Name: whole-brain 3d activation and functional connectivity mapping in mice using transcranial functional ultrasound imaging
Uploaded: 2021-02-24T15:00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC) מענק מתקדם N° 339244-FUSIMAGINE, הסוכנות הלאומית למימון מחקר 'קמצוץ' (ANR-18-CE37-005), מאיץ טכנולוגיות המחקר של Inserm באולטרסאונד ביו-רפואי, הליבה הטכנית של ElfUS של ה- IPNP, Inserm U1266, תוכנית המחקר האירופית FUSIMICE של פרויקט המוח האנושי, ומלגת EMBO לטווח קצר 8439 לאנדריאה קליוור.

<ol>
	<li>Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+small+animal+magnetic+resonance+imaging+as+a+translational+tool.">Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool.</a> Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).</li><li>Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ultrasound+neuroimaging:+a+review+of+the+preclinical+and+clinical+state+of+the+art.">Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).</li><li>Rabut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmaco-fUS:+Quantification+of+pharmacologically-induced+dynamic+changes+in+brain+perfusion+and+connectivity+by+functional+ultrasound+imaging+in+awake+mice.">Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice.</a> NeuroImage. 222, 117231 (2020).</li><li>Tiran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+functional+ultrasound+imaging+in+freely+moving+awake+mice+and+anesthetized+young+rats+without+contrast+agent.">Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).</li><li>Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+evidence+for+task-induced+deactivation+and+disconnection+of+a+major+default+mode+network+hub+in+the+mouse+brain.">Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).</li><li>Rabut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+functional+ultrasound+imaging+of+whole-brain+activity+in+rodents.">4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents.</a> Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).</li><li>Brunner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platform+for+brain-wide+volumetric+functional+ultrasound+imaging+and+of+circuit+dynamics+in+awake+mice.">A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice.</a> Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).</li><li>Gesnik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+functional+ultrasound+imaging+of+the+cerebral+visual+system+in+rodents.">3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents.</a> NeuroImage. 149, 267-274 (2017).</li><li>Mac&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+functional+ultrasound+imaging+reveals+brain+modules+for+visuomotor+integration.">Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration.</a> Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).</li><li>Mac&#233;, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ultrasound+imaging+of+the+brain.">Functional ultrasound imaging of the brain.</a> Nature Methods. 8 (8), 662-664 (2011).</li><li>Tiran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+functional+ultrasound+imaging+in+freely+moving+awake+mice+and+anesthetized+young+rats+without+contrast+agent.">Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).</li><li>Claron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+functional+ultrasound+imaging+of+the+spinal+cord+reveals+in+depth+spatiotemporal+responses+of+spinal+nociceptive+circuits+in+both+normal+and+inflammatory+state.">Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state.</a> Pain. , (2020).</li><li>Aydin, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+functions+linking+neural+calcium+to+single+voxel+functional+ultrasound+signal.">Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal.</a> Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).</li><li>Bimbard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+mapping+along+the+auditory+hierarchy+using+high-resolution+functional+ultrasound+in+the+awake+ferret.">Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret.</a> eLife. 7, 35028 (2018).</li><li>Boido, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoscopic+and+microscopic+imaging+of+sensory+responses+in+the+same+animal.">Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal.</a> Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).</li><li>Kislin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat-floored+air-lifted+platform:+A+new+method+for+combining+behavior+with+microscopy+or+electrophysiology+on+awake+freely+moving+rodents.">Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).</li><li>Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+behavioral+correlates+in+the+head-fixed+method:+stress+measurements,+habituation+dynamics,+locomotion,+and+motor-skill+learning+in+mice.">Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).</li></ol>

ג'רמי פרייר וברונו-פליקס אוסמנסקי הם עובדי איקוניוס. תומאס דפיו, זולט לנקי, ברונו-פליקס אוסמנסקי ומיכאל טנטר הם מייסדים ובעלי מניות משותפים של Iconeus.

