Name: craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice
Uploaded: 2021-07-24T14:00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a todos os membros do Grupo de Bioengenharia Molecular da Universidade de Westlake por toda a ajuda e discussão útil. Agradecemos também jinze Li e Jie-Min Jia da Universidade de Westlake pela ajuda na filmagem do procedimento cirúrgico.
Este trabalho foi apoiado por financiamento inicial da Fundação da Universidade de Westlake, 2020 BBRF Young Investigator Grant, e National Natural Science Foundation of China grant 32050410298 all to K.D.P.

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	<li>Leutgeb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Codes+for+Spatial+and+Episodic+Memory+in+Hippocampal+Neuronal+Ensembles.">Independent Codes for Spatial and Episodic Memory in Hippocampal Neuronal Ensembles.</a> Science. 309 (5734), 619-623 (2005).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>Polanco, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+and+tau+complexity+-+towards+improved+biomarkers+and+targeted+therapies.">Amyloid-&#946; and tau complexity - towards improved biomarkers and targeted therapies.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2018).</li><li>Henneman, W. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+atrophy+rates+in+Alzheimer+disease.">Hippocampal atrophy rates in Alzheimer disease.</a> Added value over whole brain volume measures. 72 (11), 999-1007 (2009).</li><li>Camicioli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+is+associated+with+hippocampal+atrophy.">Parkinson's disease is associated with hippocampal atrophy.</a> Mov Disord. 18 (7), 784-790 (2003).</li><li>Piatkevich, K. D., Murdock, M. H., Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Engineering+and+Application+of+Optogenetic+Indicators+for+Neuroscience.">Advances in Engineering and Application of Optogenetic Indicators for Neuroscience.</a> Applied Sciences. 9 (3), 562 (2019).</li><li>Piatkevich, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+imaging+of+neural+activity+in+awake+behaving+mice.">Population imaging of neural activity in awake behaving mice.</a> Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).</li><li>Fan, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-Optical+Electrophysiology+Reveals+the+Role+of+Lateral+Inhibition+in+Sensory+Processing+in+Cortical+Layer+1.">All-Optical Electrophysiology Reveals the Role of Lateral Inhibition in Sensory Processing in Cortical Layer 1.</a> Cell. 180 (3), 521-535 (2020).</li><li>Shemesh, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+Calcium+Imaging+of+Dense+Neural+Populations+via+a+Cell-Body-Targeted+Calcium+Indicator.">Precision Calcium Imaging of Dense Neural Populations via a Cell-Body-Targeted Calcium Indicator.</a> Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).</li><li>Villa, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+Synapses+Are+Repeatedly+Assembled+and+Removed+at+Persistent+Sites+In+Vivo.">Inhibitory Synapses Are Repeatedly Assembled and Removed at Persistent Sites In Vivo.</a> Neuron. 89 (4), 756-769 (2016).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2013).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).</li><li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Genetically+Encoded+Bright+Positive+Calcium+Indicator+NCaMP7+Based+on+the+mNeonGreen+Fluorescent+Protein.">Novel Genetically Encoded Bright Positive Calcium Indicator NCaMP7 Based on the mNeonGreen Fluorescent Protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1644 (2020).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice.">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li><li>Kalmbach, A. S., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+surface+temperature+under+a+craniotomy.">Brain surface temperature under a craniotomy.</a> Journal of neurophysiology. 108 (11), 3138-3146 (2012).</li><li>Roche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+with+a+water+immersion+objective+affects+brain+temperature,+blood+flow+and+oxygenation.">In vivo imaging with a water immersion objective affects brain temperature, blood flow and oxygenation.</a> eLife. 8, 47324 (2019).</li><li>Watakabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analyses+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1,+2,+5,+8+and+9+in+marmoset,+mouse+and+macaque+cerebral+cortex.">Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex.</a> Neuroscience Research. 93, 144-157 (2015).</li><li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H., Manfredssonn, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Therapy for Neurological Disorders: Methods and Protocols. , 133-149 (2016).</li><li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+hippocampal+activity,+plasticity,+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition.">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li><li>Yashiro, H., Nakahara, I., Funabiki, K., Riquimaroux, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-endoscopic+system+for+functional+assessment+of+neural+circuits+in+deep+brain+regions:+Simultaneous+optical+and+electrical+recordings+of+auditory+responses+in+mouse's+inferior+colliculus.">Micro-endoscopic system for functional assessment of neural circuits in deep brain regions: Simultaneous optical and electrical recordings of auditory responses in mouse's inferior colliculus.