Name: craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice
Uploaded: 2021-07-24T14:00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice at JoVE.com

Vi vill tacka alla medlemmar i Molecular BioEngineering Group vid Westlake University för all hjälp och användbar diskussion. Vi tackar också Jinze Li och Jie-Min Jia från Westlake University för hjälpen med att filma det kirurgiska ingreppet.
Detta arbete stöddes av start-up finansiering från Foundation of Westlake University, 2020 BBRF Young Investigator Grant och National Natural Science Foundation of China grant 32050410298 all to K.D.P.

<ol>
	<li>Leutgeb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Codes+for+Spatial+and+Episodic+Memory+in+Hippocampal+Neuronal+Ensembles.">Independent Codes for Spatial and Episodic Memory in Hippocampal Neuronal Ensembles.</a> Science. 309 (5734), 619-623 (2005).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>Polanco, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+and+tau+complexity+-+towards+improved+biomarkers+and+targeted+therapies.">Amyloid-&#946; and tau complexity - towards improved biomarkers and targeted therapies.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2018).</li><li>Henneman, W. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+atrophy+rates+in+Alzheimer+disease.">Hippocampal atrophy rates in Alzheimer disease.</a> Added value over whole brain volume measures. 72 (11), 999-1007 (2009).</li><li>Camicioli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+is+associated+with+hippocampal+atrophy.">Parkinson's disease is associated with hippocampal atrophy.</a> Mov Disord. 18 (7), 784-790 (2003).</li><li>Piatkevich, K. D., Murdock, M. H., Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Engineering+and+Application+of+Optogenetic+Indicators+for+Neuroscience.">Advances in Engineering and Application of Optogenetic Indicators for Neuroscience.</a> Applied Sciences. 9 (3), 562 (2019).</li><li>Piatkevich, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+imaging+of+neural+activity+in+awake+behaving+mice.">Population imaging of neural activity in awake behaving mice.</a> Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).</li><li>Fan, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-Optical+Electrophysiology+Reveals+the+Role+of+Lateral+Inhibition+in+Sensory+Processing+in+Cortical+Layer+1.">All-Optical Electrophysiology Reveals the Role of Lateral Inhibition in Sensory Processing in Cortical Layer 1.</a> Cell. 180 (3), 521-535 (2020).</li><li>Shemesh, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+Calcium+Imaging+of+Dense+Neural+Populations+via+a+Cell-Body-Targeted+Calcium+Indicator.">Precision Calcium Imaging of Dense Neural Populations via a Cell-Body-Targeted Calcium Indicator.</a> Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).</li><li>Villa, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+Synapses+Are+Repeatedly+Assembled+and+Removed+at+Persistent+Sites+In+Vivo.">Inhibitory Synapses Are Repeatedly Assembled and Removed at Persistent Sites In Vivo.</a> Neuron. 89 (4), 756-769 (2016).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2013).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).</li><li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Genetically+Encoded+Bright+Positive+Calcium+Indicator+NCaMP7+Based+on+the+mNeonGreen+Fluorescent+Protein.">Novel Genetically Encoded Bright Positive Calcium Indicator NCaMP7 Based on the mNeonGreen Fluorescent Protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1644 (2020).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice.">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li><li>Kalmbach, A. S., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+surface+temperature+under+a+craniotomy.">Brain surface temperature under a craniotomy.</a> Journal of neurophysiology. 108 (11), 3138-3146 (2012).</li><li>Roche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+with+a+water+immersion+objective+affects+brain+temperature,+blood+flow+and+oxygenation.">In vivo imaging with a water immersion objective affects brain temperature, blood flow and oxygenation.</a> eLife. 8, 47324 (2019).</li><li>Watakabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analyses+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1,+2,+5,+8+and+9+in+marmoset,+mouse+and+macaque+cerebral+cortex.">Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex.</a> Neuroscience Research. 93, 144-157 (2015).</li><li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H., Manfredssonn, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Therapy for Neurological Disorders: Methods and Protocols. , 133-149 (2016).</li><li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+hippocampal+activity,+plasticity,+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition.">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li><li>Yashiro, H., Nakahara, I., Funabiki, K., Riquimaroux, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-endoscopic+system+for+functional+assessment+of+neural+circuits+in+deep+brain+regions:+Simultaneous+optical+and+electrical+recordings+of+auditory+responses+in+mouse's+inferior+colliculus.">Micro-endoscopic system for functional assessment of neural circuits in deep brain regions: Simultaneous optical and electrical recordings of auditory responses in mouse's inferior colliculus.