שיטות הדמיה מוחיות שלמות הן כלים חיוניים להבנת פיזיולוגיה ופתולוגיה של המוח טוב יותר. השיטה המתוארת כאן מאפשרת כימות מדויק של אותות המונמיים במוח החי ישירות על הספסל. הרגישות ללא תחרות ורזולוציה spatio-temporal של אולטרסאונד פונקציונלי מתאים במיוחד עבור פיזיולוגיה העכבר. ניתן למפות תגובות פונקציונליות ורשתות מצב מנוחה בתוך זמני רכישה קצרים, לאורך וללא צורך בממוצע ניסויים או נושאים כדי להשיג מידה אמינה. השילוב הרלוונטי של בדיקות ליניאריות קוליות רגישות גבוהה והגדרות ממונעות מהירות מאפשר לבצע הדמיה fUS נפחית transcranial בעכברים בתוך זמני רכישה סבירים. פרוטוקול זה יכול להתבצע על עכברים מרדים או ערים באמצעות כלוב ביתי נייד.
גירוי שפם, הגירוי החושי המשמש כדוגמה להמחשה בכתב יד זה, הוא פרדיגמת הפעלה פונקציונלית סטנדרטית במכרסמים וקריאה אמינה לחקר עיבוד חושי, צימוד נוירווסקולרי ושינויים5,6,10,11. בעוד צחצוח ידני גס של השפם עשוי להיות מועדף על קלות השימוש שלה, שיטה זו חסרה דיוק מרחבי וטמפורלי. השימוש ממריץ אוטומטי, כגון זה המתואר כאן מופעל עם סורק הדמיה fUS, מאפשר שליטה טובה יותר של מספר פרמטרים כולל זמן תחילת, עקירת משרעת, התדירות, כמו גם את הזווית של Q-tip / מסרק, וכתוצאה מכך רבייה בין בעלי חיים טובה יותר. בנוסף, תזמון מדויק יותר של גירוי מאפשר מידול של פונקציית התגובה המודינמית (HRF) על ידי קביעת הזמן להתפרצות וזמן לשיאפרמטרים 12,13. כדי להבטיח דיוק טוב יותר במספר השפם שהוסטה במהלך הגירוי (וכך את אזור האזור המופעל), ניתן להתאים ממריצים מתוחכמים יותר לפרוטוקול זה. גירויים רבים אחרים כגון אור8, צליל14 או מצגת ריח15 ניתן ליישם באמצעות אותו פרוטוקול.
התאימות של אולטרסאונד פונקציונלי עם בעלי חיים ערים ומתנהגים היא יתרון חשוב בהשוואה לטכניקות דימות מוחי אחרות, המאפשרות מיפוי הפעלה פונקציונלי ללא הטיית ההרדמה. שימוש במכלאה ניידת מורמת אוויר היא חלופה טובה למנגנונים קיימים אחרים עם תיקון ראש, כגון הליכונים ליניאריים או כדוריים. תוך תיקון ראש בחוזקה, התנועה של הבית נותן לעכבר את האשליה לנווט בסביבה, ומאפשר מגוון רחב של בדיקות התנהגותיות להיות מצמידים הדמיה fUS16. עם זאת, הליך ההרגלה לתיקון ראש מהווה צעד חשוב להפחתת הלחץ, במיוחד עבור ניסויים שבהם זה יכול להיחשב גורם מבלבל. ההליך המפורט כאן (6 ימים של טיפול והרגל לקיבוע ראש) נותן תוצאות חזקות לגירוי חושי וקישוריות תפקודית של מצב מנוחה. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להאריך את תקופת ההרגלה לבדיקות התנהגותיות מעודנות יותר17.

