Name: whole-brain 3d activation and functional connectivity mapping in mice using transcranial functional ultrasound imaging
Uploaded: 2021-02-24T15:00:00
Duration: 11 min 57 s
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Advanced Grant N° 339244-FUSIMAGINE des Europäischen Forschungsrats (ERC), die Nationale Forschungsagentur zur Finanzierung von "Pinch" (ANR-18-CE37-005), den Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasound, den elfus technischen Kern des IPNP, Inserm U1266, das europäische Forschungsprogramm FUSIMICE des Human Brain Project und embo Short-Term Fellowship 8439 an Andrea Kliewer.

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	<li>Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+small+animal+magnetic+resonance+imaging+as+a+translational+tool.">Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool.</a> Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).</li><li>Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ultrasound+neuroimaging:+a+review+of+the+preclinical+and+clinical+state+of+the+art.">Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).</li><li>Rabut, C., et al. <a target="_blank" 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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+functional+ultrasound+imaging+reveals+brain+modules+for+visuomotor+integration.">Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration.</a> Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).</li><li>Mac&#233;, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ultrasound+imaging+of+the+brain.">Functional ultrasound imaging of the brain.</a> Nature Methods. 8 (8), 662-664 (2011).</li><li>Tiran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+functional+ultrasound+imaging+in+freely+moving+awake+mice+and+anesthetized+young+rats+without+contrast+agent.">Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).</li><li>Claron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+functional+ultrasound+imaging+of+the+spinal+cord+reveals+in+depth+spatiotemporal+responses+of+spinal+nociceptive+circuits+in+both+normal+and+inflammatory+state.">Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state.</a> Pain. , (2020).</li><li>Aydin, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+functions+linking+neural+calcium+to+single+voxel+functional+ultrasound+signal.">Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal.</a> Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).</li><li>Bimbard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+mapping+along+the+auditory+hierarchy+using+high-resolution+functional+ultrasound+in+the+awake+ferret.">Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret.</a> eLife. 7, 35028 (2018).</li><li>Boido, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoscopic+and+microscopic+imaging+of+sensory+responses+in+the+same+animal.">Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal.</a> Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).</li><li>Kislin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat-floored+air-lifted+platform:+A+new+method+for+combining+behavior+with+microscopy+or+electrophysiology+on+awake+freely+moving+rodents.">Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).</li><li>Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+behavioral+correlates+in+the+head-fixed+method:+stress+measurements,+habituation+dynamics,+locomotion,+and+motor-skill+learning+in+mice.">Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).</li></ol>

Jeremy Ferrier und Bruno-Félix Osmanski sind Mitarbeiter von Iconeus. Thomas Deffieux, Zsolt Lenkei, Bruno-Félix Osmanski und Mickael Tanter sind Mitbegründer und Gesellschafter von Iconeus.

