 의해 이미징 중에 쉽게 복원 될 수있다.
설명된 방법은 다른 응용 프로그램에 대해 쉽게 수정하거나 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 준비는 striatum7의이미징을 위해 적응될 수 있다. 줄무늬가 해마보다 약간 더 깊어짐에 따라, 더 긴 이미징 캐뉼라를 이미징 임플란트 조립에 사용해야 합니다. 우리는 2.0 mm 화상 진찰 캐뉼라를 사용하는 것이 좋습니다. 두개골 절제술의 좌표는 그에 따라 조정되어야합니다 (AP : +0.8 mm, ML : -1.8 mm). 또한, 주입 캐뉼라를 통한 바이러스 주사는 제한된확산을가진 AAV 혈청형을 사용할 때 뉴런의 얇은 층에서 트랜스진의 발현을 달성할 수 있게 한다19,20. 그것은 더 깊은 층에서 초점 불소 감소 때문에 1 광자 화상 진찰에 특히 유익하고, 그 결과로, 향상한 단세포 해상도 화상 진찰. 더욱이, 주사 캐뉼라는 또한 FOV(도5B)의뉴런에 직접 약물 또는 기타 화학 물질의 투여를 위한 기능적 이미징 중에 사용될 수 있다. 전반적인 주입 캐뉼라는 이미징 임플란트에 유용한 기능을 추가하여 표적 바이러스 발현으로 인한 이미징 품질을 개선하고 FOV에서 뉴런의 약리자극을 가능하게 합니다. 사용된 헤드 플레이트는 러닝머신에서 동물을 활발하게 움직이는 경우에도 모션 아티팩트를 최소화하는 이미징 임플란트의 탁월한 안정성을 제공합니다. 헤드 플레이트는 작고 가볍기 때문에 동물에게 최소한의 불편함을 주며 설치 후 몇 달 동안 안정적으로 유지됩니다. 이미징 임플란트는 또한 다광화상영상(15,16,21)과 호환되며, 마이크로내시경(22,23)과결합될 수 있다. 유사한 이미징 임플란트는 또한 층 라디툼, 층 라쿠노스 및 덴테이트 자이러스16,24, 25,26,27을포함하여 깊은 해마 구조의 다광 화상 진찰에 사용되었다. 그러나, 주입 캐뉼라를 통해 AAV를 가진 더 깊은 해마 구조물을 표적으로 하는 것은 AAV 혈청형 및 부피19의추가 최적화를 요구할 수 있다.
우리는 기술된 프로토콜이 간단하고 적당한 1광화상 화상 진찰 설정을 사용하여 마우스를 행동하는 마우스의 해마에 있는 높은 현면 적 해상도를 가진 신경 활동을 조사하는 것을 목표로 하는 연구를 촉진할 것이라는 점을 믿습니다.