</a> Neuroscience Research. 119, 61-69 (2017).</li><li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus.">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li><li>Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+In+Vivo+Imaging+of+Hippocampal+Dendrites+and+Spines.">High-Resolution In Vivo Imaging of Hippocampal Dendrites and Spines.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147 (2004).</li><li>Busche, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+soluble+amyloid-&#946;+for+early+hippocampal+hyperactivity+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Critical role of soluble amyloid-&#946; for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8740 (2012).</li><li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Consolidation+of+Ensemble+Neural+Plasticity+Patterns+in+Hippocampal+Area+CA1.">Long-Term Consolidation of Ensemble Neural Plasticity Patterns in Hippocampal Area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li><li>Castello-Waldow, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+neurons+with+stable+excitatory+connectivity+become+part+of+neuronal+representations.">Hippocampal neurons with stable excitatory connectivity become part of neuronal representations.</a> PLOS Biology. 18 (11), 3000928 (2020).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Här beskriver vi en metod för långsiktig avbildning av hippocampus CA1-regionen i att bete möss. Metoden är baserad på kronisk implantation av ett skräddarsyt bildfönster, vilket också möjliggör riktad administrering av virus eller läkemedel direkt till nervceller av intresse. Detta protokoll består av fyra huvuddelar: i) montering av bildimplantat; ii) Installation av bildimplantat. iii) Virusinjektion via bildimplantat. iv) funktionell avbildning hos möss som beter sig. Nedan beskriver och diskuterar vi kritiska steg i protokollet, felsökning, ändringar och begränsningar av metoden. Vi diskuterar också metodens betydelse och dess potentiella alternativa tillämpningar.
Det finns flera kritiska steg i det beskrivna protokollet som är ganska viktiga för framgångsrik kirurgi: (i) förberedelse av ett högkvalitativt bildimplantat; ii) Sterila kirurgiska tillstånd. iii) cortexens strävan; iv) Exakt placering av bildimplantatet. v) Virusinjektion. Som steg 1,6 anger skulle överskott av lödform kräva en större kraniotomi och därmed öka risken för inflammation. Det är också mycket viktigt att använda en lämplig mängd av det självhäftande optiska limet när täckglaset fästs på avbildningskanylen, vilket anges i steg 1.11, eftersom en otillräcklig mängd kan leda till läckage av cerebrospinalvätska i avbildningskanylen och göra den ogenomskinlig. Å andra sidan kan överskott av optiskt lim resultera i minskad transparens i glasfönstret. Eventuell kontaminering av bildimplantatet kan orsaka en aktiv spridning av bindväv under det optiska fönstret och/eller allvarlig inflammation, vilket leder till tidig avslutning av experimentet. Därför är bildimplantatmontering och förberedelse före operationen nästan lika viktigt som själva kirurgiska ingreppet.
Under operationen ablated den del av cortex under craniotomy av mild strävan, vilket resulterar i oundviklig blödning. Blod på operationsstället minskar avsevärt synligheten för hjärnvävnaden som måste avlägsnas. Detta komplicerar den exakta bedömningen av det önskade djupet av vävnad ablation. Noggrann spolning av operationsstället med PBS varje gång innan sug för att avlägsna nästa del av vävnaden ger bättre kontroll över djupet. Hjärnvävnaden bör alltid avlägsnas i små portioner steg för steg som bekräftar djupet av ablated vävnad innan du fortsätter med mer sug. Finare kontroll av sug kan också uppnås med en tunnare trubbig nål. Vi föreslår att du använder en 26 G nål, men mindre än 26 G diameter är mer benägna att täppa till. Dessutom krävs det vanligtvis mycket övning för att bestämma det exakta aspirationsdjupet som krävs för varje djur, eftersom färgen på cortex, corpus callosum och hippocampus kan variera från mus till mus (Figur 3).
Införing och fastsättning av bildimplantatet bör göras mycket exakt för att säkerställa att bildfönstrets dorsala yta placeras närmast möjligt till hippocampus dorsala yta. Storleken på den beredda kraniotomin bör nära matcha implantatet och tillåta dess införande utan betydande motstånd. Samtidigt bör det inte finnas något synligt mellanrum mellan skallen och implantatet för att säkerställa korrekt tätning och undvika exponering av hjärnvävnad. Skonsamt och stabilt tryck ska appliceras på toppen av implantatet under tätningen till skallen. Det är nästan oundvikligt att ha blod under bildfönstret under implantatinstallationen. Om det kirurgiska ingreppet görs ordentligt, bör fönstret rensas ut om 3-7 dagar, och hjärnans vaskulatur blir tydligt synlig. Det är också viktigt att se till att viruset injiceras ordentligt under fönstret. Vid misslyckat uttryck kan virus injiceras flera gånger.