Bildgebende Verfahren des gesamten Gehirns sind entscheidende Werkzeuge, um die Physiologie und Pathologie des Gehirns besser zu verstehen. Die hier beschriebene Methode erlaubt die präzise Quantifizierung hämodynamischer Signale im lebenden Gehirn direkt an der Bank. Die unübertroffene Sensitivität und räumlich-zeitliche Auflösung des funktionellen Ultraschalls eignet sich besonders gut für die Mausphysiologie. Funktionelle Reaktionen und Ruhezustandsnetzwerke können innerhalb kurzer Erfassungszeiten longitudinal und ohne durchschnittliche Studien oder Probanden abgebildet werden, um ein zuverlässiges Maß zu erhalten. Die relevante Kombination aus hochempfindlichen linearen Ultraschallsonden und schnellen motorisierten Setups ermöglicht es, transkranielle volumetrische fUS-Bildgebung bei Mäusen innerhalb angemessener Erfassungszeiten durchzuführen. Dieses Protokoll kann entweder an betäubten oder wachen Mäusen mit einem Wohnmobilkäfig durchgeführt werden.
Die Whisker-Stimulation, der sensorische Reiz, der in diesem Manuskript als veranschaulichendes Beispiel verwendet wird, ist ein Standard-Paradigma der funktionellen Aktivierung bei Nagetieren und ein zuverlässiges Auslesen, um die sensorische Verarbeitung, die neurovaskuläre Kopplung und ihre Veränderungen zu untersuchen5,6,10,11. Während das grobe manuelle Bürsten der Schnurrhaare wegen seiner Benutzerfreundlichkeit bevorzugt werden kann, fehlt es dieser Methode an räumlicher und zeitlicher Präzision. Die Verwendung eines automatischen Stimulators, wie er hier mit dem fUS-Bildgebungsscanner ausgelöst wird, ermöglicht eine bessere Kontrolle mehrerer Parameter, einschließlich des Zeitpunkts des Auftretens, der Amplitudenverschiebung, der Frequenz sowie des Winkels der Q-Spitze / des Kamms, was zu einer besseren Reproduzierbarkeit zwischen den Tieren führt. Darüber hinaus ermöglicht ein präziseres Timing der Stimulation die Modellierung der hämodynamischen Reaktionsfunktion (HRF) durch Bestimmung der Zeit bis zum Einsetzen und der Zeit bis zum Peak der Parameter12,13. Um eine bessere Präzision bei der Anzahl der während der Stimulation abgelenkten Schnurrhaare (und damit des Bereichs der aktivierten Region) zu gewährleisten, können ausgefeiltere Stimulatoren an dieses Protokoll angepasst werden. Viele andere Reize wie Licht8,Ton14 oder Geruchsdarstellung15 können mit dem gleichen Protokoll umgesetzt werden.
Die Kompatibilität von funktionellem Ultraschall mit wachen und sich verhaltenden Tieren ist ein wichtiger Vorteil im Vergleich zu anderen Neuroimaging-Techniken, der eine funktionelle Aktivierungskartierung ohne anästhesieverzerrung ermöglicht. Die Verwendung eines luftgestützten mobilen Heimkäfigs ist eine gute Alternative zu anderen bestehenden kopffesten Geräten wie linearen oder sphärischen Laufbändern. Während die Bewegung des Homecage fest am Kopf fixiert ist, gibt sie der Maus die Illusion, durch die Umgebung zu navigieren, so dass eine breite Palette von Verhaltenstests an die fUS-Bildgebung16gekoppelt werden kann. Das Gewöhnungsverfahren zur Kopffixierung stellt jedoch einen wichtigen Schritt zur Verringerung von Stress dar, insbesondere für Experimente, bei denen es als Störfaktor angesehen werden kann. Das hier beschriebene Verfahren (6 Tage Handhabung und Gewöhnung an die Kopffixierung) liefert robuste Ergebnisse für die sensorische Stimulation und die funktionelle Konnektivität im Ruhezustand. Es könnte jedoch notwendig sein, die Gewöhnungszeit für verfeinerte Verhaltenstests zu verlängern17.