해마는 학습및 기억1뿐만 아니라 공간 탐색2를담당하는 주요 뇌 영역입니다. 해마 위축은 기억 상실 및 인지기능저하3,4,5와 관련된 신경 학적 및 정신 질환과 관련이있습니다. 마우스에서, 해마는 세포 및 네트워크 수준4,5에공간, 문맥, 및 연관 학습 및 메모리 형성을 연구하는 아주 잘 확립된 모델이다. 학습과 메모리의 기계적인 연구는 신경 구조와 쥐를 행동하는 기능의 세로 심문이 필요합니다. 유전적으로 인코딩된 프로브6과 결합된 형광 이미징 은 막 전압 역학7,8,칼슘 과도9,뉴런의 대형 하위 집합에 대한 구조적 변화10을 유전적으로 기록할 수 있는 전례 없는 기능을 제공합니다. 그러나, 마우스에 있는 해마에 광학 접근은 두께에 있는 1 mm 이상에 도달할 수 있는 피질에 의해 방해됩니다. 여기서, 우리는 마우스를 행동하는 등쪽 해마의 CA1 하위 영역에 장기 광학 접근을 위해 맞춤형 이미징 장치와 만성 이식을 마우스 헤드로 조립하는 절차를 설명했습니다. 이미징 임플란트에 통합된 주입 캐뉼라를 사용하면 시야의 뉴런에 직접 바이러스 또는 약물을 투여할 수 있습니다. 넓은 필드 현미경 검사법과 함께 설명된 준비는 오랜 기간 동안 마우스를 행동하는 뉴런의 큰 하위 집합의 재발성 이미징을 가능하게 합니다. 우리는 단일 세포 해상도에서 신경 활동 기록을 위한 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)의 표적 주입을 통해 해마 CA1 지역에서 칼슘 및 전압 유전으로 인코딩된 지표를 표현하기 위해 이 준비를 활용했습니다. 우리는 또한 동물을 행동하는 높은 현면 적 해상도에서 해당 신경 하위 집합의 세로 칼슘 이미징을 수행했습니다. 또한, 이러한 제제는 다광석 현미경 검사법과 미세내시경과 호환되므로, 마우스를 행동하는 세포 및 세포외 수준에서 신경망을 연구하기 위해 이미징 기술의 툴박스를 더욱 확장한다. 우리는 프로토콜의 중요한 단계와 문제 해결을 설명했습니다. 우리는 또한 방법의 가능한 함정과 한계에 대해 논의했다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Deckgl&#228;ser</td>
			<td>72296-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denture&#160;base resin</td>
			<td>ShangHai New Centery Dentel Material</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Type I, self-solidifying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dummy Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62102</td>
			<td>OD 0.30mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62003</td>
			<td>26G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Fork</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Cannula</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62203</td>
			<td>&#160;0.30*0.14 (OD*ID, mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBond C&#38;B</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SuperBond C&#38;B kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill Kit</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-cured Adhesive</td>
			<td>NORLAND PRODUCTS</td>
			<td>NOA 60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice

깨어 있는 행동 동물에 있는 단세포 해상도에 있는 신경 활동을 화상 진찰하는 것은 시스템 신경 과학에 있는 신경 회로 기능의 조사를 위한 아주 강력한 접근입니다. 그러나, 포유류 조직에 있는 높은 흡광도 및 산란은 주로 피상적인 두뇌 지구에 생명 화상 진찰을 제한하고, 해마와 같은 깊은 두뇌 영역을 떠나, 광학 현미경 검사법에 대한 손이 닿지 않는 곳에 둡니까. 이 비디오에서는, 헤드 고정 행동 마우스에서 등쪽 해마 CA1 영역의 만성 생체 내 이미징을 가능하게 하기 위해 맞춤형 이미징 창의 준비 및 이식을 보여줍니다. 맞춤형 창은 이미징 영역에 바이러스 벡터와 약물의 표적 전달을 허용하는 주입 캐뉼라로 보완됩니다. 이 준비를 와이드 필드 이미징과 결합함으로써, 우리는 몇 주 동안 마우스를 행동하는 뉴런의 큰 하위 세트에서 형광 칼슘 지표를 사용하여 신경 활동의 장기 기록을 수행했습니다. 또한 단일 스파이크 해상도를 갖춘 전압 이미징을 위한 이 준비의 적용 가능성을 입증했습니다. 신경 활동과 과학 CMOS 카메라의 고성능 유전적으로 인코딩된 지표는 높은 시간적 해상도에서 단일 뉴런의 세포 전형 학적 세부 사항의 재발적인 시각화를 허용했습니다. 우리는 또한 기술된 방법의 장점 및 잠재적인 한계 및 그밖 화상 진찰 기술과의 호환성에 대해 토론합니다.