Den stora komplikationen vi stött på i vissa fall är minskad synlighet av bildfönstret. Det finns flera möjliga orsaker till dålig bildkvalitet: i) pågående inflammation; ii) utväxt av bindväv på glaset; iii) stort gap mellan fönstret och hippocampus. Inflammation orsakas vanligtvis av kontaminering under operationen eller av inte korrekt steriliserat bildimplantat. Vi föreslår autoklavering av de kirurgiska instrumenten före och efter varje operation, desinficera operationsområdet precis före ingreppet och bära ren personlig skyddsutrustning under operationen. Bildimplantat ska rengöras efter montering, steriliseras och förvaras under sterila förhållanden. Utväxten av bindväv på glaset av bildimplantat kan bero på mekanisk förorening på glasets yta eller överdrivet trauma av hjärnvävnaden under cortexablation. Efter montering av implantatet är det viktigt att bekräfta att glasytan är ren och slät. Dessutom måste alla bitar av skadad hjärnvävnad försiktigt avlägsnas innan avbildningsimplantat sätts in i kraniotomin. I vissa fall resulterar gapet mellan glasfönstret och hippocampus i ackumulering av cerebrospinalvätska, vilket minskar kvaliteten på avbildning. Därför är det under implantatinstallationen viktigt att sätta in det hela vägen för att säkerställa god kontakt mellan hippocampus och glasfönster. Ibland är det svårt att identifiera den exakta orsaken till ogenomskinligt bildfönster. Vi föreslår att utföra post-mortem analys för att avslöja villkor under det optiska fönstret och på motsvarande sätt justera efterföljande operationer.
Metoden har flera grundläggande och tekniska begränsningar som bör beaktas före och under in vivo-avbildning. En av de största begränsningarna är cortexablation. En del av den visuella och sensoriska cortexen avlägsnas under operationen. Medan det är svårt att exakt utvärdera effekten av cortexablation, eftersom borttagen hjärnvävnad inte direkt projicerar på hippocampus, visade flera studier ingen märkbar försämring av hippocampal-beroende lärande eller andra relevanta hippocampus funktioner15,16. De optiska begränsningarna bör också beaktas, särskilt när höga NA-objektiva linser används. Till exempel använde vi i denna studie en 1,75 mm lång kanyl med en 1,9 mm innerdiameter. Geometrin i denna kanyl kommer inte att bevara hela NA av luftmål med NA mer än ~ 0,5 eller vattenmål med NA mer än ~ 0,6 eftersom det kommer att klippa lite ljus. En annan begränsning, vanlig för alla hjärnavbildningsimplantat, är att en del av hjärnan exponeras, vilket främjar värmeförlust17,18. Fysiologisk hjärntemperatur kan dock enkelt återställas under avbildning genom perfusion av en varm buffert.
Den beskrivna metoden kan enkelt modifieras eller justeras för andra applikationer. Till exempel kan preparatet anpassas för avbildning av striatum7. Eftersom striatum ligger något djupare än hippocampus, bör den längre bildskanylen användas för montering av bildimplantat. Vi föreslår att du använder 2,0 mm bild cannula. Craniotomys koordinater bör justeras på motsvarande sätt (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Dessutom tillåter virusinjektion via infusionskanyl att uppnå uttrycket av en transgen i ett tunt lager av nervceller när du använder AAV-serotyp med begränsad spridning19,20. Det är särskilt fördelaktigt för en-foton imaging på grund av minskad out-of-focus fluorescens från djupare lager och, som ett resultat, förbättrad encellig upplösning imaging. Dessutom kan injektionskanyl också användas vid funktionell avbildning för administrering av läkemedel eller andra kemikalier direkt på nervcellerna i FOV (figur 5B). Övergripande infusion kanyl lägger till användbara funktioner till bildimplantatet, förbättra bildframställning kvalitet på grund av det riktade virala uttrycket och möjliggör farmakologisk stimulering av nervceller i FOV. Den använda huvudplattan ger extraordinär stabilitet i bildimplantat som minimerar rörelseartefakter även i aktivt rörliga djur på ett löpband. Huvudplattan är liten och lätt, vilket orsakar minimalt obehag för djur och förblir stabil i flera månader efter installationen. Bildimplantatet är också kompatibelt med multifoton imaging15,16,21 och kan kombineras med mikroskop22,23. Ett liknande bildimplantat användes också för multiphoton imaging av de djupare hippocampus strukturerna, inklusive stratum radiatum, stratum lagounose och dentate gyrus16,24,25,26,27. Att rikta in sig på de djupare hippocampusstrukturerna med AAV via infusionskanyl kan dock kräva ytterligare optimering av AAV-serotypen och volym19.
Vi tror att det beskrivna protokollet kommer att underlätta studier som syftar till att undersöka neuronal aktivitet med hög spatiotemporal upplösning i hippocampus av beter sig möss med enkla och prisvärda one-photon imaging inställningar.