In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich das Neuroimaging zu einem wichtigen Werkzeug für die Untersuchung der Gehirnfunktion und -organisation entwickelt, das es Forschern ermöglicht, wichtige Entdeckungen auf dem Gebiet der Neurowissenschaften zu machen. Heute ist die funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT) zum Goldstandard der klinischen Neuroimaging-Technik geworden, um die Aktivierung des Gehirns zu beurteilen und die funktionelle Konnektivität in Ruhe abzubilden. Während die menschliche fMRT eine hohe Zuverlässigkeit und Sensibilität aufweist, bleibt die fMRT der Maus aus zahlreichen Gründen technisch anspruchsvoll1. Erstens hat fMRT eine schlechte räumliche und zeitliche Auflösung. Die geringe Größe des Mausgehirns erfordert die Verwendung starker Magnetfelder mit teuren Scannern, um eine vernünftige räumliche Auflösung zu erreichen. Zweitens ist es bei anästhesierten Mäusen sehr schwierig, stabile physiologische Parameter innerhalb des engen Bereichs aufrechtzuerhalten, die eine effiziente neurovaskuläre Kopplung ermöglichen. Schließlich hat das BOLD-Signal (Blood Oxygen Level Dependent), auf das sich fMRT-Studien stützen, eine relativ schlechte Empfindlichkeit, was zu einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis führt, wenn es auf Mäuse angewendet wird, und erfordert oft eine wiederholte Reizpräsentation über lange Erfassungen, um kleine Variationen zu erkennen. Da die Maus das am weitesten verbreitete Tiermodell in der biomedizinischen präklinischen Forschung ist, sind diese Einschränkungen teilweise für die Translationslücke in der Neuropsychiatrie verantwortlich und behindern neue vielversprechende therapeutische Ziele auf der Bank, die in wirksame Behandlungen am Krankenbett umgesetzt werden können.
Funktioneller Ultraschall (fUS) ist eine kürzlich entwickelte Neuroimaging-Technik, die auf ultraschnellem Doppler2basiert. Durch die direkte Entnahme des zerebralen Blutvolumens ermöglicht diese Technik die Untersuchung der Gehirnaktivität in Echtzeit durch die neurovaskuläre Kopplung. Im Vergleich zu anderen Neuroimaging-Techniken liefert fUS eine räumliche Auflösung von 100 μm und eine zeitliche Auflösung im zweistelligen Millisekundenbereich. Diese Technik ermöglicht die Bildgebung des gesamten Gehirns von vollständigen koronalen Abschnitten des Mausgehirns, vollständig nicht-invasiv. Darüber hinaus ist es voll kompatibel mit bewussten und sich verhaltenden Tieren3,4,5. Eine der wichtigsten aktuellen Einschränkungen von fUS ist seine 2D-Funktion, die es ermöglicht, eine einzelne koronale Ebene gleichzeitig aufzunehmen. Während volumetrische 3D-fUS unter Verwendung von 2D-Matrix-Array-Aufnehmern bereits erfolgreich bei Ratten6 nachgewiesen und bei Mäusen7bestätigt wurden, erfordert ihr derzeitiger Mangel an Empfindlichkeit eine vollständige Kraniotomie sowie die durchschnittliche Anzahl von Studien, um eine leichte Änderung der Aktivität zu erkennen. Alternativ können lineare Wandler über mehrere Positionen gestuft werden und funktionelle Bildgebungsebene für Ebene durchführen, um das gesamte Gehirn abzudecken. Diese Technik erfordert jedoch zahlreiche experimentelle Paradigmenwiederholungen und damit lange Erfassungszeiten (3-4 Stunden für das Mausgehirn)8,9.
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir eine robuste experimentelle Plattform mit einem kommerziell erhältlichen funktionellen Ultraschallgerät und einem schnellen linearen Wandler mit Methoden zur Erfassung von 3D-fUS-Daten in anästhesierten und wachen Mäusen, die eine volumetrische und transkranielle funktionelle Kartierung des Mausgehirns ermöglichen, nicht-invasiv, ohne Kontrastmittel und innerhalb kurzer Erfassungszeiten. Wir veranschaulichen diese Eigenschaft, indem wir die Aktivierung des somatosensorischen Kortex nach whisker Stimulation sowie die funktionelle Konnektivität im Ruhezustand kartieren. Neben der Tieraufbereitung und Datenerfassung beschreiben wir auch das Verfahren zur Visualisierung, Atlasregistrierung und Analyse von Echtzeit-fUS-Signalen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Plastipak 1 mL syringes</td>
			<td>Dutscher, France</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 26 Gauge needles</td>
			<td>Dutscher, France</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe)</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>TCAT-2DF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Arduino Uno-Rev3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Orion Pharma, France</td>
			<td>Antisedan&#174;</td>
			<td>5 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Ciment</td>
			<td>Sun M&#233;dical, Shiga, japan</td>
			<td>Superbond C&#38;B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Klorane</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>TVM, UK</td>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair trimmer</td>
			<td>Wella Profesionnals</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head plates</td>
			<td>Neurotar, Finland</td>
			<td>Model 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iconeus One standard package for fUS</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>Iconeus One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IcoScan acquisition software (v1.0)</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>IcoScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IcoStudio analysis software (v1.0)</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>IcoStudio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthesia station</td>
			<td>Minerve, Esternay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Virbac, France</td>
			<td>Ketamine1000</td>
			<td>100 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>Lurocaine&#174;</td>
			<td>20 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma, France</td>
			<td>Domitor&#174;</td>
			<td>1 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Boehringer lingelheim</td>
			<td>Metacam&#174;</td>
			<td>0.5 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile HomeCage Large with tracking capability</td>
			<td>Neurotar, Finland</td>
			<td>MHC-L-T-V4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring of ECG and breathing rate</td>
			<td>AD Systems, (USA) and LabChart software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servomotor</td>
			<td>Feetech</td>
			<td>FT90B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf (Tujunga, USA)</td>
			<td>900-WA</td>
			<td>Using Mouse Adaptor&#160; (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical glue</td>
			<td>3M, USA</td>
			<td>Vetbond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>KD Scientific, USA</td>
			<td>Legato&#174; 130, Cat# 788130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>DREXCO medical, France</td>
			<td>Medi&#39;Gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Bayer, France</td>
			<td>Rompun&#174;</td>
			<td>20 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-brain 3d activation and functional connectivity mapping in mice using transcranial functional ultrasound imaging