유전적으로 인코딩된 칼슘 표시기를 사용하여 신경 활동의 생체 내 이미징. 평균적으로 생체 내 이미징은 충분한 수준의 트랜스진 발현이 달성되면 이식 후 3-4주 후에 시작됩니다. 이 때까지, 뇌 부종과 출혈은 일반적으로 완전히 해결되고, 뇌 혈관은 광학 창을 통해 쉽게 관찰 될 수있다. 여기서는 형광 광역 현미경하에서 마우스를 행동하는 등쪽 해마 CA1 영역에서 신경 활성의 반복된 기록을 수행하기 위해 기술된 제제를 활용하였다. 신경 활동을 기록하기 위해, 우리는 GCaMP6s14의것과 유사한 칼슘 감도 및 측두해상도를 나타내는 NCaMP713이라는밝은 유전적으로 인코딩된 칼슘 표시기를 사용했습니다. 해마에서 NCaMP7 지표를 표현하기 위해, 우리는 주입 캐뉼라를 사용하여 rAAV / DJ-CAG-NCaMP7 바이러스를 주입하고 14 일 후 주사에 경도 영상을 시작했습니다. 신경 활성을 기록하기 위해 10x NA 0.3 공기 목표 렌즈와 하마마츠 오르카퓨전 sCMOS 카메라를 사용하여 최대 100Hz 주파수에서 ~1.5x1.5mm FOV의 이미징을 허용했습니다. 녹색 형광은 표준 GFP 필터 세트를 사용하여 시판되는 470 nm LED에 의해 흥분되었다. 녹색 채널에서 달성된 화상 진찰의 평균 깊이는 대략 50-120 μm입니다, 지층 오리엔스와 지층 피라미드에 주로 신경 활동의 기록을 허용합니다. 근적외선 채널의 이미징 깊이는 해마8의더 깊은 층에 도달하는 최대 200 μm일 수 있습니다. FOV당 평균 기록 시간은 6-12분이었지만, NCaMP7은 매우 높은 광안정성을 특징으로 하고 검출 가능한 광독성이 관찰되지 않은 만큼 훨씬 더 긴 이미징 세션이 가능하지만(도6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig06.jpg"> 도 6: 녹색 형광유전자를 사용하여 해마 뉴런에서 뉴런 활성을 기록하여 유전적으로 인코딩된 칼슘 표시기. (A)녹색 채널에서 광장 형광 현미경으로 촬영된 선택된 FOV. (B)A에 도시된 단일 뉴런에 대응하는 15개의 ROI는 전체 레코딩의 표준 편차 투영을 이용하여 선택되었다. (C)B.(D)C. 스케일 바, 100 μm에 표시된 해당 컬러 박스에 표시된 2개의 칼슘 흔적의 대표적인 줌인 뷰(100 μm)의 대표적인 형광 단일 시험 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig06large.jpg" target="_blank">흔적은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
형광 흔적을 얻기 위해, 신경 소마에 대응하는 관심 영역 (ROI)은 ImageJ 소프트웨어에 의해 수동으로 분할및 분석되었다. 영상 분석 모션 보정 이전에는 획득한 데이터 세트가 이미징 임플란트의 높은 안정성으로 인해 모션 아티팩트를 나타내지 않았기 때문에 깨어 있는 동물의 일반적인 사후 기록 절차가 필요하지 않았습니다. 깨어 있는 행동 마우스에서 해마에서 뉴런 활동의 대표적인 단일 시험 광학 기록은 도 6에제시된다. 신경소마에 대응하는 15개의 ROI는 도 6B에도시된 동일한 FOV로부터 수동으로 선택되었으며, 각 ROI 내의 단일 임상시험 형광 추적은 도 6C에도시된다. 도 6D는 두 개의 서로 다른 ROI에서 형광 흔적의 두 가지 대표적인 부분을 나타낸다. 우리는 3 일 간격으로 동일한 FOV에 대한 4 연속 이미징 세션을 수행했습니다. 적어도 2 주 동안 특정 FOV에서 동일한 뉴런을 식별하고 이미지화 할 수 있었다 (더 긴 이미징 세션은이 연구를 위해 수행되지 않았다, 그러나, 동일한 준비는 마우스에서 최대 6 개월 긴 이미징 연구를 위해 사용되었습니다이전 7; 그림 7). 본 연구에서는 AAV/DJ-CAG 벡터를 사용했는데, 이는 바이러스 전달 후 21일 후에도 관심 유전자의 강한 발현을유도하였다(보충도 도 1). 지속적인 발현은 칼슘 표시기를 표현하는 새로운 뉴런의 증가형 배경과 외관으로 인해 동일한 뉴런의 장기 적인 식별을 복잡하게 합니다. 따라서, 표적 유전자 발현을 구동하기 위한 AAV 혈청형 및 프로모터의 선택은 특히 뉴런의 동일한 하위 집합의 세로 이미징이 필요한 경우 실험 설계 중에 중요한 고려 사항 중 하나가 되어야 한다. 이미징 품질은 근위 점막을 해결하고 혈관을 시각화 할 수있었습니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig07v2.jpg"> 그림 7: 12일 동안 추적된 해마 영역에서 4개의 다른 FOV의 이미지 서열. 동물은 0 일에 창으로 이식되었고 7 일째에 rAAV / DJ-CAG-NCaMP7 바이러스를 주입했습니다. 애로우헤드는 FOV 내에서 추적된 뉴런을 나타냅니다. 스케일 바: 80 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