Hippocampus är en viktig hjärnregion som ansvarar för lärande och minne1 samt för rumslig navigering2. Hippocampal atrofi är associerad med neurologiska och psykiatriska störningar som involverar minnesförlust och kognitivnedgång 3,4,5. Hos möss är hippocampus en mycket väletablerad modell för att studera rumsligt, kontextuellt och associativt lärande och minnesbildning på celluläraoch nätverksnivåer 4,5. De mekanistiska studierna av lärande och minne kräver longitudinella förhör av neuronal struktur och funktion i att bete sig möss. Fluorescensavbildning i kombination med genetiskt kodadesonder 6 ger oöverträffade funktioner för att registrera membranspänningsdynamik7,8, kalciumtransienter9, och strukturellaförändringar 10 över stora delmängder av nervceller intravitally. Optisk åtkomst till hippocampus hos möss hindras dock av cortex, som kan nå över 1 mm i tjocklek. Här beskrev vi en procedur för montering av en skräddarsydd bildbehandlingsenhet och dess kroniska implantation i mushuvudet för långsiktig optisk åtkomst till CA1-underregionen i dorsala hippocampus i att bete möss. Infusionskanyl integrerad i bildimplantatet möjliggör administrering av virus eller läkemedel direkt på nervcellerna inom synfältet. Den beskrivna beredningen i kombination med bredfältsmikroskopi möjliggör återkommande avbildning av de stora delmängderna av nervceller i beter sig möss under långa tidsperioder. Vi använde detta preparat för att uttrycka kalcium och spänning genetiskt kodade indikatorer i hippocampal CA1 regionen via riktad injektion av rekombinant adeno-associerade virus (rAAV) för neuronal aktivitet inspelningar vid encellig upplösning. Vi utförde också longitudinella kalcium imaging av motsvarande neuronal delmängder med hög spatiotemporal upplösning i beter djur. Dessutom är denna förberedelse kompatibel med multifotonmikroskopi och mikroskopi, vilket ytterligare utökar verktygslådan för bildteknik för att studera neuronala nätverk på cellulära och subcellulära nivåer hos betande möss. Vi beskrev kritiska steg och felsökning av protokollet. Vi diskuterade också möjliga fallgropar och begränsningar av metoden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Deckgl&#228;ser</td>
			<td>72296-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denture&#160;base resin</td>
			<td>ShangHai New Centery Dentel Material</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Type I, self-solidifying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dummy Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62102</td>
			<td>OD 0.30mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62003</td>
			<td>26G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Fork</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Plate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Cannula</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Internal Cannula</td>
			<td>RWD Life Science Co.,LTD</td>
			<td>62203</td>
			<td>&#160;0.30*0.14 (OD*ID, mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Sil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBond C&#38;B</td>
			<td>SUN MEDICAL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SuperBond C&#38;B kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill Kit</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-cured Adhesive</td>
			<td>NORLAND PRODUCTS</td>
			<td>NOA 60</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