</a> Neuroscience Research. 119, 61-69 (2017).</li><li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus.">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li><li>Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+In+Vivo+Imaging+of+Hippocampal+Dendrites+and+Spines.">High-Resolution In Vivo Imaging of Hippocampal Dendrites and Spines.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147 (2004).</li><li>Busche, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+soluble+amyloid-&#946;+for+early+hippocampal+hyperactivity+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Critical role of soluble amyloid-&#946; for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8740 (2012).</li><li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Consolidation+of+Ensemble+Neural+Plasticity+Patterns+in+Hippocampal+Area+CA1.">Long-Term Consolidation of Ensemble Neural Plasticity Patterns in Hippocampal Area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li><li>Castello-Waldow, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+neurons+with+stable+excitatory+connectivity+become+part+of+neuronal+representations.">Hippocampal neurons with stable excitatory connectivity become part of neuronal representations.</a> PLOS Biology. 18 (11), 3000928 (2020).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui descrevemos um método para imagens de longo prazo da região do hipocampo CA1 no comportamento de camundongos. O método baseia-se na implantação crônica de uma janela de imagem personalizada, que também permite a administração direcionada de vírus ou drogas diretamente aos neurônios de interesse. O presente protocolo consiste em quatro partes principais: i) montagem de implante de imagem; ii) instalação de implante de imagem; iii) injeção de vírus por meio de implante de imagem; iv) imagem funcional em camundongos comportadores. Abaixo descrevemos e discutimos etapas críticas no protocolo, solução de problemas, modificações e limitações do método. Também discutimos a importância do método e suas potenciais aplicações alternativas.
Existem várias etapas críticas no protocolo descrito que são bastante importantes para uma cirurgia bem sucedida: (i) preparação de um implante de imagem de alta qualidade; (ii) condições cirúrgicas estéreis; (iii) aspiração do córtex; (iv) colocação precisa do implante de imagem; v Injeção viral. Como o passo 1.6 indica, o excesso de solda de lata exigiria uma craniotomia maior e, assim, aumenta o risco de inflamação. Também é muito importante usar uma quantidade adequada da cola óptica adesiva ao fixar o vidro de cobertura na cânula de imagem, como indicado na Etapa 1.11, pois uma quantidade insuficiente pode resultar em vazamento de fluido cefalorraquidiano na cânula de imagem e tornando-o opaco. Por outro lado, o excesso de adesivo óptico pode resultar na diminuição da transparência da janela de vidro. Uma possível contaminação do implante de imagem pode causar uma proliferação ativa do tecido conjuntivo sob a janela óptica e/ou inflamação grave, o que levará ao término precoce do experimento. Portanto, a montagem e preparação do implante de imagem antes da cirurgia é quase tão importante quanto o procedimento cirúrgico em si.
Durante a cirurgia, a parte do córtex sob craniotomia é ablada pela aspiração suave, o que resulta em sangramento inevitável. O sangue no local cirúrgico reduz significativamente a visibilidade do tecido cerebral que deve ser removido. Isso complica a avaliação precisa da profundidade necessária da ablação tecidual. A descarga cuidadosa do local cirúrgico com PBS toda vez antes de aplicar sucção para remover a próxima porção de tecido proporciona um melhor controle da profundidade. O tecido cerebral deve ser sempre removido em pequenas porções passo a passo confirmando a profundidade do tecido ablado antes de prosseguir com mais sucção. Um controle mais fino da sucção também pode ser alcançado com uma agulha sem corte mais fina. Sugerimos o uso de uma agulha de 26 G, no entanto, diâmetro menor que 26 G é mais propenso a entupimento. Além disso, geralmente é preciso muita prática para determinar a profundidade precisa da aspiração necessária para cada animal, já que a cor do córtex, corpus calosum e hipocampo pode variar de rato para rato(Figura 3).
A inserção e a fixação do implante de imagem devem ser feitas com muita precisão para garantir a posição mais próxima possível da janela de imagem à superfície dorsal do hipocampo. O tamanho da craniotomia preparada deve coincidir com o implante e permitir sua inserção sem resistência significativa. Ao mesmo tempo, não deve haver uma lacuna visível entre o crânio e o implante para garantir a vedação adequada e evitar a exposição ao tecido cerebral. A pressão suave e estável deve ser aplicada na parte superior do implante durante a vedação do crânio. É quase inevitável ter sangue sob a janela de imagem durante a instalação do implante. Se o procedimento cirúrgico for feito corretamente, a janela deve sair em 3-7 dias, e a vasculatura cerebral torna-se claramente visível. Também é importante garantir que o vírus seja injetado corretamente sob a janela. No caso de expressão falha, o vírus pode ser reinjetado várias vezes.