유전적으로 인코딩된 전압 센서를 사용하여 뉴런 활동의 생체 내 이미징. 이 연구에서는, 우리는 또한 동물7,8을행동하는 단세포 단면도 해상도로 전압 화상 진찰을 허용하는 SomArchon7이라는새로운 유전자 로 코딩된 전압센서를사용했습니다. SomArchon을 표현하기 위해, 우리는 주입 캐뉼라를 사용하여 rAAV / DJ-CAG-SomArchon 바이러스를 주입하고 헤드 고정 행동 마우스에 전압 이미징을 수행 며칠 후 주입. 뉴런 활성을 기록하기 위해 40x NA 0.8 객관적렌즈와 하마마츠 오르카퓨전 sCMOS 카메라를 사용하여 최대 830Hz 의 획득 속도로 150x40 μm FOV를 이미지화할 수 있었습니다. 스펙트럼의 가시 범위에서 발현의 시각화를 용이하게 하기 위해 SomArchon 구조의 일부인 GFP 단백질은 녹색 채널(470/20 nm에서 LED 여기, 방출 525/50 nm)에서 쉽게 배분하여 전압 이미징에 대한 관심 있는 세포를 찾을 수 있다. 광학 전압 레코딩은 근적외선 채널(레이저 여기 637 nm at 3.4 W/mm2,방출 665 nm 롱 패스)에서 수행되었으며 830Hz 획득 율로 4 x 4 비닝을 수행하였다. 우리는 행동 잠재력당 평균 SNR 7의 평균 SNR을 가진 깨어있는 마우스에서 해마 뉴런의 자발적인 활성을 기록하였다(그림8). 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig08.jpg"> 그림 8: 근적외선 형광을 유전적으로 인코딩된 전압 지표솜아콘을 사용하여 해마 뉴런내의 뉴런 활성을 기록한다. (A)근적외선 채널에서 광시야 형광 현미경하에서 이미지된 선택된 FOV. (B)A.(C)B. 스케일 바에 표시된 해당 상자에 전압 추적의 대표적인 줌인 뷰: 25 μm. 이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig08large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
조직학 기능적 이미징 연구가 수행된 후, 사후 분석은 임플란트의 올바른 배치, 바이러스 발현 영역 및 이미지 뉴런에 대한 관심 있는 단백질의 국소화를 확인하는 데 사용됩니다. 바이러스 발현 및 임플란트의 배치에 대한 조직학적 검증을 위해 PFA 고정 뇌의 관상 적 부분은 형광 광시야현미경(도 9A, C)으로검사하였다. 공초점 현미경은 칼슘 표시기를 표현하는 개별 뉴런의 고해상도 이미지를 획득하는 데 사용되었으며, 전압 표시기(도9B,D). DAPI 염색은 뇌 슬라이스의 전반적인 형태를 시각화하는 데 사용되었습니다. 또한, 뇌 슬라이스는 면역히스토케를 사용하여 창 이식 및 바이러스 성 발현으로 인한 천체 글리오오스증 또는 글리오사이스를 확인할 수 있다. 우리의 이전 연구는 절차가 눈에 띄는 글리오증을 유발하지 않았다는 것을 보여 주었다7.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig09.jpg"> 도 9: 광학 창 위치 및 바이러스 발현의 조직학적 검증. (A)NCaMP 표현 마우스로부터 광학 창의 배치를 보여주는 관상 부속절 뇌 슬라이스의 대표적인 형광 이미지. 스케일 바: 1mm.(B)NCaMP7 지표를 표현하는 뉴런의 대표적인 공초점 이미지. 스케일 바: 25 μm.(C)SomArchon 표현 마우스에서 광학 창의 배치를 보여주는 관상 단면 뇌 슬라이스의 대표적인 형광 이미지. 규모 막대: 1mm.(D)SomArchon 표시기를 표현하는 뉴런의 대표적인 공초점 이미지. 스케일 바: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충도 도 1: 표현 시간과 함께 상대형광 강도의 양분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

