Name: whole-brain 3d activation and functional connectivity mapping in mice using transcranial functional ultrasound imaging
Uploaded: 2021-02-24T15:00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av European Research Council (ERC) Advanced Grant N° 339244-FUSIMAGINE, National Agency for Research funding 'Pinch' (ANR-18-CE37-005), Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasound, ElfUS tekniske kjerne av IPNP, Inserm U1266, det europeiske forskningsprogrammet FUSIMICE i Human Brain Project, og EMBO Short-Term Fellowship 8439 til Andrea Kliewer.

Alle prosedyrene som presenteres her har blitt utført i samsvar med EUs rådsdirektiv av 22 September 2010 (010/63/UE) og vår lokale etiske komité (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale nummer 59, 'Paris Centre et Sud', prosjekt #2017-23). Voksne mus (mann C57BL/6 Rj, alder 2-3 måneder, 20-30 g, fra Janvier Labs, Frankrike) ble plassert 4 per bur med en 12h lys / mørk syklus, konstant temperatur ved 22 °C og mat- og vannannonse libitum. Før begynnelsen av forsøkene får dyrene en en ukes minimum akklimatiseringsperiode til boligforhold.
1. Dyreforberedelse for bedøvet fUS-avbildning
<ol><li>Anestesi<ol>
<li>Vei musen.</li>
		<li>Forbered en blanding av ketamin og xylazin ved henholdsvis 10 mg/ml og 2 mg/ml i steril saltvann. Administrer 0,2 ml av ketamin/xylazinoppløsningen intraperitonealt ved hjelp av en 26 gauge nål og 1 ml engangssprøyte. Etter noen minutter plasserer du dyret på den stereotaktiske rammen, og sørger for at hodet er flatt.</li>
		<li>Administrer et nytt volum anestesi for å nå en total dose på 100 mg/kg ketamin og 20 mg/kg xylazin (ta hensyn til den første dosen). MERK: Anestesi skal vare i 1 time. For å opprettholde en jevn sedasjon i lengre tid, injiser 0,05 ml av ketamin/xylazinblandingen hver 30 min intraperitonealt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dyreforberedelse for bedøvet bildebehandling
	<ol>
<li>Påfør litt øyesalve (f.eks. Ocry-Gel) på museøyne for å unngå kataraktdannelse under bildebehandlingsøkten. Barber musehodet med en trimmer. Påfør litt depilatorisk krem og skyll etter et par minutter. Gjenta til håret er helt fjernet.</li>
		<li>Sett inn subkutane pinner i lemmer for elektrokardiogramopptak (EKG). Plasser sentrifugert ultralydgel (1500 o/min, 5 min) på hodet.</li>
		<li>Overvåk dybden av anestesi under hele varigheten av forsøkene (anestesiinduksjon inkludert). Opprettholde temperaturen på dyrene ved 37 °C ved å bruke et varmeteppe koblet til en rektal sonde.</li>
		<li>Overvåk følgende fysiologiske parametere som er indirekte indikatorer på anestesidybden: Hjertefrekvens (220-250 slag per minutt - overvåket gjennom elektrokardiogram tynn elektroder implantert subkutant), og Åndedrettsfrekvens (130-140 pust per minutt - overvåket ved hjelp av et spirometer koblet til EKG-oppkjøpssystemet). MERK: En beskrivelse av det eksperimentelle oppsettet er avbildet i figur 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig1v2.jpg"> Figur 1: Eksperimentelt oppsett for bedøvede fUS-eksperimenter. Beskrivelse av det eksperimentelle oppsettet som viser alt vitenskapelig utstyr som trengs under et bedøvet eksperiment. 1. Fysiologisk overvåking : live visning av både respiratoriske og hjertefrekvenser. 2. Fireakset motormodul (tre oversettelser og en rotasjon) overvåket av Iconeus One-systemet (9) og tillater å utføre transkranielle 3D-tomografiske skanninger eller 4D-oppkjøp. 3a. Servomotor som kjører whiskerstimulatoren (3b.) Servomotoren styres av et arduino uno-kort som er koblet til Iconeus One-systemet (9) for å synkronisere stimuleringsmønstre med bildesekvenser. 4.a. Sprøytepumpekontroller. 4.b. Sprøyteholder. 5.a. Temperaturplatemonitor som styrer varmeplaten. 5.b. Varmeplate og rektalt termometer koblet til temperaturplatemonitoren (5.a.). 6. Ultralydgel plassert mellom dyrets hode og ultralydsonden, noe som gir akustisk kobling mellom dem. 7. 15 MHz ultralyd sonde. 8. Probeholder som kobler sonden (7) til motormodulen (2). 9. Iconeus Ett utstyr og programvare, som gjør det mulig å programmere forskjellige bildesekvenser og kontrollere motormodulen (2) som driver sonden (7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
2. Dyreforberedelse for våkne hodefaste museksperimenter
<ol><li>Hodeplate kirurgi<ol>