בשני העשורים האחרונים, דימות מוחי הפך לכלי חשוב לחקר תפקוד המוח וארגון, המאפשר לחוקרים לגלות תגליות חשובות בתחום מדעי המוח. כיום, הדמיית תהודה מגנטית תפקודית (fMRI) הפכה לטכניקת הדמיית המוח הקלינית הסטנדרטית לזהב להערכת משימה או הפעלת מוח מעוררת סמים ומיפוי קישוריות תפקודית במנוחה. בעוד fMRI אנושי יש אמינות גבוהה ורגישות, fMRI עכבר נשאר מאתגר מבחינה טכנית מסיבות רבות1. ראשית, fMRI יש רזולוציה מרחבית וטמפורלית ירודה. הגודל הקטן של מוח העכבר מחייב שימוש בשדות מגנטיים חזקים באמצעות סורקים יקרים כדי להשיג רזולוציה מרחבית סבירה. שנית, שמירה על פרמטרים פיזיולוגיים יציבים בטווח הצר המאפשר צימוד נוירו-וסקולרי יעיל קשה מאוד בעכברים מרדים. לבסוף, רמת החמצן בדם תלויה (BOLD) אות שעליו מחקרי fMRI מסתמכים יש רגישות ירודה יחסית, המוביל יחס אות לרעש נמוך כאשר מוחל על עכברים ולעתים קרובות דורש הצגת גירוי חוזר על פני רכישה ארוכה כדי לזהות וריאציות קטנות. העכבר הוא המודל החייתי הנפוץ ביותר במחקר פרה-רפואי ביו-רפואי, מגבלות אלה אחראיות בחלקן לפער התרגומי בנוירופסיכיאטריה, ומעכבות מטרות טיפוליות מבטיחות חדשות על הספסל שיוחזו לטיפולים יעילים על המיטה.
אולטרסאונד פונקציונלי (fUS) היא טכניקת הדמיה מוחית שפותחה לאחרונה המבוססת על דופלר אולטרה מהיר2. על ידי דגימה ישירה של נפח הדם במוח, טכניקה זו מאפשרת לחטט בפעילות המוח בזמן אמת באמצעות צימוד נוירווסקולרי. בהשוואה לטכניקות דימות מוחי אחרות, fUS מניב רזולוציה מרחבית של 100 מיקרומטר ורזולוציה זמנית בעשרות אלפיות השנייה. טכניקה זו מאפשרת הדמיה מוחית שלמה של חלקים קורונל שלם של מוח העכבר, לגמרי לא פולשני. יתר על כן, הוא תואם לחלוטין עם בעלי חיים מודעים ומתנהגים3,4,5. אחת המגבלות הנוכחיות העיקריות של fUS היא התכונה הדו-פעמית שלה, המאפשרת להקליט מטוס קורונל יחיד בו זמנית. בעוד נפח 3D fUS באמצעות מתמרים מערך מטריצה 2D כבר הוכח בהצלחה בחולדות6 ואושר בעכברים7, חוסר הרגישות הנוכחי שלה דורש גולגולת מלאה, כמו גם ממוצע מספר חשוב של ניסויים כדי לזהות שינוי קל של פעילות. לחלופין, ניתן לדרוך על מתמרים ליניאריים על פני עמדות מרובות ולבצע הדמיה תפקודית מישור אחר מטוס כדי לכסות את כל המוח. עם זאת, טכניקה זו דורשת חזרות פרדיגמה ניסיוניות רבות וכזמן רכישה ארוך כזה (3-4 שעות למוח העכבר)8,9.
בעבודה הנוכחית, אנו מתארים פלטפורמה ניסיונית חזקה הכוללת סורק אולטרסאונד פונקציונלי זמין מסחרית ומתמר ליניארי מהיר מיתוג מטוס עם נהלים לרכישת נתוני fUS 3D בעכברים מורדמים וערים, המאפשר מיפוי פונקציונלי נפחי ותפקודי transcranial של מוח העכבר, לא פולשני, ללא סוכן ניגודיות ובזמני רכישה קצרים. אנו ממחישים תכונה זו על ידי מיפוי הפעלת קליפת המוח הסומטו-סנסורית בעקבות גירוי שפם, כמו גם קישוריות תפקודית של מצב מנוחה. מלבד הכנה לבעלי חיים ואיסוף נתונים, אנו מתארים גם את ההליך להדמיה, רישום אטלס וניתוח של אותות fUS בזמן אמת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Plastipak 1 mL syringes</td>
			<td>Dutscher, France</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 26 Gauge needles</td>
			<td>Dutscher, France</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe)</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>TCAT-2DF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Arduino Uno-Rev3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Orion Pharma, France</td>
			<td>Antisedan&#174;</td>
			<td>5 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Ciment</td>
			<td>Sun M&#233;dical, Shiga, japan</td>
			<td>Superbond C&#38;B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Klorane</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>TVM, UK</td>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair trimmer</td>
			<td>Wella Profesionnals</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head plates</td>
			<td>Neurotar, Finland</td>
			<td>Model 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iconeus One standard package for fUS</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>Iconeus One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IcoScan acquisition software (v1.0)</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>IcoScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IcoStudio analysis software (v1.0)</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>IcoStudio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthesia station</td>
			<td>Minerve, Esternay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Virbac, France</td>
			<td>Ketamine1000</td>
			<td>100 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>Lurocaine&#174;</td>
			<td>20 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma, France</td>
			<td>Domitor&#174;</td>
			<td>1 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Boehringer lingelheim</td>
			<td>Metacam&#174;</td>
			<td>0.5 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile HomeCage Large with tracking capability</td>
			<td>Neurotar, Finland</td>
			<td>MHC-L-T-V4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring of ECG and breathing rate</td>
			<td>AD Systems, (USA) and LabChart software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servomotor</td>
			<td>Feetech</td>
			<td>FT90B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf (Tujunga, USA)</td>
			<td>900-WA</td>
			<td>Using Mouse Adaptor&#160; (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical glue</td>
			<td>3M, USA</td>
			<td>Vetbond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>KD Scientific, USA</td>
			<td>Legato&#174; 130, Cat# 788130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>DREXCO medical, France</td>
			<td>Medi&#39;Gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Bayer, France</td>
			<td>Rompun&#174;</td>
			<td>20 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-brain 3d activation and functional connectivity mapping in mice using transcranial functional ultrasound imaging