A maior complicação que encontramos em alguns casos é a visibilidade reduzida da janela de imagem. Existem várias razões possíveis para a má qualidade da imagem: i) inflamação contínua; ii) crescimento do tecido conjuntivo no vidro; iii) grande lacuna entre a janela e o hipocampo. A inflamação geralmente é causada por contaminação durante a cirurgia ou por implante de imagem não devidamente esterilizado. Sugerimos autoclavar os instrumentos cirúrgicos antes e depois de cada cirurgia, desinfetar a área cirúrgica logo antes do procedimento e usar equipamentos de proteção pessoal limpos durante a cirurgia. Os implantes de imagem devem ser limpos após a montagem, esterilizados e armazenados em condições estéreis. O crescimento do tecido conjuntivo no vidro do implante de imagem pode ser devido à contaminação mecânica na superfície do vidro ou ao trauma excessivo do tecido cerebral durante a ablação do córtex. Após a montagem do implante, é importante confirmar que a superfície do vidro está limpa e lisa. Além disso, todos os pedaços de tecido cerebral danificado devem ser cuidadosamente removidos antes de inserir implante de imagem na craniotomia. Em certos casos, a distância entre a janela de vidro e o hipocampo resulta no acúmulo de fluido cefalorraquidiano, reduzindo a qualidade da imagem. Portanto, durante a instalação do implante, é crucial inseri-lo até o fim para garantir um bom contato entre hipocampo e janela de vidro. Às vezes, é difícil identificar a razão exata da janela de imagem opaca. Sugerimos a realização de análises post-mortem para revelar condições sob a janela óptica e ajustar correspondentemente cirurgias subsequentes.
O método possui diversas limitações fundamentais e técnicas que devem ser levadas em conta antes e durante a imagem in vivo. Uma das principais limitações é a ablação do córtex. Parte do córtex visual e sensorial é removida durante a cirurgia. Embora seja difícil avaliar precisamente o impacto da ablação do córtex, uma vez que o tecido cerebral removido não se projeta diretamente no hipocampo, vários estudos não demonstraram prejuízo perceptível da aprendizagem dependente do hipocampo ou de outras funções relevantes do hipocampo15,16. As limitações ópticas também devem ser consideradas, especialmente quando são usadas lentes objetivas na altas. Por exemplo, neste estudo, utilizamos uma cânula de 1,75 mm de comprimento com diâmetro interno de 1,9 mm. A geometria desta cânula não preservará o objetivo de ar completo com NA mais de ~0,5 ou objetivo de água com NA mais de ~0,6, pois cortará um pouco de luz. Outra limitação, comum para todos os implantes de imagem cerebral, é que parte do cérebro está sendo exposta, promovendo assim perda de calor17,18. No entanto, a temperatura fisiológica do cérebro pode ser facilmente restaurada durante a imagem por perfusão de um tampão quente.
O método descrito pode ser facilmente modificado ou ajustado para outras aplicações. Por exemplo, a preparação pode ser adaptada para imagem do estriato7. Como o estriado está ligeiramente mais profundo que o hipocampo, a cânula de imagem mais longa deve ser usada para a montagem do implante de imagem. Sugerimos usar cânula de imagem de 2,0 mm. As coordenadas da craniotomia devem ser ajustadas correspondentemente (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Além disso, a injeção de vírus via cânula de infusão permite alcançar a expressão de um transgênico em uma fina camada de neurônios ao usar sorotipo AAV com propagação restrita19,20. É particularmente benéfico para a imagem de um fóton devido à redução da fluorescência fora do foco de camadas mais profundas e, como resultado, melhorou a imagem de resolução unicelular. Além disso, a cânula de injeção também pode ser usada durante a imagem funcional para a administração de medicamentos ou outros produtos químicos diretamente nos neurônios em FOV (Figura 5B). A cânula de infusão geral adiciona funcionalidades úteis ao implante de imagem, melhorando a qualidade da imagem devido à expressão viral direcionada e permitindo a estimulação farmacológica dos neurônios em FOV. A placa de cabeça usada proporciona uma estabilidade extraordinária do implante de imagem minimizando artefatos de movimento mesmo em animais em movimento ativo em uma esteira. A placa da cabeça é pequena e leve, causando um mínimo de desconforto aos animais, e permanece estável por vários meses após a instalação. O implante de imagem também é compatível com imagens multifotonas15,16,21 e pode ser combinado com micro-endoscópios22,23. Um implante de imagem semelhante também foi utilizado para imagens multifotonas das estruturas mais profundas do hipocampo, incluindo radiador de estrato, lacunose estrato e giro dentado16,24,25,26,27. No entanto, direcionar as estruturas mais profundas do hipocampo com AAVs via cânula de infusão pode exigir maior otimização do sorotipo AAV e volume19.
Acreditamos que o protocolo descrito facilitará estudos que visam investigar a atividade neuronal com alta resolução espacial no hipocampo de comportamento de camundongos usando configurações simples e acessíveis de imagem de um fóton.