<li>Plasser det bedøvede dyret (trinn 1.1-1.2) i den stereotaktiske rammen på en varmepute (37 °C). Påfør beskyttende gel for øynene og administrer lidokain s.c. (0,2 ml, 2 %) under hodebunnshuden ved hjelp av en 26-gauge nål og vent noen minutter. MERK: Overvåk anestesinivået hvert 10-30 min ved respons (fravær av) på en fast tåklemme.</li>
		<li>Utfør et snitt etter sagittal sutur fra bak oksipitalbenet til begynnelsen av nesebenet. Bruk kirurgisk saks, sluk huden over begge halvkule.</li>
		<li>Rengjør skallen med 1% jodoppløsning og fjern eventuell gjenværende periosteum. Bruk hodeplaten som mal, bor to hull (1 mm diameter) i skallen for å plassere forankringsskruene. FORSIKTIG: Vær forsiktig så du ikke borer helt gjennom skallen for å unngå hjerneskader eller durabetennelse</li>
		<li>Plasser hodeplaten med skruene. Bruk tannsement til å feste skruene og hodeplaten foran og på baksiden av rammen for å opprettholde godt grep på implantatet. FORSIKTIG: Pass på at du ikke påfører sement inne i rammevinduet, da det i stor grad reduserer signalkvaliteten. Dekk skallen med et tynt lag kirurgisk lim for å beskytte beinet og forsegle sårene på siden av bildevinduet.</li>
		<li>Fjern dyret fra den stereotaxiske rammen etter at sementen er tørr og reversere anestesi ved en subkutan injeksjon av atipamezole ved 1 mg / kg. En profylaktisk administrering av meloksikam (5 mg/kg/dag, s.c.) administreres for postoperative smerter.</li>
		<li>Plasser dyret i et gjenopprettingsbur på en varmepute (37 °C). Musen kan returnere sitt hjemmebur med kullkamerater innen få timer. Plasser en magnetisk 3D-trykt hette (polyaktisk syremateriale med magnetinnsatser) over hodeplaten for beskyttelse (Figur 2A). La musen gjenopprette i 4 til 6 dager før begynnelsen av habituation til bobilburet (MHC). MERK: Den totale vekten av hetten og hodeplaten er 2,8 g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Håndtering og habituation<ol>
<li>På dag 1 etter gjenoppretting (PR) holder du musen forsiktig i hånden i 5-10 minutter flere ganger om dagen.</li>
		<li>På dag 2 PR, gjenta håndtering som i dag 1 og la dyret i 5-10 min utforske fritt MHC. MERK: Å spille bakgrunnsmusikk i rommet kan bidra til å redusere dyrets stress.</li>
		<li>På dag 3 PR, la dyret fritt utforske MHC i 5-10 min. Deretter tar du forsiktig tak i hodeplaten og plasserer den forsiktig i klemmen, og beveger seg manuelt karbonburet for å følge musen. Habituate dyret i hodefast stilling i 5-10 min. Rengjør MHC mellom treningsøkter med 70% etanoloppløsning og skyll med vann fra springen. MERK: Kontroller at MHC får tilstrekkelig luftstrøm som anbefalt av produsenten. Høyden på hodeklemmen må justeres manuelt for å gi en komfortabel posisjon.</li>
		<li>På dag 4 og 5 PR klemmer du gjentatte ganger musen MHC og øker gradvis den hodefaste tiden, fra 5 min og opptil 30 minutter. Påfør litt saltvann og ultralydgel på bildevinduet for å habituate.</li>
		<li>På dag 6 PR gjenta protokollen fra dag 4/5 PR og plasser sonden over dyrets hode etter trinn 3.1.</li>
		<li>På eksperimentets dag fortsetter du som beskrevet ovenfor. Fukt deretter bildevinduet med saltvann og påfør litt ultralydgel. Start sporingen av dyret og fortsett til sondeposisjoneringen (se nedenfor). MERK: Klemming i MHC kan også gjøres ved å pakke musen i en fille. I så fall må mus bli vant til innpakningsprosedyren før hodefiksering. En beskrivelse av et komplett eksperimentelt oppsett for våken bildebehandling finnes i figur 2B.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig2v2.jpg"> Figur 2: Eksperimentelt oppsett for våkne fUS-eksperimenter. En. Skjematisk illustrasjon av det magnetiske hodeplatens deksel som beskytter bildevinduet (opprettet med BioRender.com). Under bildebehandlingsøkter (venstre) fjernes dekselet for å skanne hjernen i den store blenderåpningen som tilbys av hodeplaten. B. Fotografi av det eksperimentelle oppsettet for transkraniell våken bildebehandling i hodefaste fritt oppførende mus. 1. Iconeus One-system og -programvare, slik at du kan sette opp forskjellige bildesekvenser og kontrollere motormodulen. 2. Fireakset motormodul (tre oversettelser og en rotasjon) overvåket av Iconeus One-systemet (1) og tillater 3D-tomografiske skanninger eller 4D-oppkjøp. 3. Luftdispenseringsbord. 4. Mobile Home Cage (MHC). 