craniotomy procedure for visualizing neuronal activities in hippocampus of behaving mice

Att avbilda neuronala aktiviteter vid encellig upplösning hos vakna beteendedjur är ett mycket kraftfullt tillvägagångssätt för undersökning av neurala kretsfunktioner i systemneurovetenskap. Hög absorbans och spridning av ljus i däggdjursvävnad begränsar dock intravital avbildning mestadels till ytliga hjärnregioner, vilket lämnar djuphjärnområden, såsom hippocampus, utom räckhåll för optisk mikroskopi. I den här videon visar vi förberedelse och implantation av det skräddarsydda bildfönstret för att möjliggöra kronisk in vivo-avbildning av regionen dorsala hippocampal CA1 i huvud-fixerade beteende möss. Det skräddarsydda fönstret kompletteras med en infusionskanyl som möjliggör riktad leverans av virusvektorer och läkemedel till bildområdet. Genom att kombinera detta preparat med bredfältsavbildning utförde vi en långsiktig registrering av neuronal aktivitet med hjälp av en fluorescerande kalciumindikator från stora delmängder av nervceller i beter sig möss under flera veckor. Vi visade också tillämpligheten av denna förberedelse för spänning imaging med en-spike upplösning. Högpresterande genetiskt kodade indikatorer på neuronal aktivitet och vetenskapliga CMOS kameror tillät återkommande visualisering av subcellulära morfologiska detaljer av enskilda nervceller med hög temporal upplösning. Vi diskuterar också fördelarna och potentiella begränsningarna med den beskrivna metoden och dess kompatibilitet med andra bildtekniker.