O hipocampo é uma região cerebral chave responsável pelo aprendizado e memória1, bem como pela navegação espacial2. A atrofia hipocampal está associada a distúrbios neurológicos e psiquiátricos envolvendo perda de memória e declínio cognitivo3,4,5. Em camundongos, o hipocampo é um modelo muito bem estabelecido para estudar a formação de aprendizagem e memória espacial, contextual e associativa nos níveis celular e de rede4,5. Os estudos mecanicistas de aprendizagem e memória requerem interrogatório longitudinal da estrutura neuronal e função no comportamento de camundongos. A imagem de fluorescência em combinação com sondas geneticamente codificadas6 fornece capacidades sem precedentes para registrar dinâmica de tensão de membrana7,8, transitórios de cálcio9, e alterações estruturais10 sobre grandes subconjuntos de neurônios intravitalmente. No entanto, o acesso óptico ao hipocampo em camundongos é obstruído pelo córtex, que pode atingir mais de 1 mm de espessura. Aqui, descrevemos um procedimento para a montagem de um dispositivo de imagem personalizado e sua implantação crônica na cabeça do rato para acesso óptico de longo prazo à sub-região CA1 do hipocampo dorsal no comportamento de ratos. A cânula de infusão integrada ao implante de imagem permite a administração de vírus ou drogas diretamente nos neurônios no campo de visão. A preparação descrita em combinação com microscopia de campo largo permite imagens recorrentes dos grandes subconjuntos de neurônios no comportamento de camundongos por longos períodos de tempo. Utilizamos esta preparação para expressar indicadores geneticamente codificados de cálcio e tensão na região hipocampal de CA1 através da injeção direcionada de vírus adeno associado a adeno recombinante (rAAV) para registros de atividade neuronal em resolução unicelular. Também foram realizadas imagens longitudinal de cálcio dos subconjuntos neuronais correspondentes em alta resolução espacial em animais de comportamento. Além disso, essa preparação é compatível com microscopia multifotítula e microendoscopia, expandindo ainda mais a caixa de ferramentas de técnicas de imagem para estudar redes neuronais em níveis celulares e subcelulares no comportamento de camundongos. Descrevemos etapas críticas e solução de problemas do protocolo. Também discutimos as possíveis armadilhas e limitações do método.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Deckgl&#228;ser</td>
			<td>72296-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denture&#160;base resin</td>
			<td>ShangHai New Centery Dentel Material</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Type I, self-solidifying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dummy Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62102</td>
			<td>OD 0.30mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62003</td>
			<td>26G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Fork</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Cannula</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62203</td>
			<td>&#160;0.30*0.14 (OD*ID, mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBond C&#38;B</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SuperBond C&#38;B kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill Kit</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-cured Adhesive</td>
			<td>NORLAND PRODUCTS</td>
			<td>NOA 60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice

Imagens de atividades neuronais em resolução unicelular em animais de comportamento acordados é uma abordagem muito poderosa para a investigação de funções de circuito neural em sistemas neurociência. No entanto, alta absorção e dispersão de luz no tecido mamífero limitam a imagem intravital principalmente a regiões cerebrais superficiais, deixando áreas cerebrais profundas, como o hipocampo, fora do alcance da microscopia óptica. Neste vídeo, mostramos a preparação e implantação da janela de imagem personalizada para permitir imagens in vivo crônicas da região do CA1 hipocampal dorsal em camundongos comportados com cabeça fixa. A janela personalizada é suplementada com uma cânula de infusão que permite a entrega direcionada de vetores e medicamentos virais para a área de imagem. Combinando esta preparação com imagens de campo amplo, realizamos um registro a longo prazo da atividade neuronal usando um indicador de cálcio fluorescente de grandes subconjuntos de neurônios no comportamento de camundongos ao longo de várias semanas. Também demonstramos a aplicabilidade desta preparação para imagens de tensão com resolução de pico único. Indicadores geneticamente codificados de alto desempenho da atividade neuronal e câmeras CMOS científicas permitiram a visualização recorrente de detalhes morfológicos subcelulares de neurônios únicos em alta resolução temporal. Também discutimos as vantagens e limitações potenciais do método descrito e sua compatibilidade com outras técnicas de imagem.