이 문서는 주입 캐뉼라와 마우스의 해마의 CA1 영역에 이식으로 보충 된 맞춤형 이미징 창의 준비를 보여줍니다.

마우스를 면도하는 해마에서 신경 활동을 시각화하기위한 두개골 절제술 절차

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

이봐, 얘들 아, 내 이름은 왕양동, 나는 웨스트 레이크 대학에 박사 키릴 피아트케비치 분자 바이오 엔지니어링 연구소에서 해요. 오늘, 나는 당신에게 마우스에서 해마의 신경 활동을 이미징절차에 대한 절차를 보여 줄거야, 생체 내. 용접 기를 켜고 필요한 온도까지 가열합니다.그림과 같이 도움의 손을 사용하여 이미징 캐뉼라와 주사 캐뉼라의 위치를 조정합니다. 바늘을 사용하여 소량의 적절한 유형의 플럭스를 이미징과 주입 캐뉼라 사이의 연결 반점에 5초 동안 적용한 다음 물방울을 제거합니다. 납땜 주석을 마운트하고 플럭스로 처리 된 연결 지점에 적용합니다.그것은 수술 하는 동안 만들기 위해 불필요한 더 큰 두개골을 필요로 하므로 과잉 납땜 주석을 피하십시오. 납땜 주석이 식을 때까지 기다립니다. 일반적으로 몇 초가 걸립니다.사출 캐뉼러가 양방향에서 더미 캐뉼라를 삽입하여 차단되지 않는지 확인합니다. 이쑤시개 또는 26게이지 주사기 바늘을 사용하여 이미징 캐뉼라의 하단에 UV 경화 광학 접착제를 적용합니다. 미세 트위저를 사용하여 해당 크기의 커버 유리를 이미징 캐뉼라에 조심스럽게 배치합니다.표준 핸드헬드 UV 램프에서 UV 조명으로 최소 한 시간 동안 접착제를 치료합니다. IACUC 승인 절차에 따라 이소플루란으로 마우스를 마취시화합니다. 수술 가열 패드 위에 스테레오 탁스 프레임에 마우스를 배치합니다.이어 바으로 머리를 고정하십시오. 머리를 사방으로 살짝 밀어 머리를 단단히 고정시합니다. 수술 중 동물의 눈이 건조되는 것을 방지하기 위해 눈 연고를 적용하십시오.트리머 또는 탈필 크림을 사용하여 목 뒤쪽에서 눈까지 털을 제거합니다. 베타딘으로 수술 부위를 살균한 후 70%에탄올을 세 번 이나 절개를 합니다. 두개골 의 상단에 피부를 제거, 머리의 모든 주위에 수평 컷으로 시작, 거의 눈꺼풀에 도달, 장밋 방향으로 두 컷 다음.그런 다음 중간선에 수렴되는 두 개의 경사 컷. 두 개의 멸균 면봉으로 연결 조직뿐만 아니라 목 뒤쪽의 근육을 두개골 가장자리까지 철회하십시오. 과도한 통증을 피하기 위해 2 분 동안 periosteum표면에 리도카인 용액 을 떨어 뜨립니다.두개골의 노출된 부위 전체를 메스로 부드럽게 긁어 내어 건조하고 거친 표면을 만듭니다. 바늘끝을 람다상에 놓아 AP 좌표가 0인지 확인하여 헤드 위치가 수직인지, ML 좌표가 0인지 확인하여 헤드가 수평으로 위치하는지 확인한다. 그렇지 않은 경우 AP 및 ML 좌표가 모두 0.1밀리미터 이내일 때까지 스테레오탁스 스테이션에서 특파원 노브를 조정합니다.바늘 끝을 이동하여 두개골 절제술에 대한 해당 지점을 찾고 미세 마커를 사용하여 두개골에 자신의 위치를 표시합니다. 