In vivo-avbildning av neuronal aktivitet med hjälp av en genetiskt kodad kalciumindikator. I genomsnitt startar in vivo imaging 3-4 veckor efter implantation om en tillräcklig nivå av transgene uttryck uppnås. Vid denna tid är cerebral ödem och blödning vanligtvis helt löst, och hjärnan vaskulatur kan lätt observeras genom det optiska fönstret. Här använde vi den beskrivna förberedelsen för att utföra upprepade inspelningar av neuronal aktivitet i regionen dorsala hippocampal CA1 i beter sig möss under fluorescens wide-field mikroskop. För att registrera neuronal aktivitet använde vi en ljus genetiskt kodad kalciumindikator, kallad NCaMP713, som uppvisar liknande kalciumkänslighet och temporal upplösning som GCaMP6s14. För att uttrycka NCaMP7-indikatorn i hippocampus injicerade vi rAAV/ DJ-CAG-NCaMP7-viruset med hjälp av en infusionskanyl och initierade longitudavbildning vid 14 dagar efter injektionen. För att spela in neuronal aktivitet använde vi en 10x NA 0,3 luftmålslins och Hamamatsu OrcaFusion sCMOS-kamera som tillät avbildning vid ~ 1,5x1,5 mm FOV vid upp till 100 Hz frekvens. Grön fluorescens var upphetsad av en kommersiellt tillgänglig 470 nm LED med hjälp av en standard GFP-filteruppsättning. Det genomsnittliga bilddjupet som uppnås i grön kanal är ca 50-120 μm, vilket gör det möjligt att registrera neuronal aktivitet främst i stratum oriens och stratum pyramidale. Bilddjup i nära infraröda kanaler kan vara upp till 200 μm når de djupare lagren av hippocampus8. Den genomsnittliga inspelningstiden per FOV var 6-12 min, även om mycket längre bildsessioner är möjliga eftersom NCaMP7 kännetecknas av extremt hög fotostabilitet och ingen påvisbar fototoxicitet observerades (figur 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig06.jpg"> Figur 6: Registrering av neuronal aktivitet i hippocampalneuroner med hjälp av en grön fluorescens genetiskt kodad kalciumindikator. (A) En utvald FOV avbildad under ett bredfälts fluorescensmikroskop i grön kanal. b)De 15 rois som motsvarar de enskilda nervceller som visas i A och väljs med hjälp av standardavvikelseprojektionen för hela registreringen. (C) Representativa fluorescensspår av de 15 utvalda nervcellerna i B. (D) En representativ zoom-in-vy av 2 kalciumspår som visas i motsvarande färgrutor som visas i C. Skalstreck, 100 μm. Klicka här för att se en större version av <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig06large.jpg" target="_blank">denna siffra.</a>
För att erhålla fluorescensspår segmenterades de regioner av intresse (ROIs) som motsvarar neuronala somas manuellt och analyserades av ImageJ programvara. Före bildanalys rörelsekorrigering krävdes inte vanliga efterregistreringsförfaranden hos vakna djur eftersom de förvärvade datamängderna inte uppvisade rörelseartefakter på grund av den höga stabiliteten hos bildimplantatet. En representativ optisk inspelning av neuronala aktiviteter från hippocampus i en vaken beteendemus presenteras i figur 6. 15 ROIs som motsvarar neuronala somas valdes manuellt från samma FOV som visas i figur 6B, och fluorescensspåren med en studie inom varje ROI visas i figur 6C. Figur 6D visar två representativa delar av fluorescensspår från två olika ROI. Vi utförde 4 på varandra följande bildsessioner för samma FOV med 3-dagars intervaller. Det var möjligt att identifiera och avbilda samma nervceller i vissa FOV i minst två veckor (de längre bildbehandlingssessionerna utfördes inte för denna studie, men samma preparat har använts för upp till 6 månaders avbildningsstudie på mösstidigare 7; Figur 7). I denna studie använde vi AAV / DJ-CAG vektor, som drev ett starkt uttryck för genen av intresse även 21 dagar efter virusleverans (Kompletterande figur 1). Det kontinuerliga uttrycket komplicerade långsiktig identifiering av samma nervceller på grund av ökad fluorescens bakgrund och utseende av nya nervceller uttrycker kalcium indikatorn. Därför bör val av AAV serotyp och promotor för att driva mål gen uttryck vara en av de viktiga övervägandena under experimentell design i synnerhet om longitudinell imaging av samma delmängd av nervceller krävs. Bildframställningskvaliteten tillät att lösa proximala dendriter samt visualisera blodkärl.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig07v2.jpg"> Bild 7:Bildsekvensen av fyra olika FOV:er från hippocampalområdet spårades under 12 dagar. Djuret implanterades med fönstret på dag 0 och injicerades med rAAV / DJ-CAG-NCaMP7-viruset på dag 7. Pilspetsar indikerar att neuronen spåras inom FOV. Skalstänger: 80 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
In vivo imaging av neuronal aktivitet med hjälp av en genetiskt kodad spänningssensor. I denna studie använde vi också en ny genetiskt kodad spänningssensor, kallad SomArchon7, vilket möjliggör spänningsavbildning med encellig enpikupplösning hos beteendedjur7,8. För att uttrycka SomArchon injicerade vi rAAV / DJ-CAG-SomArchon virus med hjälp av en infusion kanyl och utförde spänningsavbildning i en huvud-fast beter mus flera dagar efter injektion. För att spela in neuronal aktivitet använde vi en 40x NA 0,8 objektiv och Hamamatsu OrcaFusion sCMOS-kamera som gjorde det möjligt för oss att avbilda 150x40 μm FOV med upp till 830 Hz förvärvshastighet. GFP-proteinet, som en del av SomArchon konstruerar för att underlätta visualisering av uttryck i spektrumet, kan enkelt avbildas i den gröna kanalen (LED-excitation vid 470/20 nm, utsläpp 525/50 nm) för att lokalisera celler av intresse för spänningsavbildning. Optisk spänning inspelningar utfördes i den nära infraröda kanalen (laser excitation 637 nm vid 3,4 W/mm2, emission 665 nm långpass) med 4 x 4 binning vid 830 Hz förvärvshastighet. Vi registrerade spontan aktivitet av en hippocampal neuron i en vaken mus med genomsnittlig SNR på 7 per åtgärd potential (Figur 8). 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig08.jpg"> Figur 8:Registrering av neuronal aktivitet i hippocampal nervceller med hjälp av en nära infraröd fluorescens genetiskt kodad spänningsindikator SomArchon. (A) Ett valt FOV-avbildat under fluorescensmikroskop med brett fält i den nära infraröda kanalen. (B) Fluorescensspårning för en studie av neuronen i A. (C) En representativ inzoomning av spänningsspåret i motsvarande ruta som visas i B. Skalstreck: 25 μm. Klicka här för att se en större version av <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig08large.jpg" target="_blank">denna siffra.</a>
histologi Efter funktionella imaging studie görs, post-mortem analys används för att bekräfta korrekt placering av implantatet, området för virusuttryck och lokalisering av ett protein av intresse för avbildade nervceller. För histologisk verifiering av virusuttryck och placering av implantatet undersöktes koronarsektioner av den fasta PFA hjärnan under ett fluorescens brett fältmikroskop (Figur 9A, C). Ett konfokalt mikroskop användes för att förvärva högupplösta bilder av enskilda nervceller som uttrycker kalciumindikatorn, liksom spänningsindikatorn(figur 9B,D). DAPI färgning användes för att visualisera den övergripande morfologin i hjärnskivan. Dessutom kan hjärnskivorna bedömas med hjälp av immunohistokemi för att verifiera astroglios eller gliosis orsakad av fönsterimplantation och virusuttryck. Våra tidigare studier visade att förfarandet inte inducerar märkbar gliosis7.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig09.jpg"> Figur 9: Histologisk verifiering av detoptiska fönsterpositionen och virusuttrycket. (A) En representativ fluorescerande bild av den koronarsektions hjärnskiva som visar placeringen av det optiska fönstret från en NCaMP-uttryckande mus. Skalstång: 1 mm. (B) En representativ konfokal bild av nervceller som uttrycker NCaMP7 indikatorerna. Skalstång: 25 μm. (C) En representativ fluorescensbild av koronalsektionens hjärnskiva som visar placeringen av det optiska fönstret från en SomArchon-uttryckande mus. Skalbar: 1 mm. (D) En representativ konfokal bild av nervceller som uttrycker SomArchon indikatorerna. Skalbar: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig09large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande figur 1: Kvantantitiv analys av relativ fluorescensintensitet tillsammans med uttryckstid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice at JoVE.com