הדמיית אולטרסאונד פונקציונלית (fUS) היא אודל הדמיה מוחית חדשנית הנשענת על מדד הרגישות הגבוהה של נפח הדם המוחי שהושג על ידי אנגיוגרפיה דופלרית אולטרה מהירה. כמו זלוף המוח קשורה קשר הדוק לפעילות עצבית מקומית, טכניקה זו מאפשרת מיפוי תלת-ממדי של המוח כולו של הפעלה אזורית הנגרמת על ידי משימות, כמו גם קישוריות תפקודית של מצב מנוחה, באופן לא פולשני, עם רזולוציה מרחבית-זמנית ללא תחרות ופשטות תפעולית. בהשוואה ל- fMRI (הדמיית תהודה מגנטית תפקודית), יתרון עיקרי של הדמיית fUS מורכב מהפעלת תאימות מלאה לניסויים בבעלי חיים ערים ומתנהגים. יתר על כן, מיפוי המוח fMRI בעכברים, המודל הקדם-אקליני הנפוץ ביותר במדעי המוח, נותר מאתגר מבחינה טכנית בשל גודלו הקטן של המוח וקושי לשמור על מצבים פיזיולוגיים יציבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט, אמין וחזק להדמיית fUS של המוח כולו בעכברים מרדים וערים באמצעות מערכת fUS מסחרית מדף עם מתמר ליניארי ממונע, המניב הפעלה קליפת המוח משמעותית בעקבות גירוי חושי, כמו גם דפוס קישוריות פונקציונלי 3D לשחזור לזיהוי רשת.