Die funktionelle Ultraschallbildgebung (fUS) ist eine neuartige Bildgebungsmodalität des Gehirns, die auf der hochempfindlichen Messung des zerebralen Blutvolumens beruht, die durch ultraschnelle Doppler-Angiographie erreicht wird. Da die Hirnperfusion stark mit der lokalen neuronalen Aktivität verbunden ist, ermöglicht diese Technik die 3D-Kartierung der aufgabeninduzierten regionalen Aktivierung sowie der funktionellen Konnektivität im Ruhezustand, nicht-invasiv, mit unübertroffener räumlich-zeitlicher Auflösung und operativer Einfachheit. Im Vergleich zur fMRT (funktionelle Magnetresonanztomographie) besteht ein Hauptvorteil der fUS-Bildgebung darin, eine vollständige Kompatibilität mit Wach- und Verhaltenstierversuchen zu ermöglichen. Darüber hinaus bleibt die fMRT-Gehirnkartierung bei Mäusen, dem am häufigsten verwendeten präklinischen Modell in den Neurowissenschaften, aufgrund der geringen Größe des Gehirns und der Schwierigkeit, stabile physiologische Bedingungen aufrechtzuerhalten, technisch schwierig. Hier präsentieren wir ein einfaches, zuverlässiges und robustes Protokoll für die Ganzhirn-fUS-Bildgebung bei anästhesierten und wachen Mäusen unter Verwendung eines handelsüblichen kommerziellen fUS-Systems mit einem motorisierten linearen Wandler, das eine signifikante kortikale Aktivierung nach sensorischer Stimulation sowie ein reproduzierbares 3D-Funktionskonnektivitätsmuster zur Netzwerkidentifikation liefert.