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Denna artikel visar beredningen av ett skräddarsytt bildframställning fönster kompletteras med infusion kanyl och dess implantation på CA1 regionen hippocampus hos möss.

Craniotomy förfarande för visualisering neuronal verksamhet i Hippocampus av beter sig möss

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Jag heter Wang Yangdong och är från Dr.Kiryl Piatkevich molekylär bioteknik labb i Westlake University. Idag ska jag visa dig proceduren för avbildning av neuronala aktiviteter av hippocampus hos möss, in vivo. Slå på svetsmaskinen och värm upp den till önskad temperatur.Justera avbildningskanylens och injektionskanylens läge med hjälp av hjälphänder enligt figuren. Använd sprutan med nålen, applicera en liten mängd lämplig typ av flöde på anslutningsfläckarna mellan avbildning och injektion av kanyl i fem sekunder och ta sedan bort droppen. Montera lödformen och applicera den på anslutningsplatsen som behandlats med flödet.Undvik överflödig lödform eftersom det kommer att kräva onödig större hjärnskål att göra under operationen. Vänta tills lödformen har svalnat. Vanligtvis tar det flera sekunder.Kontrollera att injektionsbaleln inte blockeras genom att föra in provdockans kanyl från båda riktningarna. Applicera UV-härdande optiskt lim på undersidan av avbildningskanylen med en tandpetare eller 26-gauge sprutnål. Använd en fin pincett för att försiktigt placera ett täckglas av motsvarande storlek som avbildningskanylen.Härda limmet i minst en timme genom UV-belysning från en vanlig handhållen UV-lampa. Bedöva musen med isofluran enligt IACUC-godkänt förfarande. Placera musen i en stereotaxisk ram över en värmedyna för operation.Fäst huvudet med öronstänger. Tryck huvudet något i alla riktningar för att se till att huvudet är ordentligt fastsatt. Applicera ögonsalva för att förhindra att djurets ögon torkar ut under operationen.Använd en trimmer eller depilatorisk kräm för att ta bort pälsen från nacken upp till ögonen. Sterilisera operationsstället med betadin följt av 70% etanol tre gånger innan du gör ett snitt. Ta bort huden över toppen av skallen, börja med det horisontella snittet runt huvudets botten, följt av två skär i rostral riktning och nå nästan ögonlocken.Sedan två sneda snitt som konvergerar vid mittlinjen. Med två sterila bomullspinne, dra tillbaka anslutningsvävnaden, liksom muskulaturen i nacken till skallens kanter. Applicera en droppe lidokainlösning på ytan av periosteum i två minuter för att undvika överdriven smärta.Skrapa försiktigt hela det exponerade området i skallen med en skalpell för att skapa en torr och grov yta. Placera nålens spets på Lambda för att se om AP-koordinaten är noll för att bekräfta att huvudpositionen är vertikal, samt om ML-koordinaten är noll, för att bekräfta att huvudet är placerat horisontellt. Om inte, justera korrespondentknopparna på stereotaxiska stationen tills AP- och ML-koordinaterna båda är inom 0,1 millimeter.Flytta nålens spets för att hitta motsvarande punkter för kraniotomi och markera deras positioner på skallen med hjälp av en fin markör. Rita en cirkel baserad på fyra markerade punkter, liksom konturen av injektionskanaelområdet på kanylsidan av cirkeln. Använd en pneumatisk borr med en hastighet av 10 000 skott per minut för att försiktigt borra längs konturen som är markerad på skallen.Borra skallen tills ett mycket tunt lager ben är kvar, vilket vanligtvis börjar vicka under mild beröring i mitten. Applicera en droppe steril PBS i mitten av kraniotomin. Lyft benluckan från skallen med mycket tunna spetsiga tångar eller två 26-gauge nålar som närmar sig den från motsatta sidor.Applicera PBS följt av mjuka ambitioner, genom en 26 gauge trubbig nål flera gånger för att rengöra ytan på duran. Applicera skonsam sug för att brinna cortex samt Corpus Callosum ovanför hippocampus. Cortex är ofta gulare än Corpus Callosum.Och Corpus Callosum är vanligtvis bredare än hippocampus. Dessutom är Corpus Callosum verkligen lätt att skilja genom neuronala fibrer som går i vertikala och horisontella riktningar när de observeras uppifrån. Blödning vid denna tidpunkt kommer att påverka synligheten av hjärnvävnaden i kraniotomin.Applicera PBS, följt av skonsam sugning, medan du aspirerar cortex för att bli av med blodet, Corpus Callosum kan kännas igen av riktningen på de vita fibrerna som schematiskt visas i diagrammet. Ta bort Corpus Callosum-fibrer lager för lager genom att applicera skonsam sugning i en cirkulär rörelse. PBS appliceras ständigt för att bli av med blod som ackumuleras ovanför exponerad