פרוטוקול זה מתאר את הכימות 3D של וריאציות המודינמיות מוחיות באופן טרנסקרטי במוח העכבר, במנוחה או בתגובה לגירוי חושי. גירוי שפם, פרדיגמה סטנדרטית למיפוי הפעלה תפקודית של המוח במכרסמים, נבחרה כדוגמה לתגובה מעוררת גירוי חושי. איור 4 מציג מפת הפעלה מייצגת בתגובה לגירוי שפם מכני בעכבר מרדים המתקבל באמצעות הדמיית fUS transcranial. זמן הניסיון הכולל היה 760 s, עם בסיס של 60 s (לפני ואחרי הגירוי), גירוי של 80 s וזמן התאוששות של 60, חזר על עצמו 5x. הפעלה משמעותית נקבעה ברזולוציה של מודל ליניארי כללי (GLM) באמצעות פונקציית תגובה המודינמית (HRF) המשמשת כברירת מחדל. האזורים המופעלים (ציוני Z עם ערך p >0.0000006 לאחר תיקון Bonferroni מחמיר להשוואה מרובה) מוצגים כערכים מקודדים בצבע מעל לתבנית מסגרת הקואורדינטות המשותפת של אלן. מהלך הזמן מבחינת Voxel של קליפת המוח הסומטו-סנסורית העיקרית הנגדית, אזור שדה החביות (S1BF) חשף עלייה של 15%-20% ב- CBV בהשוואה לבסיס.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig4v2.jpg"> איור 4: מפות הפעלה טרנס-תברתית וקורס זמן rCBV בעקבות גירוי שפם בעכבר מרדים קטמין/קסילסילאזין. א. מפת הפעלה המציגה ווקסלים המופעלים באופן משמעותי בעקבות גירוי מכני של השפם הימני (80 s ON, 60 s OFF ,5x) תחת הרדמה קטמין/קסילסילאזין. מפות הושגו על ידי חישוב ציוני Z בהתבסס על ניתוח מודל ליניארי כללי (GLM) עם תיקון Bonferroni להשוואה מרובה. ציוני Z (מקודדים בצבע) מכוסים בתבנית תלת-ממד של המוח של אלן (לאחר הרישום במערכת מיקום המוח) ומוצגים בשלוש תצוגות: קורונל (משמאל), קשתית (באמצע) וציר (מימין). אזורים אנטומיים ממסגרת הקואורדינטות הנפוצה של מוח העכבר אלן מוצגים לעיון. voxels מופעל ממוקמים היטב בתוך קליפת המוח השמאלית S1BF. מוט קנה מידה: 1 מ"מ. כל נפח דגימה נסרק מעל 2.8 מ"מ (המקביל ל-7 פרוסות בכיוון הגובה) ב-3.85 s, מה שמאפשר לרשום 20 דגימות וולומיות במהלך כל תגובה פונקציונלית. B. עיבוד תלת-ממדי של גירוי שפם-מעורר נפח דם מוחי יחסי (rCBV) עלייה בהשוואה לרמה הבסיסית. התיוג האנטומי של ה- S1BF מצוין בכחול. ג. קורס זמן של וריאציות CBV ב- S1BF השמאלי (כחול) ובגירוי המתאים מוחל (אדום). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
אותה פרדיגמה הוחלה בעכבר שמתנהג קבוע בראשו בבית הנייד באמצעות הקביעה המוגדרת מראש של IcoScan. איור 5 מציג את מפת ההפעלה לאחר ניסוי גירוי שפם מרובה באמצעות ההתקנה הניסיונית המתוארת באיור 2. כמה שפם אחורי וקדמומי עורר את התבנית הבאה: 30 s בסיסי ואחריו חמישה ניסויים רצופים של 30 s ON (4 הרץ) ו 30 s OFF (איור 5C). גירוי נמסר באמצעות מנוע סרוו מונע על ידי כרטיס Arduino UNO המפעיל את רצף רכישת התמונה לסינכרון. הפעלה משמעותית נקבעה ברזולוציה של מודל ליניארי כללי (GLM) באמצעות פונקציית תגובה המודינמית (HRF) המשמשת כברירת מחדל. בוצע תיקון השוואה מרובה בשיטת Bonferroni. רמת אלפא קונבנציונלית של 0.05 נרמלה על ידי המספר הכולל של voxels בנפח הרכישה, וכתוצאה מכך סף מחמיר סופי של 0.000003.