Imagem in vivo da atividade neuronal usando um indicador de cálcio geneticamente codificado. Em média, a imagem in vivo começa de 3 a 4 semanas após a implantação se um nível suficiente de expressão transgênica for alcançado. A essa altura, edema cerebral e hemorragia geralmente são completamente resolvidos, e a vasculatura cerebral pode ser facilmente observada através da janela óptica. Aqui utilizamos a preparação descrita para realizar as repetidas gravações de atividade neuronal na região do CA1 hipocampal dorsal no comportamento de camundongos sob microscópio de campo largo fluorescência. Para registrar a atividade neuronal, utilizamos um indicador de cálcio geneticamente codificado brilhante, chamado NCaMP713, que apresenta sensibilidade de cálcio semelhante e resolução temporal à de GCaMP6s14. Para expressar o indicador NCaMP7 no hipocampo, injetamos o vírus rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 usando uma cânula de infusão e iniciamos imagens longitude aos 14 dias após a injeção. Para registrar a atividade neuronal, utilizamos uma lente objetiva de ar 10x NA 0.3 e a câmera sCMOS da Hamamatsu OrcaFusion que permitia imagens a ~1,5x1,5 mm FOV em até 100 Hz de frequência. A fluorescência verde estava entusiasmada com um LED de 470 nm comercialmente disponível usando um conjunto de filtro gfp padrão. A profundidade média de imagem alcançada no canal verde é de cerca de 50-120 μm, o que permite o registro da atividade neuronal principalmente em estrato oriens e estrato pyramidale. A profundidade de imagem em canais infravermelhos próximos pode ser de até 200 μm atingindo as camadas mais profundas do hipocampo8. O tempo médio de gravação por FOV foi de 6 a 12 minutos, embora sessões de imagem muito mais longas sejam possíveis, pois o NCaMP7 é caracterizado por uma fotoesestabilidade extremamente alta e não foi observada fototoxicidade detectável(Figura 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig06.jpg"> Figura 6: Registro da atividade neuronal nos neurônios hipocampais usando um indicador de cálcio geneticamente codificado por fluorescência verde. (A) Um FOV selecionado imagem sob um microscópio de fluorescência de campo largo no canal verde. (B) Os 15 ROIs correspondentes aos neurônios únicos mostrados em A e selecionados utilizando-se a projeção de desvio padrão de toda a gravação. (C) Fluorescência representativa traços de ensaio único dos 15 neurônios selecionados em B. (D) Uma visão de zoom representativa de 2 traços de cálcio mostrados em caixas de cor correspondentes mostradas na barra C. Escala, 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig06large.jpg" target="_blank">desta figura.</a>
Para obter traços de fluorescência, as regiões de interesse (ROIs) correspondentes às somas neuronais foram segmentadas manualmente e analisadas pelo software ImageJ. Antes da correção do movimento de análise de imagens, não eram necessários procedimentos comuns pós-registro em animais acordados, pois os conjuntos de dados adquiridos não apresentavam artefatos de movimento devido à alta estabilidade do implante de imagem. Um registro óptico representativo de atividades neuronais do hipocampo em um rato comportado acordado é apresentado na Figura 6. 15 ROIs correspondentes às somas neuronais foram selecionados manualmente do mesmo FOV mostrado na Figura 6B, e os traços de fluorescência de ensaio único dentro de cada ROI são mostrados na Figura 6C. A Figura 6D mostra duas partes representativas de traços de fluorescência de dois ROIs diferentes. Foram realizadas 4 sessões consecutivas de imagem para o mesmo FOV com intervalos de 3 dias. Foi possível identificar e imaginar os mesmos neurônios em certos FOVs por pelo menos duas semanas (as sessões de imagem mais longas não foram realizadas para este estudo, no entanto, a mesma preparação tem sido usada para até 6 meses de estudo de imagem em camundongos anteriormente7; Figura 7). Neste estudo, utilizamos vetor AAV/DJ-CAG, que conduzia uma forte expressão do gene de interesse mesmo 21 dias após a entrega do vírus(Figura Suplementar 1). A expressão contínua complicou a identificação a longo prazo dos mesmos neurônios devido ao aumento do histórico de fluorescência e aparência de novos neurônios expressando o indicador de cálcio. Portanto, a seleção do sorotipo AAV e do promotor para conduzir a expressão genética alvo deve ser uma das considerações importantes durante o design experimental, em particular se a imagem longitudinal do mesmo subconjunto de neurônios for necessária. A qualidade da imagem permitiu resolver dendritos proximais, bem como visualizar vasos sanguíneos.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig07v2.jpg"> Figura 7: Sequência de imagem de quatro FOVs diferentes da área hipocampal rastreada ao longo de 12 dias. O animal foi implantado com a janela no dia 0 e foi injetado com o vírus rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 no dia 7. Pontas de flecha indicam o neurônio rastreado dentro do FOV. Barras de escala: 80 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Imagem in vivo de atividade neuronal usando um sensor de tensão geneticamente codificado. Neste estudo, também utilizou-se um novo sensor de tensão geneticamente codificado, chamado SomArchon7,que permite a imagem de tensão com resolução de um único pico de células em animais de comportamento7,8. Para expressar o SomArchon, injetamos o vírus rAAV/DJ-CAG-SomArchon usando uma cânula de infusão e realizamos imagens de tensão em um rato de comportamento fixo na cabeça vários dias após a injeção. Para registrar a atividade neuronal, utilizamos uma lente objetiva 40x NA 0.8 e uma câmera sCMOS de Hamamatsu OrcaFusion que nos permitiu a imagem de 150x40 μm FOV a uma taxa de aquisição de até 830 Hz. A proteína GFP, que uma parte da SomArchon constrói para facilitar a visualização da expressão na faixa visível do espectro, pode ser facilmente visualizada no canal verde (excitação led a 470/20 nm, emissão de 525/50 nm) para localizar células de interesse para imagens de tensão. Foram realizadas gravações de tensão óptica no canal infravermelho próximo (excitação a laser de 637 nm a 3,4 W/mm2, emissão de 665 nm de passagem longa) com binning de 4 x 4 a 830 Hz de taxa de aquisição. Registramos a atividade espontânea de um neurônio hipocampal em um camundongo acordado com SNR médio de 7 por potencial de ação(Figura 8). 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig08.jpg"> Figura 8: Registro da atividade neuronal nos neurônios hipocampais usando um indicador de fluorescência infravermelha quase infravermelha geneticamente codificada SomArchon. (A) Um FOV selecionado imagem sob microscópio de fluorescência de campo largo no canal quase infravermelho. (B) Traço de fluorescência de ensaio único do neurônio em A. (C) Uma visão de zoom representativa do traço de tensão na caixa correspondente mostrada em B. Barra de escala: 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig08large.jpg" target="_blank">desta figura.</a>
histologia Após o estudo de imagem funcional, a análise pós-morte é usada para confirmar a correta colocação do implante, a área de expressão do vírus e a localização de uma proteína de interesse em neurônios imaged. Para verificação histológica da expressão do vírus e colocação do implante, seções coronais do cérebro fixo pfa foram examinadas sob um microscópio de campo largo fluorescência(Figura 9A, C). Um microscópio confocal foi utilizado para adquirir imagens de alta resolução de neurônios individuais expressando o indicador de cálcio, bem como o indicador de tensão (Figura 9B, D). A coloração da DAPI foi usada para visualizar a morfologia geral da fatia cerebral. Além disso, as fatias cerebrais podem ser avaliadas usando imunohistoquímica para verificar astrogliose ou gliose causada pela implantação da janela e expressão viral. Nossos estudos anteriores demonstraram que o procedimento não induzia gliose perceptível7.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig09.jpg"> Figura 9: Verificação histológica da posição da janela óptica e expressão do vírus. (A) Uma imagem fluorescente representativa da fatia cerebral da seção coronal mostrando a colocação da janela óptica de um mouse expresso em NCaMP. Barra de escala: 1 mm. (B) Uma imagem confocal representativa dos neurônios expressando os indicadores NCaMP7. Barra de escala: 25 μm. (C) Uma imagem representativa da fluorescência da fatia cerebral da seção coronal mostrando a colocação da janela óptica de um rato expresso da SomArchon. Barra de escala: 1 mm. (D) Uma imagem confocal representativa dos neurônios expressando os indicadores SomArchon. Barra de escala: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Análise quantitiva da intensidade relativa da fluorescência juntamente com o tempo de expressão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>