4개의 표시된 점을 기반으로 원을 그리며 원의 캐뉼라 측에 주입 캐뉼라 영역의 윤곽선을 그립니다. 분당 10, 000 라운드의 속도로 공압 드릴을 사용하여 두개골에 표시된 윤곽선을 따라 부드럽게 드릴수 있습니다.두개골을 매우 얇은 뼈 층이 남을 때까지 드릴링하면 일반적으로 중앙에서 부드러운 터치로 흔들리기 시작합니다. 두개 내술의 중심에 멸균 PBS 한 방울을 바르는다. 매우 얇은 팁 집게 또는 두 개의 26 게이지 바늘반대쪽에서 접근 두개골에서 뼈 플랩을 들어 올립니다.PBS를 적용한 다음 부드러운 포부를 적용하고, 26 게이지 무딘 바늘을 여러 번 통해 두라의 표면을 청소하십시오. 피질과 해마 위의 코퍼스 캘로섬을 제거하려면 부드러운 흡입을 적용하십시오. 피질은 종종 코퍼스 캘로섬보다 더 황색입니다.그리고 코퍼스 캘로섬은 일반적으로 해마보다 넓습니다. 게다가, 코퍼스 Callosum은 상단에서 관찰 할 때 수직 및 수평 방향으로 가는 신경 섬유에 의해 구별하기가 정말 쉽습니다. 이 시점에서 출혈은 두개 내의 뇌 조직의 가시성에 영향을 미칩니다.PBS를 적용한 다음 부드러운 흡입을 하고 피질을 흡입하는 동안 코퍼스 캘로섬은 다이어그램에 비응하여 흰색 섬유의 방향으로 인식할 수 있습니다. 원형 모션에 부드러운 흡입을 적용하여 층별로 코퍼스 캘로섬 섬유 층을 제거합니다. PBS는 지속적으로 노출 된 뇌 조직 위에 축적 혈액을 제거하기 위해 적용된다.임플란트를 두개골 절제술에 부드럽게 삽입합니다. 임플란트의 표면을 해마의 노출 표면에 최대한 가깝게 배치하기 위해 L자 형 바늘로 임플란트 위에 단단히 누릅니다. 임플란트 주변의 흉터에 PBS를 반복적으로 적용한 다음, 임플란트 삽입 시 혈액을 최대한 제거하는 흡입을 합니다.임플란트와 두개골 사이에 빠른 물개 층을 가늘게 발라 치과 시멘트가 두개골 아래에 침투하는 것을 방지합니다. 빠른 씰이 경화되면 두개골 표면, 빠른 씰 표면 및 임플란트 표면에 슈퍼 본드를 고르게 적용하십시오. 슈퍼 결합이 경화되면 수술 초기에 만들어진 절개 주위의 피부뿐만 아니라 슈퍼 결합 위의 의치 베이스 수지를 적용하십시오.의치 베이스 수지가 경화 된 후, 임플란트 주위에 수지에 헤드 플레이트를 놓고 이미징 캐뉼라로 농축합니다. 헤드 플레이트 주변에 더 많은 틀니 베이스 수지를 적용하여 위치를 수정합니다. 몇 분 동안 치료하자.이미징 창에 더 잘 접근할 수 있도록 캐뉼라 주위에 두꺼운 시멘트 층을 쌓지 마십시오. 틀니 베이스 수지를 희석시켜 점도를 감소시켜 어플리케이터로 닿기 어려운 충치를 채울 수 있습니다. 창 위에 절연 고무 테이프를 부드럽게 놓고 동물 밴딩으로 인한 오염으로부터 창을 보호합니다.빠른 녹색 염료 스톡 솔루션을 바이러스 용액에 추가하여 PCR 튜브에서 1~ 9의 비율로 원하는 티터로 희석합니다. 바이러스 용액의 600 나노 리터를 철회하고 더미 캐뉼라를 제거하고 내부 캐뉼라를 삽입하여 유도칸룰라에 주입 주사기에 연결합니다. 