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig5v2.jpg"> איור 5: מפות הפעלה וקורס זמן rCBV בעקבות גירוי שפם בעכבר שהתנהג ער. א. מפת הפעלה המציגה voxels מופעל באופן משמעותי בעקבות גירוי מכני של השפם הימני (30 s ON, 30 s OFF, 5x) בעכבר ער בבית הנייד. מפות הושגו על ידי חישוב ציוני Z בהתבסס על ניתוח מודל ליניארי כללי (GLM) עם תיקון Bonferroni להשוואה מרובה (נורמליזציה במספר הכולל של voxels). ציוני Z (מקודדים בצבע) מכוסים בתבנית תלת-ממד של המוח של אלן (לאחר הרישום במערכת מיקום המוח) ומוצגים בשלוש תצוגות: קורונל (משמאל), קשת (אמצע) וסיקסי (מימין). אזורים אנטומיים ממסגרת הקואורדינטות המשותפת של המוח של אלן עכבר מוצגים לעיון. voxels מופעל ממוקמים היטב בתוך קליפת המוח השמאלית S1BF. מוטות קשקשים, 1 מ"מ. כל נפח מדגם נסרק מעל 1.6 מ"מ (המקביל ל-3 פרוסות בכיוון הגובה) ב-3.85 s המאפשר לרשום 17 דגימות נפחיות במהלך כל תגובה פונקציונלית. ב. עיבוד תלת-ממדי של גירוי שפם-מעורר נפח דם מוחי יחסי (rCBV) עלייה בהשוואה לרמה הבסיסית. התיוג האנטומי של ה- S1BF מצוין בכחול. ג. איור של העכבר בבית הנייד במהלך ניסוי גירוי השפם הנכון, שבמהלכו בוצעו חמישה ניסויים של 30 s לזמן רכישה כולל של 330 s. D. קורס זמן CBV יחסי מיידי שחולץ בתוך האזור הפעיל (כחול), עם הגירוי המתאים על גבי (אדום). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig5v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור 6 מציג את המתאם הזמני של תנודות CBV ספונטניות בתדר נמוך (<0.2 הרץ) בין אזורי מוח תלת-ממדיים (שזוהו מרישום למסגרת הקואורדינטות המשותפת של אלן) בעכבר מרדים קטמין-קסילסין. זמן הרכישה הכולל היה 20 דקות (1200 s). ניתוח בפיקוח אטלס גילה דפוסי קישוריות בין-הומיספיריים חזקים, וערכי מקדם המתאם וכתוצאה מכך הם עד 0.8. ניתוח מבוסס זרעים בהיפוקמפוס האחורי גילה קישוריות בין-הומיספירית משמעותית בין היפוקמפוס ימני ושמאלי, כמו גם אזורי רטרו-היפוקמפוס עמוקים וקורטיז פיריפורם. אזור זרע שנבחר ב- S1BF הביא גם לתבנית מתאם סימטרית (קורטיקו-קליפת המוח), כפי שתואר בעבר.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig6v2.jpg"> איור 6: קישוריות תפקודית של מצב מנוחה נפחית טרנס-cranial של מוח העכבר תחת הרדמה קטמין/קסילן מוערך על רכישת fUS 20 דקות 3D. א. מטריצת מתאם המבוססת על אזורי תלת-ממד של מסגרת הקואורדינטות המשותפת של אלן הרשומה ברכישה התפקודית הטרנס-ת-חנקתית. המטריצה מתקבלת על ידי חישוב המתאם של פירסון מנורמל של תנודות ספונטניות בתדר נמוך (<0.1 הרץ) של אותות הזמן הממוצעים מכל voxels הכלולים בכל ROI מזוהה לאחר תיקון תזמון פרוסה. כל נפח שנדגם נסרק מעל 1.6 מ"מ בכיוון הגובה (המקביל ל -4 פרוסות) שנרכשו מעל 2.2 s. B. ניתוח מבוסס זרעים המוקרן על תבנית תלת-ממד. הזרע נבחר בתוך ההיפוקמפוס הימני בגובה β - 2.1 מ"מ. מפת המתאם מתקבלת על ידי חישוב מקדם המתאם פירסון בין אותות הזמן של הזרע לבין כל ווקסל של הרכישה כולה לאחר תיקון תזמון פרוסה. ג. מפת מתאם תלת-ממדית המבוססת על ניתוח מבוסס זרעים עם אזור זרעים שנבחר בתוך ה-S1BF ב-β - 2.1 מ"מ. מוטות קנה מידה: 1 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig6v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging at JoVE.com

Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

פרוטוקול זה מתאר את הכימות של וריאציות המודינמיות המוח נפחיות במוח העכבר באמצעות אולטרסאונד פונקציונלי (fUS). נהלים עבור מפת הפעלה פונקציונלית תלת-ממדית בעקבות גירוי חושי כמו גם קישוריות תפקודית של מצב מנוחה מסופקים כדוגמאות להמחשה, בעכברים מרדים וערים.

הפעלה תלת-ממדית של המוח כולו ומיפוי קישוריות תפקודית בעכברים באמצעות הדמיית אולטרסאונד תפקודית טרנס-ת-רה-אופן

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

אולטרסאונד פונקציונלי הוא דימות מוחי חדש המאפשר מיפוי של נפח הדם המוחי במוח מכרסם חי. באמצעות הדמיית גלים אולטרה מהירה של מטוס, אנו יכולים למדוד תגובות המודינמיות של המוח כולו ברזולוציה זמנית מיוחדת ללא תחרות ורגישות. פרוטוקול זה מסביר כיצד לבצע הדמיית אולטרסאונד פונקציונלית transcranial בעכברים, הן עבור ניסויים בבעלי חיים מרדים וער.בהשוואה לטכניקות דימות תפקודיות אחרות של המוח, כגון FMRI, אולטרסאונד פונקציונלי מספק ניידות גבוהה, קלות שימוש ומאפשר ניסויים בנושאים ערים ונעים בחופשיות, הימנעות הטיית הרדמה ומאפשרת מחקרים התנהגותיים. עד לאחרונה, הדמיית FUS שימשה רק בשיתוף פעולה עם מומחה אולטרסאונד. עכשיו, טכנולוגיה זו זמינה לקהילת מדעי המוח הרחבה, הודות לסורקים זמינים מסחרית ותוכנה ייעודית להדמיית מוח פרה-אקלינית, מה שהופך את FUS לקל למדי לשימוש ללא כל רקע באולטרסאונד.עבור מפגש הדמיה מרדים, יש למרוח משחת עיניים על עיני העכבר כדי למנוע נזק לקרנית ולגלח את ראש העכבר באמצעות רעד. יש למרוח קצת קרם דפילטורי ולשטוף לאחר מספר דקות. חזור על זה עד שהשיער מוסר לחלוטין.הכנס סיכות תת עוריות בגפיים להקלטת אלקטרוקרדיוגרמה והנח ג'ל אולטרסאונד צנטריפוגה על הראש. לניסויי עכברים ערים, נדרש ניתוח ראשוני עבור קיבוע ראש. מניחים את העכבר המרדים ואת מסגרת סטריאוטקטית על כרית חימום של 37 מעלות צלזיוס.החל ג'ל מגן על העיניים ולנהל לידוקאין תת עורית מתחת לקרקפת באמצעות מחט 26 מד, ולאחר מכן לחכות כמה דקות. בצע חתך בעקבות התפר הקשתי מאחורי העצם העורפית לתחילת עצם האף, ולאחר מכן השתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את העור מעל שתי ההמיספרות. נקה את הגולגולת עם תמיסת יוד אחוז אחד ולהסיר כל periosteum הנותרים.באמצעות צלחת הראש כתבנית, לסמן שני חורים בגולגולת כדי למקם את ברגי העיגון. מקם את צלחת הראש עם הברגים והשתמש במלט דנטלי כדי לתקן את הברגים ואת צלחת הראש בחלק הקדמי והחלק האחורי של המסגרת כדי לשמור על אחיזה טובה של השתל. הסר את החיה מן המסגרת סטריאוטקטית לאחר המלט יבש ולהפוך את ההרדמה באמצעות הזרקה תת עורית של מיליגרם אחד לכל קילוגרם של atipamezole.לנהל meloxicam מניעתי לכאב לאחר הניתוח. הנח מכסה מודפס בתלת-ממד מגנטי מעל צלחת הראש להגנה ואפשר לעכבר להתאושש במשך ארבעה עד שישה ימים לפני תחילת ההרגל לכלוב הבית הנייד. מניחים את החיה בכלוב התאוששות על כרית חימום לכמה שעות, ואז מחזירים את העכבר לכלוב הביתי שלו עם בני זוג.ביום הרביעי והחמש לאחר ההתאוששות, הידקו שוב ושוב את העכבר לכלוב הביתי הנייד והגדילו בהדרגה את זמן קבוע הראש, החל מחמש דקות ועד 30 דקות. החל כמה מלוחים וג'ל אולטרסאונד על חלון ההדמיה כדי להרגיל את העכבר. חזור על תהליך זה ביום השישי לאחר ההתאוששות.הפעל את התוכנה וצור הפעלת ניסוי. עבור לתפריט בדיקה לזוז כדי להתאים את המיקום של בדיקה אולטרסאונד באמצעות מקלדת הניווט. התחל את רכישת התצוגה החיה ולהתאים את מיקום הבדיקה במידת הצורך באמצעות הדמיה בזמן אמת של נפח הדם במוח החי, או CBV.יישר את המוח במרכז התמונה ולאחר מכן מטב את פרמטרי ההדמיה כדי ללכוד את יחס האות לרעש הגבוה ביותר. פתח את האפשרות 3D אנג'יו של תוכנת הרכישה. בחלונית המוגדרת מראש, התאימו את הפרוסה הראשונה, הפרוסה האחרונה ואת פרמטרי הסריקה בגודל הצעד כדי לסרוק את כל המוח ולהתחיל את הרכישה.השאר את תוכנת הרכישה פתוחה והתחל את התוכנה לניתוח נתונים ופריטים חזותיים, ולאחר מכן טען את סריקת Angio 3D. נווט בנפח הרכישה באמצעות לוח שלוש התצוגות ובחר את כיוון הסריקה, anteroposterior או יציבה. עבור אל לוח רישום המוח וטען את תבנית ההפניה לעכבר עבור תהליך הרישום.רשום את הסריקה במסגרת הקואורדינטות המשותפות של אלן עכבר באמצעות מצבי הרישום האוטומטיים או הידניים במלואם. בדוק את התוצאה על ידי התבוננות בסופרפוזיציה של סריקת 3D Angio ותבנית הייחוס, או על ידי התבוננות בסופרפוזיציה של הסריקה ואת אטלס הייחוס של אלן באמצעות החלונית Atlas manager. שמור את הרישום כקובץ BPS.בתוכנת הסטודיו של ICO, ודא שהסריקה האנגיוגרפית וקובץ ה- BPS שלה נטענים. עבור ללוח הניווט במוח. בחלונית Atlas Manager, נווט דרך העכבר אלן אטלס המוח עם נווט עץ הצאצא האב.