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Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Este artigo demonstra a preparação de uma janela de imagem personalizada complementada com cânula de infusão e sua implantação na região ca1 do hipocampo em camundongos.

Procedimento de craniotomia para visualizar atividades neuronais no hipocampo de ratos comportadores

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Pessoal, meu nome é Wang Yangdong, e sou do Laboratório de Bioengenharia Molecular Dr. Kiryl Piatkevich na Universidade de Westlake. Hoje, vou mostrar o procedimento para imagens de atividades neuronais de hipocampo em camundongos, in vivo. Ligue a máquina de solda e aqueça-a até a temperatura necessária.Ajuste a posição da cânula de imagem e da cânula de injeção usando mãos amigas como mostrado na figura. Usando a seringa com a agulha, aplique uma pequena quantidade de fluxo apropriado nos pontos de conexão entre a imagem e a cânula de injeção por cinco segundos e, em seguida, remova a gota. Monte a lata de solda e aplique-a no ponto de conexão tratado com o fluxo.Evite o excesso de estanho de solda, pois exigirá um crânio maior desnecessário para fazer durante a cirurgia. Espere a lata de solda esfriar. Normalmente, leva vários segundos.Confirme se a cânula de injeção não está bloqueada inserindo a cânula fictícia de ambas as direções. Aplique adesivo óptico de cura UV na parte inferior da cânula de imagem usando um palito ou agulha de seringa de calibre 26. Use uma pinça fina para colocar cuidadosamente um copo de cobertura do tamanho correspondente à cânula de imagem.Cure o adesivo por pelo menos uma hora por iluminação UV a partir de uma lâmpada UV portátil padrão. Anestesiar o camundongo com isoflurano de acordo com o procedimento aprovado pela IACUC. Coloque o mouse em uma estrutura estereotaxa sobre uma almofada de aquecimento de cirurgia.Segure a cabeça com barras de ouvido. Empurre ligeiramente a cabeça em todas as direções para garantir que a cabeça esteja segura. Aplique pomada ocular para evitar que os olhos do animal sequem durante a cirurgia.Use um aparador ou creme depilatório para remover a pele da parte de trás do pescoço até os olhos. Esterilize o local cirúrgico com betadina seguido de 70% de etanol três vezes antes de fazer uma incisão. Remova a pele sobre a parte superior do crânio, começando com o corte horizontal ao redor da base da cabeça, seguido por dois cortes na direção rostral, quase atingindo as pálpebras.Em seguida, dois cortes oblíquos que convergem na linha média. Com dois cotonetes estéreis, retraia o tecido de conexão, bem como a musculatura da parte de trás do pescoço até as bordas do crânio. Aplique uma gota de solução de lidocaína na superfície do periósteo por dois minutos para evitar dor excessiva.Raspe suavemente toda a área exposta do crânio com um bisturi para criar uma superfície seca e áspera. Coloque a ponta da agulha sobre a Lambda para ver se a coordenada AP é zero para confirmar se a posição da cabeça é vertical, bem como se a coordenada ML é zero, para confirmar se a cabeça está posicionada horizontalmente. Caso não, ajuste os botões correspondentes na estação estereotaxic até que as coordenadas AP e ML estejam dentro de 0,1 milímetros.Mova a ponta da agulha para encontrar os pontos correspondentes para craniotomia e marque suas posições no crânio, usando um marcador fino. Desenhe um círculo baseado em quatro pontos marcados, bem como o contorno da área da cânula de injeção no lado da cânula do círculo. Use uma broca pneumática à velocidade de 10.000 balas por minuto para perfurar suavemente ao longo do contorno marcado no crânio.Perfurar o crânio até que uma camada muito fina de osso seja deixada, que geralmente começa a se mexer sob um toque suave no centro. Aplique uma gota de PBS estéril no centro da craniotomia. Levante a aba óssea do crânio com fórceps inclinados muito finos ou duas agulhas de calibre 26 que se aproximam dos lados opostos.Aplique PBS seguido de aspirações suaves, através de uma agulha de calibre 26 várias vezes para limpar a superfície da dura. Aplique sucção suave para ablatar o córtex, bem como o Corpus Callosum acima do hipocampo. O córtex é muitas vezes mais amarelo que o Corpus Callosum.E o Corpus Callosum é geralmente mais largo que o hipocampo. Além disso, o Corpus Callosum é realmente fácil de distinguir por fibras neuronais indo nas direções vertical e horizontal quando observado a partir do topo. O sangramento neste momento afetará a visibilidade do tecido cerebral na craniotomia.Aplique PBS, seguido de sucção suave, enquanto você está aspirando o córtex para se livrar do sangue, Corpus Callosum pode ser reconhecido pela direção das fibras brancas como esquematicamente mostrado no diagrama. Remova as fibras de Corpus Callosum camada por camada, aplicando sucção suave em um movimento circular. A PBS é