hjärnvävnad.Sätt försiktigt in implantatet i kraniotomin. Tryck hårt ovanpå implantatet med den L-formade nålen för att placera implantatets optiska fönster så nära hippocampus exponerade yta som möjligt. Applicera upprepade pbs på ärret runt implantatet, följt av sug för att ta bort blod så mycket som möjligt under implantatinsättning.Applicera ett tunt lager snabb tätning mellan implantatet och skallen för att förhindra att tandcement tränger in under skallen. När snabb tätningen är härdad, applicera superbindning jämnt på skallens yta, ytan på snabb tätningen och implantatytan. När superbindningen är härdad, applicera protesbasharts över superbindning, liksom huden runt snittet som gjordes i början av operationen.När protesens basharts har härdats, placera huvudplattan på hartset runt implantatet och få det att koncentreras med avbildningskanylen. Applicera mer protesbasharts runt och ovanför huvudplattan för att fixera dess position. Låt det bota i flera minuter.Undvik att bygga upp ett tjockt lager cement runt kanylen för att säkerställa bättre åtkomst till bildfönstret är objektiv linsen. Späd protesbashartset för att minska dess viskositet, vilket gör det möjligt att fylla hålrummen som är svåra att nå med en applikator. Placera försiktigt en isolerad gummitejp ovanför fönstret för att skydda fönstret från eventuell förorening från djurbandning.Tillsätt Fast Green färgämneslagerlösning till viruslösning späd den till önskad titer i förhållandet mellan ett och nio, i ett PCR-rör. Dra ut 600 nano liter av viruslösningen, ta bort provdockans kanyl och sätt in den inre kanylen anslut den till injektionssprutan i styrbaleln. Infusera viruset med en hastighet av 15 nano liter per minut, i totalt 10 minuter.Håll den interna kanylen ansluten i 10 minuter så att viruset kan spridas under fönstret. Ta försiktigt bort den inre kanylen från styrbaleln och rekapitla den med provdockans kanyl. Inducera musen med 4%isofluran i några minuter.Fäst huvudplattan på huvudtäcken och fäst sedan huvudtäcken på löpbandet. Använd en objektivlins med låg förstoring för att hitta det bästa att filtrera vyn för funktionell avbildning. Byt sedan till en högre objektiv lins för att spela in neuronala aktiviteter vid encellsupplösning.För kalciumavbildning var grön fluorescerande upphetsad av en kommersiellt tillgänglig 470 nanometers LED med en standard GFP-filterkänsla. För att få fluorescerande spår segmenterades intresseregionerna, motsvarande neuronal cellmassa, manuellt och analyserades av ImageJ-programvaran. För spänningsavbildning med hjälp av en 40 X-lins utfördes optisk spänningsinspelningar i den nära infraröda kanalen vid 830 Hertz förvärvshastigheter.Spontan neural aktivitet inspelning varade kontinuerligt i upp till 25,000 bilder. Här beskriver vi en metod för långsiktig avbildning av hippocampus som en A1-region i att bete sig möss. Metoden är baserad på den kroniska implantationen.Nu det skräddarsydda bildfönstret, som också möjliggör riktad administrering av virus eller läkemedel direkt till nervceller av intresse. Vi tror att det beskrivna protokollet kommer att underlätta studier som syftar till att undersöka neuronal aktivitet med hög rumslig tidsupplösning i hippocampus av beter sig möss med enkla och prisvärda 1-foton bilduppföranden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

En helt automatiserad och Mycket mångsidig system för att testa flera kognitiva funktioner och spela in neurala Aktiviteter i Gnagare

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Ett förfarande för Implantation Organized arrayer av Microwires för Single-enhet Inspelningar i Awake, uppför djur

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion Plasticitet hos astrocytiska Receptorer genom manipulering av neuron priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Samtidiga Långfristiga Inspelningar på två Neuronal Processing Stadier i Agera Honeybees

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

Ett stort Lateral Kraniotomi Förfarande för Mesoskalig Wide-field optisk avbildning av hjärnans aktivitet

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice

Typografisk inspelning Förfarande för mätning Sova i möss

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic ångan av hippocampus Theta svängningar i beter sig möss

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

Inspelning rumsligt begränsade svängningar i Hippocampus av beter sig möss

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Långsiktiga sensorisk konflikt i fritt bete möss

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...