Dieses Protokoll beschreibt die 3D-Quantifizierung zerebraler hämodynamischer Variationen transkraniell im Gehirn der Maus, in Ruhe oder als Reaktion auf sensorische Stimulation. Die Whisker-Stimulation, ein Standardparadigma zur Abbildung der funktionellen Aktivierung des Gehirns bei Nagetieren, wurde als Beispiel für eine sensorische Stimulationsreaktion ausgewählt. Abbildung 4 zeigt eine repräsentative Aktivierungskarte als Reaktion auf die mechanische Whisker-Stimulation in einer anästhesierten Maus, die mit transkranieller fUS-Bildgebung erhalten wurde. Die Gesamtversuchszeit betrug 760 s, mit einer Ausgangslinie von 60 s (vor und nach der Stimulation), einer Stimulation von 80 s und einer Erholungszeit von 60 s, die 5x wiederholt wurde. Die signifikante Aktivierung wurde mit der Auflösung eines allgemeinen linearen Modells (GLM) unter Verwendung einer standardmäßigen hämodynamischen Reaktionsfunktion (HRF) der Maus bestimmt. Die aktivierten Bereiche (Z punktet mit p-Wert >0,0000006 nach strenger Bonferroni-Korrektur für mehrfachen Vergleich) werden als farbcodierte Werte angezeigt, die auf der Allen Common Coordinate Framework-Vorlage überlagert sind. Der voxelweise Zeitverlauf des kontralateralen primären somatosensorischen Kortex, Der Tonnenfeldregion (S1BF) zeigte einen Anstieg des CBV um 15-20% im Vergleich zum Ausgangswert.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig4v2.jpg"> Abbildung 4: Transkranielle Aktivierung Maps und rCBV-Zeitverlauf nach Whiskers-Stimulation in Ketamin/Xylazin anästhesierter Maus. Ein. Aktivierungskarte mit signifikant aktivierten Voxeln nach mechanischer Stimulation der rechten Schnurrhaare (80 s ON, 60 s OFF, 5x) unter Ketamin/Xylazin-Narkose. Die Karten wurden durch die Berechnung von Z-Scores auf der Grundlage der allgemeinen linearen Modellanalyse (GLM) mit Bonferroni-Korrektur für den Mehrfachvergleich erhalten. Z-Scores (farbcodiert) werden auf der Allen Brain 3D-Vorlage (nach Registrierung beim Gehirnpositionierungssystem) überlagert und in drei Ansichten angezeigt: koronal (links), sagittal (Mitte) und axial (rechts). Anatomische Regionen aus dem gemeinsamen Koordinatengerüst des Gehirns der Allen-Maus werden als Referenz angezeigt. Aktivierte Voxel befinden sich gut im linken S1BF-Kortex. Maßstabsleiste: 1 mm. Jedes Probenvolumen wurde über 2,8 mm (entsprechend 7 Scheiben in Elevationsrichtung) in 3,85 s gescannt, so dass bei jeder funktionellen Reaktion 20 volumische Proben aufgezeichnet werden konnten. B. 3D-Rendering des anstiegs des durch die Whisker-Stimulation hervorgerufenen relativen zerebralen Blutvolumens (rCBV) im Vergleich zum Ausgangswert. Die anatomische Abgrenzung des S1BF ist blau dargestellt. Hrsg. Zeitverlauf der CBV-Variationen im linken S1BF (blau) und des entsprechenden angewendeten Stimulus (rot). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Das gleiche Paradigma wurde in einer kopffixierten Maus im mobilen Homecage mit dem Wachvoreinstellung von IcoScan angewendet. Abbildung 5 zeigt die Aktivierungskarte nach einem Experiment zur Stimulation mehrerer Schnurrhaare unter Verwendung des in Abbildung 2beschriebenen Versuchsaufbaus. Einige posteriore und kaudale Schnurrhaare wurden mit folgendem Muster stimuliert: 30 s Baseline, gefolgt von fünf aufeinanderfolgenden Versuchen mit 30 s ON (4 Hz) und 30 s OFF (Abbildung 5C). Die Stimulation erfolgte über einen Servomotor, der von einer Arduino UNO-Karte angetrieben wurde und die Bildaufnahmesequenz für die Synchronisation auslöste. Die signifikante Aktivierung wurde mit der Auflösung eines allgemeinen linearen Modells (GLM) unter Verwendung einer standardmäßigen hämodynamischen Reaktionsfunktion (HRF) der Maus bestimmt. Die mehrfache Vergleichskorrektur wurde mit der Bonferroni-Methode durchgeführt. Der konventionelle Alpha-Wert von 0,05 wurde durch die Gesamtzahl der Voxel im Erfassungsvolumen normalisiert, was zu einem endgültigen strengen Schwellenwert von 0,000003 führte.