분당 15 나노 리터의 속도로 바이러스를 주입하여 총 10 분 동안 주입하십시오.바이러스가 창 아래에 퍼질 수 있도록 내부 캐뉼라를 10분 동안 연결상태로 유지합니다. 가이드 캐뉼라에서 내부 캐뉼라를 부드럽게 제거하고 더미 캐뉼라로 다시 보냅니다. 마우스를 4%의 이소플루란으로 몇 분 동안 유도합니다.헤드 플레이트를 헤드 포크에 고정한 다음 머리 포크를 러닝머신에 고정합니다. 낮은 배율 목표 렌즈를 사용하여 기능성 이미징을 위한 뷰를 필터링할 수 있는 최상의 렌즈를 찾습니다. 그런 다음 더 높은 객관적렌즈로 전환하여 단일 세포 해상도에서 신경 활동을 기록합니다.칼슘 이미징의 경우, 표준 GFP 필터 감각을 사용하여 시판되는 470 나노미터 LED에 의해 녹색 형광이 흥분되었습니다. 형광 흔적을 얻기 위해, 뉴런 세포 질량에 대응하는 관심 영역을 수동으로 분할하고 ImageJ 소프트웨어에 의해 분석하였다. 40 X 렌즈 광학 전압 레코딩을 이용한 전압 이미징의 경우 830 Hertz 획득 율로 근적외선 채널에서 수행되었다.자발적인 신경 활동 기록은 최대 25, 000 프레임동안 지속적으로 지속되었습니다. 여기서, 우리는 마우스를 행동하는 A1 영역으로서 해마의 장기 화상 진찰을 위한 방법을 기술합니다. 이 방법은 만성 이식에 기초한다.이제 맞춤형 이미징 창으로, 또한 관심의 뉴런에 직접 바이러스 또는 약물의 표적 투여를 가능하게. 우리는 기술된 프로토콜이 간단하고 적당한 1 광자 화상 진찰 설정을 사용하여 마우스를 행동하는 마우스의 해마에 있는 높은 공간 측두성 해상도를 가진 신경 활동을 조사하는 것을 목표로 하는 연구를 촉진할 것이라는 점을 믿습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

여러인지 기능을 테스트 및 설치류에의 연결 활동을 녹음하기위한 완전 자동화된 고도 다목적 시스템

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

연구

신경과학

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

동물 행동하자, 깨어있는 단일 단위 레코딩을위한 Microwires의 조직 된 배열을 주입하기위한 절차

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

두뇌 활동의 중규모 넓은 필드 광학 이미징에 대한 큰 측면 개두술 절차

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

행동 하는 쥐의 해 마에서 진동 제한 공간 기록

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

자유롭게 행동 하는 쥐에 장기 감각 충돌

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...