constantemente aplicada para se livrar do sangue acumulado acima do tecido cerebral exposto.Insira suavemente o implante na craniotomia. Pressione firmemente em cima do implante com a agulha em forma de L para posicionar a janela óptica do implante o mais perto possível da superfície exposta do hipocampo. Aplique repetidamente PBS na cicatriz ao redor do implante, seguida de sucção para remover o sangue o máximo possível durante a inserção do implante.Aplique uma fina camada de vedação rápida entre o implante e o crânio para evitar que o cimento dental penetre sob o crânio. Uma vez que a vedação rápida seja curada, aplique super ligação uniformemente na superfície do crânio, na superfície da vedação rápida e na superfície do implante. Uma vez que o super vínculo é curado, aplique resina base de dentadura acima da super ligação, bem como a pele em torno da incisão feita no início da cirurgia.Depois que a resina da base de dentadura for curada, coloque a placa da cabeça sobre a resina ao redor do implante e faça-a se concentrar com a cânula de imagem. Aplique mais resina de base de dentadura ao redor e acima da placa da cabeça para corrigir sua posição. Deixe curar por vários minutos.Evite construir uma camada espessa de cimento ao redor da cânula para garantir um melhor acesso à janela de imagem é a lente objetiva. Diluir a resina da base de dentadura para diminuir sua viscosidade, permitindo assim que ela preencha as cavidades que são difíceis de alcançar com um aplicador. Coloque suavemente uma fita de borracha isolada acima da janela para proteger a janela de uma possível contaminação da banda animal.Adicione a solução de estoque de corante Fast Green à solução de vírus diluí-la ao titer desejado na proporção de um a nove, em um tubo PCR. Retire 600 nano litros da solução do vírus, remova a cânula falsa e insira a cânula interna conecte-a à seringa de injeção na cânula guia. Infundir o vírus à velocidade de 15 nano litros por minuto, por 10 minutos no total.Mantenha a cânula interna conectada por 10 minutos para permitir que o vírus se espalhe sob a janela. Remova suavemente a cânula interna da cânula guia e recapitule-a com a cânula falsa. Induzir o rato com 4% de isoflurane por alguns minutos.Conserte a placa da cabeça no garfo da cabeça e, em seguida, fixe o garfo da cabeça na esteira. Use uma lente objetiva de baixa ampliação para encontrar o melhor para filtrar a visualização para imagens funcionais. Em seguida, mude para uma lente objetiva mais alta para registrar as atividades neuronais na resolução de células únicas.Para a imagem de cálcio, a fluorescente verde estava entusiasmada com um LED de 470 nanômetros comercialmente disponível usando um sentido padrão de filtro GFP. Para obter traços fluorescentes, as regiões de interesses correspondentes à massa celular neuronal foram segmentadas manualmente e analisadas pelo software ImageJ. Para imagens de tensão usando uma lente de 40 X foram realizadas gravações de tensão óptica no canal infravermelho próximo a 830 taxas de aquisição de Hertz.O registro de atividade neural espontânea durou continuamente até 25.000 quadros. Aqui, descrevemos um método para imagens de longo prazo do hipocampo como uma região A1 no comportamento de camundongos. O método é baseado na implantação crônica.Agora, a janela de imagem personalizada, que também permite a administração direcionada de vírus ou drogas diretamente aos neurônios de interesse. Acreditamos que o protocolo descrito facilitará os estudos que visam investigar a atividade neuronal com alta resolução temporal espacial no hipocampo de comportamento de camundongos usando configurações simples e acessíveis de imagem de 1 fóton.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

Um sistema totalmente automatizado e altamente versátil para testes de várias funções cognitivas e registro das atividades neuronais em roedores

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Neurociência

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Um Procedimento para Implantação de Arrays organizado de microfios para gravações a única unidade em Awake, comportando-se Animais

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Gravações simultâneas de longo prazo em dois estágios de processamento neuronal em comportar abelhas

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Um Procedimento craneotomia Lateral Grande para Wide-campo Mesoscale imagens ópticas de atividade cerebral

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice

Procedimento de gravação Polygraphic para medição Sleep in Mice

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

Gravação espacialmente restrita oscilações no hipocampo de ratos de comportar-se

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

A longo prazo conflito sensorial em livremente, comportando-se ratos

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...