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig5v2.jpg"> Abbildung 5: Aktivierungskarten und rCBV-Zeitverlauf nach Whisker-Stimulation bei sich wach verhaltenden Mausen. Ein. Aktivierungskarte, die signifikant aktivierte Voxel nach mechanischer Stimulation der rechten Schnurrhaare (30 s ON, 30 s OFF, 5x) in einer wachen Maus im mobilen Homecage zeigt. Karten wurden durch berechnung von Z-Scores basierend auf der allgemeinen linearen Modellanalyse (GLM) mit Bonferroni-Korrektur für den Mehrfachvergleich (Normalisierung durch die Gesamtzahl der Voxel) erhalten. Z-Scores (farbcodiert) werden auf der Allen Brain 3D-Vorlage (nach Registrierung beim Brain Positioning System) überlagert und in drei Ansichten angezeigt: koronal (links), sagittal (Mitte) und axial (rechts). Anatomische Regionen aus dem Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework werden als Referenz angezeigt. Aktivierte Voxel befinden sich gut im linken S1BF-Kortex. Skalenstangen, 1 mm. Jedes Probenvolumen wurde über 1,6 mm (entsprechend 3 Scheiben in Elevationsrichtung) in 3,85 s gescannt, so dass bei jeder funktionellen Reaktion 17 volumische Proben aufgezeichnet werden konnten. B. 3D-Rendering des Anstiegs des durch Die Stimulation des Whiskers evozierten relativen zerebralen Blutvolumens (rCBV) im Vergleich zum Ausgangswert. Die anatomische Abgrenzung des S1BF ist blau dargestellt. Hrsg. Illustration der Maus im mobilen Homecage während des rechten Whisker-Stimulationsexperiments, bei dem fünf 30-s-Versuche für eine Gesamterfassungszeit von 330 s durchgeführt wurden. Momentaner relativer CBV-Zeitverlauf extrahiert innerhalb des aktivierten Bereichs (blau), wobei der entsprechende Reiz überlagert wird (rot). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Abbildung 6 zeigt die zeitlichen Korrelationen von normalisierten niederfrequenten (<0,2 Hz) spontanen CBV-Fluktuationen zwischen 3D-Hirnregionen (identifiziert durch Registrierung zum Gemeinsamen Allen-Koordinatengerüst) in einer Ketamin-Xylazin-anästhesierten Maus. Die Gesamterfassungszeit betrug 20 min (1200 s). Die von Atlas überwachte Analyse ergab starke interhemisphärische Konnektivitätsmuster mit resultierenden Korrelationskoeffizientenwerten von bis zu 0,8. Die samenbasierte Analyse im dorsalen Hippocampus ergab eine signifikante interhemisphärische Konnektivität zwischen rechtem und linkem Hippocampus sowie tiefen retro-hippokampalen Regionen und piriformen Kortexen. Eine im S1BF ausgewählte Saatgutregion ergab ebenfalls ein symmetrisches (kortiko-kortikales) Korrelationsmuster, wie zuvor beschrieben.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig6v2.jpg"> Abbildung 6: Transkranielle volumetrische funktionelle Konnektivität des Mausgehirns im Ruhezustand unter Ketamin/Xylazin-Anästhesie, beurteilt bei einer 20-minütigen 3D-fUS-Akquisition. Ein. Korrelationsmatrix basierend auf 3D-Regionen des gemeinsamen Allen-Koordinatengerüsts, die auf der transkraniellen Funktionserfassung registriert sind. Die Matrix wird durch Berechnung der normalisierten Pearson-Korrelation spontaner niederfrequenter Fluktuationen (<0,1 Hz) der durchschnittlichen Zeitsignale aller Voxel erhalten, die in jedem identifizierten ROI nach der Slice-Timing-Korrektur enthalten sind. Jedes abgetastete Volumen wurde über 1,6 mm in der Höhenrichtung (entsprechend 4 Scheiben) gescannt, die über 2,2 s. Berfasst wurde. Seed-basierte Analyse projiziert auf eine 3D-Vorlage. Der Samen wurde im rechten dorsalen Hippocampus an β - 2, 1 mm ausgewählt. Die Korrelationskarte wird durch Berechnung des Pearson-Korrelationskoeffizienten zwischen den zeitlichen Signalen des Samens und jedem Voxel der gesamten Erfassung nach der Slice-Timing-Korrektur erhalten. C. 3D-Korrelationskarte basierend auf einer samenbasierten Analyse mit ausgewählter Samenregion innerhalb der S1BF bei β - 2,1 mm. Maßstabsbalken: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung volumetrischer zerebraler hämodynamischer Variationen im Mausgehirn mittels funktionellem Ultraschall (fUS). Verfahren für eine funktionelle 3D-Aktivierungskarte nach sensorischer Stimulation sowie funktionelle Konnektivität im Ruhezustand werden als illustrative Beispiele bei anästhesierten und wachen Mäusen bereitgestellt.