מצא את האזורים הממוקדים האנטומיים ובחר אותם כדי להנחית אותם לסריקה בשלוש התצוגות. דמיינו את האזורים המיועדים בלוח שלושת הצפייה ובחרו מישור הדמיה החופף לאזורים המיועדים לניסוי על-ידי הגדרה ידנית של שני סמנים על המיקום העגמומי הכולל את אזור העניין. לחץ על מערכת מיקום המוח, או BPS, כדי לחלץ את הקואורדינטות המוטוריות המתקבלות התואמות למיקום הבדיקה כדי לדמיין את המטוס הממוקד.בדוק את התצוגה המקדימה של התמונה אשר מחושבת מתוך סריקת אנגיו. בתוכנת הסריקה של ICO, הזן את לוח מיקום הבדיקה ולחץ על הזן קואורדינטות BPS, ולאחר מכן להחיל את הקואורדינטות שחולצו, מה שגורם לגשוש לנוע וליישר במישור ההדמיה הממוקד. בצע רכישה של תצוגה חיה ובדוק שמישור ההדמיה הנוכחי מתאים לתחזית.הגדירו מראש את רצף הגירוי, כולל זמן הגירוי, זמן גירוי הריבית ומספר החזרות. הפעל רצף FUS תלת-ממדי על-ידי הגדרת זמן הרכישה הכולל, מספר הפוזיציות והזמן המת בין עמדות. עבור גירוי אוטומטי המסונכרן עם מערכת הרכישה באמצעות קלט TTL, בחר באפשרות הטריגונומטריה ב לפני תחילת הרכישה.פתח את הרכישה בתוכנת סטודיו ICO והזן את תפריט מפת ההפעלה ולאחר מכן מלא את שדה תבנית ההפעלה בזמני התחלה וסיום וחשב את מפת ההפעלה. התאם את פרמטרי התצוגה עבור תצוגה חזותית וייצוא מפת ההפעלה כקובץ H5 לניתוח לא מקוון. הפעל רצף FUS תלת-ממדי על-ידי הגדרת זמן הרכישה הכולל, מספר עמדות מטוס ההדמיה והזמן המת בין עמדות.שמור את הרכישה וטען אותה בתוכנת סטודיו ICO. במידת הצורך, טען את קובץ ה- BPS ואת מסגרת תיאום המוח של אלן עכבר. במנהל האטלס, בחר אזורים של האטלס כאזורים בעלי עניין.הזן את תפריט מוליכות פונקציונלי ובחר את האזורים הרצויים ואת מנהל ROI. הצג את התוצאות כמטריצת קישוריות או כמפת מתאם מבוססת זרעים, ולאחר מכן בחר והתאם את מסנני רוחב הפס לפי הצורך וייצוא תוצאות מתאם לניתוח סטטיסטי. פרוטוקול זה שימש לכימות תלת-ממדי של וריאציות המודינמיות במוח העכבר.גירוי שפם נבחר כדוגמה לגירוי חושי שעורר תגובה. הפעלה משמעותית נקבעה ברזולוציה של מודל ליניארי כללי, או GLM, באמצעות פונקציית תגובה המודינמית של העכבר המוגדרת כברירת מחדל. זמן הניסיון הכולל היה 760 שניות, עם קו בסיס של 60 שניות, גירוי של 80 שניות וזמן התאוששות של 60 שניות שחוזר על עצמו חמש פעמים.באמצעות מסלול זמן חכם ווקסל של קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשית הנגדית, אזור שדה החביות, או S1BF, חשף עלייה של 15 עד 20% של CBV בהשוואה לקו הבסיס. אותה פרדיגמה הוחלה בעכבר שמתנהג בראש קבוע בכלוב הבית הנייד באמצעות הקביעה המוגדרת מראש של סריקת ICO. מפת ההפעלה לאחר ניסוי גירוי שפם מרובים מוצגת כאן.הפעלה משמעותית נקבעה ברזולוציה של GLM באמצעות פונקציית תגובה המונמית של עכבר המוגדרת כברירת מחדל. המתאם הזמני נרמל תנודות CBV ספונטניות בתדר נמוך בין אזורי מוח תלת-ממדיים בעכבר מרדים קטמין קסילסין מוצגים כאן. ניתוח מבוסס זרעים וההיפוקמפוס העל-חלל חשפו את המוליכות הבין-הומיספירית המשמעותית בין ההיפוקמפוס הימני והשמאלי, כמו גם אזורי היפוקמפוס רטרו עמוקים יותר ותחנוניות פיריפורם.אזור זרע שנבחר ב- S1BF הביא גם לתבנית מתאם סימטרית. הנקודה הקריטית לניסויים מוצלחים היא הכנת בעלי חיים, ובמיוחד רמת ההרדמה לניסויים הכוללים בעלי חיים מורדמים והגנה על גולגולת בניסויים בבעלי חיים ערים. אם ארה"ב אפשרה לנו לחקור תפקודי מוח חשובים בבעלי חיים ערים המתמודדים עם שאלות בסיסיות על שינה, למידה או התנהגות, אלא גם אפנון פרמקולוגי של קישוריות תפקודית לגילוי תרופות.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

מיפוי פונקציונלית עם מג סימולטני EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound (fTCD)

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound fTCD

הערכת Lateralization מוחין אצל ילדים באמצעות אולטראסאונד דופלר פונקציונלית Transcranial (fTCD)

There are many unanswered questions about cerebral lateralization.  In particular, it remains unclear which aspects of language and nonverbal ability are ...

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

הקלטת אדם Electrocorticographic (ECOG) אותות לחקר Neuroscientific בזמן אמת מיפוי קורטיקלי פונקציונלית

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

הדמיה תפקודית של השמיעתי Cortex בחתולים בוגרים באמצעות גבוהה שדה fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית ותגובה Optokinetic כמו המפרט מבנית ופונקציונליים מערכת הראייה של עכברים וחולדות

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

ניסויים Hyperscanning עם ספקטרוסקופיית אינפרא אדום הפונקציונליים

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...