3D-Aktivierung des gesamten Gehirns und funktionelle Konnektivitätskartierung bei Mäusen mit transkranieller funktioneller Ultraschallbildgebung

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

Funktioneller Ultraschall ist eine neue Neuroimaging-Modalität, die die Kartierung des zerebralen Blutvolumens im lebenden Nagetiergehirn ermöglicht. Mit ultraschneller flacher Wellenbildgebung können wir hämodynamische Reaktionen des gesamten Gehirns mit unübertroffener spezieller temporärer Auflösung und Empfindlichkeit messen. Dieses Protokoll erklärt, wie transkranielle funktionelle Ultraschallbildgebung bei Mäusen durchgeführt wird, sowohl für betäubte als auch für wache Tierversuche.Im Vergleich zu anderen funktionellen Bildgebungstechniken des gesamten Gehirns wie FMRI bietet funktioneller Ultraschall eine hohe Portabilität, Benutzerfreundlichkeit und ermöglicht Experimente an wachen und sich frei bewegenden Probanden, wodurch Anästhesieverzerrungen vermieden und Verhaltensstudien ermöglicht werden. Bis vor kurzem wurde die FUS-Bildgebung nur in Zusammenarbeit mit Ultraschallexperten eingesetzt. Jetzt steht diese Technologie der breiten neurowissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung, dank kommerziell erhältlicher Scanner und dedizierter Software für die präklinische Bildgebung des Gehirns, wodurch FUS ohne Ultraschallhintergrund ziemlich einfach zu bedienen ist.Tragen Sie für eine betäubte Bildgebungssitzung augensalbe auf die Mausaugen auf, um Hornhautschäden zu vermeiden, und rasieren Sie den Mauskopf mit einem Zittern. Tragen Sie etwas Enthaarungscreme auf und spülen Sie sie nach ein paar Minuten aus. Wiederholen Sie dies, bis die Haare vollständig entfernt sind.Setzen Sie subkutane Stifte in die Gliedmaßen für die Elektrokardiogrammaufzeichnung ein und legen Sie zentrifugiertes Ultraschallgel auf den Kopf. Für wache Mäuseexperimente ist eine vorläufige Operation zur Kopffixierung erforderlich. Legen Sie die betäubte Maus und einen stereotaktischen Rahmen auf ein 37 Grad Celsius heißes Heizkissen.Tragen Sie ein Schutzgel für die Augen auf und verabreichen Sie Lidocain subkutan mit einer 26-Gauge-Nadel unter die Kopfhaut und warten Sie dann einige Minuten. Machen Sie einen Schnitt nach der sagittalen Naht von hinter dem Hinterhauptbein bis zum Anfang des Nasenbeins und verwenden Sie dann eine chirurgische Schere, um die Haut über beide Hemisphären zu entfernen. Reinigen Sie den Schädel mit einer Prozent Jodlösung und entfernen Sie das verbleibende Periost.Markieren Sie mit der Kopfplatte als Schablone zwei Löcher im Schädel, um die Verankerungsschrauben zu positionieren. Positionieren Sie die Kopfplatte mit den Schrauben und verwenden Sie Zahnzement, um die Schrauben und die Kopfplatte an der Vorder- und Rückseite des Rahmens zu befestigen, um einen guten Halt des Implantats zu erhalten. Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen, nachdem der Zement getrocknet ist, und kehren Sie die Anästhesie durch subkutane Injektion von einem Milligramm pro Kilogramm Atipamezol um.Verabreichen Sie prophylaktisches Meloxicam für postoperative Schmerzen. Legen Sie zum Schutz eine magnetische 3D-gedruckte Kappe über die Kopfplatte und lassen Sie die Maus vier bis sechs Tage vor Beginn der Gewöhnung an den Wohnmobilkäfig erholen. Legen Sie das Tier für einige Stunden in einen Aufwachkäfig auf ein Heizkissen und bringen Sie die Maus dann mit Wurfgefährten in ihren Heimkäfig zurück.Am vierten und fünften Tag nach der Genesung klemmen Sie die Maus wiederholt an den Wohnmobilkäfig und erhöhen Sie allmählich die feste Kopfzeit, beginnend mit fünf Minuten und bis zu 30 Minuten. Tragen Sie etwas Kochsalzlösung und Ultraschallgel auf das Bildgebungsfenster auf, um die Maus zu gewöhnen. Wiederholen Sie diesen Vorgang am sechsten Tag nach der Wiederherstellung.Starten Sie die Software und erstellen Sie eine Experimentsitzung. Gehen Sie zum Menü Sonde bewegen, um die Position der Ultraschallsonde über die Navigationstastatur anzupassen. Starten Sie die Live-View-Erfassung und passen Sie die Sondenposition bei Bedarf über eine Echtzeitbildgebung des zerebralen Blutvolumens (CBV) des Tieres an.Richten Sie das Gehirn in der Mitte des Bildes aus und optimieren Sie dann die Bildgebungsparameter, um das höchste Signal-Rausch-Verhältnis zu erfassen. Öffnen Sie die Angio 3D-Option der Erfassungssoftware. Passen Sie im Voreinstellungsbereich die Scanparameter für das erste Slice, das letzte Slice und die Schrittgröße an, um das gesamte Gehirn zu scannen und die Erfassung zu starten.Lassen Sie die Erfassungssoftware offen und starten Sie die Software zur Datenanalyse und Visualisierung, dann laden Sie den Angio 3D-Scan. Navigieren Sie mit dem Drei-Ansichten-Panel durch das Erfassungsvolumen und wählen Sie die koronale Scanrichtung, anteroposterior oder postural anterior. Gehen Sie zum Gehirnregistrierungsbereich und laden Sie die Mausreferenzvorlage für den Registrierungsprozess.Registrieren Sie den Scan auf dem Allen Mouse Common Coordinates Framework mit dem vollautomatischen oder manuellen Registrierungsmodus. Überprüfen Sie das Ergebnis, indem Sie sich die Überlagerung des Angio 3D-Scans und der Referenzvorlage oder die Überlagerung des Scans und des Inbus-Referenzatlas mit dem Atlas-Manager-Bedienfeld ansehen. Speichern Sie die Registrierung als BPS-Datei.Stellen Sie in der ICO Studio-Software sicher, dass der angiographische Scan und seine BPS-Datei geladen sind. Gehen Sie zum Navigationsbereich des Gehirns. Navigieren Sie im Atlas Manager-Bedienfeld mit dem Navigator des übergeordneten untergeordneten Baums durch die Maus Allen Brain Atlas.Suchen Sie die anatomischen Zielregionen und wählen Sie sie aus, um sie dem Scan in den drei Ansichten zu überlagern. Visualisieren Sie die Zielregionen im Bereich mit den drei Ansichten und wählen Sie eine Abbildungsebene, die die Zielregionen für das Experiment überlappt, indem Sie manuell zwei Marker auf der koronalen Position setzen, die den interessierenden Bereich enthält. Klicken Sie auf Brain Positioning System oder BPS, um die resultierenden motorischen Koordinaten zu extrahieren, die der Sondenposition entsprechen, um die Zielebene abzubilden.Überprüfen Sie die Vorschau des Bildes, das aus dem Angio-Scan berechnet wird. Geben Sie in der ICO-Scan-Software das Sondenpositionierungsfeld ein und klicken Sie auf BPS-Koordinaten eingeben, und wenden Sie dann die extrahierten Koordinaten an, wodurch sich die Sonde auf der Zielbildgebungsebene bewegt und ausrichtet. Führen Sie eine Live-View-Erfassung durch und überprüfen Sie, ob die aktuelle Abbildungsebene der Vorhersage entspricht.Definieren Sie die Stimulationssequenz vor, einschließlich des Stimulationszeitpunkts, der Interessestimulationszeit und der Anzahl der Wiederholungen. Führen Sie eine 3D-FUS-Sequenz aus, indem Sie die Gesamterfassungszeit, die Anzahl der Positionen und die Totzeit zwischen den Positionen definieren. Für eine automatische Stimulation, die über den TTL-Eingang mit dem Erfassungssystem synchronisiert ist, wählen Sie die Trig-In-Option, bevor Sie mit der Erfassung beginnen.Öffnen Sie die Akquisition in der ICO Studio-Software und rufen Sie das Aktivierungskartenmenü auf, füllen Sie dann das Aktivierungsmusterfeld mit Start- und Endzeiten aus und berechnen Sie die Aktivierungszuordnung. Passen Sie die Anzeigeparameter für die Visualisierung an und exportieren Sie die Aktivierungskarte als H5-Datei für die Offline-Analyse. Führen Sie eine 3D-FUS-Sequenz aus, indem Sie die Gesamterfassungszeit, die Anzahl der Positionen der Bildgebungsebene und die Totzeit zwischen den Positionen definieren.Speichern Sie die Akquisition und laden Sie sie in die ICO Studio Software. Laden Sie bei Bedarf die BPS-Datei und das Allen Mouse Brain Coordination Framework. Wählen Sie im Atlas-Manager Regionen des Atlas als Interessengebiete aus.Rufen Sie das Menü funktionale Leitfähigkeit auf und wählen Sie die gewünschten Regionen und den ROI-Manager aus. Visualisieren Sie die Ergebnisse als Konnektivitätsmatrix oder Seed-basierte Korrelationskarte, wählen Sie dann die Bandbreitenfilter nach Belieben aus und passen Sie sie an und exportieren Sie die Korrelationsergebnisse für die statistische Analyse. Dieses Protokoll wurde zur 3D-Quantifizierung zerebraler hämodynamischer Variationen transkraniell im Mausgehirn verwendet.Die Whisker-Stimulation wurde als Beispiel für eine sensorische Stimulation ausgewählt, die eine Reaktion hervorruft. Die signifikante Aktivierung wurde mit einer Auflösung eines allgemeinen linearen Modells (GLM) unter Verwendung der standardmäßigen hämodynamischen Reaktionsfunktion der Maus bestimmt. Die Gesamtversuchszeit betrug 760 Sekunden, wobei eine Baseline von 60 Sekunden, eine Stimulation von 80 Sekunden und eine Fünffach wiederholte Erholungszeit von 60 Sekunden erforderlich waren.Unter Verwendung eines voxelweisen Zeitverlaufs des kontralateralen primären somatosensorischen Kortex zeigte die Barrel Field Region oder S1BF einen Anstieg des CBV um 15 bis 20% im Vergleich zum Ausgangswert. Das gleiche Paradigma wurde in einer Maus mit festem Kopfverhalten im Mobilheimkäfig angewendet, die die Wachvoreinstellung des ICO-Scans verwendete. Die Aktivierungskarte nach einem Multiple-Whisker-Stimulationsexperiment ist hier dargestellt.Die signifikante Aktivierung wurde mit der Auflösung eines GLM unter Verwendung einer standardmäßigen hämodynamischen Mausreaktionsfunktion bestimmt. Die zeitlichen Korrelationen haben hier die niederfrequenten spontanen CBV-Fluktuationen zwischen 3D-Hirnregionen in einer Ketamin-Xylazin-anästhesierten Maus normalisiert. Die samenbasierte Analyse und der dorsale Hippocampus zeigten die signifikante interhemisphärische Leitfähigkeit zwischen dem rechten und linken Hippocampus sowie tiefere Retro-Hippocampus-Regionen und piriforme Höflichkeiten.Eine im S1BF ausgewählte Saatgutregion ergab ebenfalls ein symmetrisches Korrelationsmuster. Der kritische Punkt für erfolgreiche Experimente ist die Tierpräparation, insbesondere der Grad der Anästhesie für Experimente mit betäubten Tieren und der Schutz eines Schädels bei Versuchen an wachen Tieren. If US ermöglichte es uns, wichtige Gehirnfunktionen bei wachen Tieren zu untersuchen, die sich mit grundlegenden Fragen zu Schlaf, Lernen oder Verhalten befassen, aber auch mit der pharmakologischen Modulation der funktionellen Konnektivität für die Wirkstoffforschung.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Functional Mapping mit Simultaneous MEG und EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound (fTCD)

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound fTCD

Beurteilung der zerebralen Lateralisation bei Kindern mit Hilfe der funktionellen transkraniellen Doppler-Sonographie (fTCD)

There are many unanswered questions about cerebral lateralization.  In particular, it remains unclear which aspects of language and nonverbal ability are ...

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Aufnahme Menschliche Electrocorticographic (ECoG) Signale für neurowissenschaftliche Forschung und Real-time Funktionelle kortikale Mapping

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funktionelle Bildgebung Auditory Cortex bei erwachsenen Katzen mit Hochfeld-fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Mit optischen Kohärenztomographie und optokinetischen Antwort als strukturelle und funktionelle visuelles System auslesen bei Mäusen und Ratten

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Hyperscanning Experimente mit funktionalen Nah-Infrarot-Spektroskopie

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...