5a,5b. Fotografier som viser nærmere utsikt over dyrets miljø inne i MHC. 6. Hodefikseringssystem som klemmer hodeplaten. 7. Probeholder som kobler sonden til motormodulen (2). 8. 15 MHz ultralyd sonde. 9. Ultralydgel plassert mellom musehodet og ultralydsonden, noe som gir akustisk kobling mellom dem. 10. Servomotor som kjører whiskerstimulatoren. Servomotor styres av et Arduino Uno-kort som er koblet til Iconeus One-systemet gjennom TTL-signal (1) for å synkronisere stimuleringsmønstre med bildesekvenser. C. Illustrasjon av de forskjellige romlige prøvetakingsmulighetene (opprettet med BioRender.com): I hvert tilfelle går sonden fra første posisjon til den siste, og et Doppler-bilde registreres i hver posisjon for å rekonstruere det stablede volumet. Denne prosessen gjentas kontinuerlig i løpet av hele oppkjøpstiden. Tett skanning (til venstre): Trinnet mellom skivene må være lite nok (vanligvis 400 μm, som tilsvarer høydeoppløsningen) for å tillate volumetrisk avbildning. Sparsom skanning (høyre): Hvis fjerne funksjonsregioner er målrettet (i forskjellige posisjoner), er det også mulig å redusere romlig prøvetaking til bilde forskjellige skiver som krysser disse regionene mens de ikke går på kompromiss med den tidsmessige prøvetakingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig2v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
3. Sondeposisjonering
<ol><li>Start programvaren (f.eks. IcoScan) og opprett en eksperimentøkt. Gå til Flytt sonde-menyen for å justere posisjonen til ultralydsonden ved hjelp av navigasjonstastaturet. MERK: Sonden skal plasseres ca. 1 mm over dyrets hode. Det er avgjørende å sikre at sonden er i kontakt med ultralydgel før du starter en bildesekvens.</li>
	<li>Start Live View-oppkjøpet og juster sondeposisjonen om nødvendig via sanntidsavbildning av dyret CBV (cerebral blodvolum). Juster hjernen i midten av bildet. Optimaliser bildebehandlingsparametrene for å fange opp det høyeste signal-til-støy-forholdet. MERK: I våkne mus eksperimenter, må blenderstørrelsen reduseres for å unngå gjenstander indusert av laterale muskler sammentrekning.</li>
</ol>4. Angiografisk skanning og atlasregistrering
<ol><li>Åpne Angio 3D-alternativet i oppkjøpsprogramvaren. På det forhåndsinnstilte panelet justerer du skanneparameterne (første stykke, siste sektor og trinnstørrelse) for å skanne hele hjernen (Figur 3A, B), og starter oppkjøpet. MERK: Når du konfigurerer skanneparametrene, må du kontrollere at skanningen dekker den bakre delen av hjernen</li>
	<li>La anskaffelsesprogramvaren være åpen og start programvaren for dataanalyse og visualisering (f.eks. IcoStudio), og last inn angio 3D-skanningen. Naviger gjennom anskaffelsesvolumet ved hjelp av 3-visningspanelet, og velg Coronal Scan Direction: antero-posterior eller postero-fremre.</li>
	<li>Gå til Hjerneregistreringspanelet. Last inn musereferansemalen som kreves for registreringsprosessen. Registrer skanningen på Allen Mouse Common Coordinates Framework ved hjelp av den helautomatiske eller manuelle registreringsmodusen ( Figur3C).</li>
	<li>Kontroller resultatet ved å se på superposisjonen til angio 3D-skanningen og referansemalen, eller ved å se på superposisjonen til skanningen og unbrakoreferanseatlaset ved hjelp av Atlas Manager-panelet (Figur 3D). Lagre registreringen som en BPS-fil. MERK: Registreringsfilen kan brukes på nytt for alle andre anskaffelser som utføres i løpet av den samme eksperimentøkten.</li>
</ol>5. Hjerneposisjoneringssystem (BPS)
<ol><li>I IcoStudio-programvaren må du kontrollere at den angiografiske skanningen og BPS-filen (generert i trinn 4.4) er lastet inn.</li>
	<li>Gå til Hjernenavigasjonspanel. I Atlas Manager-panelet navigerer du gjennom hjernen Allen-hjerneatlaset med musens/barnetrenavigatoren. Finn de anatomiske målområdene, og velg dem for å legge dem over skanningen i tre visninger.</li>
	<li>Visualiser de angitte områdene i 3-visningspanelet, og velg et bildeplan som overlapper de angitte områdene for eksperimentet. For å gjøre dette, sett manuelt to markører på koronalposisjonen som inkluderer interesseområdene.</li>
	<li>Klikk på Brain Positioning System (BPS) for å trekke ut de resulterende motorkoordinatene. Disse koordinatene tilsvarer sondeposisjonen som gjør det mulig å avbilde det målrettede planet. Kontroller forhåndsvisningen av bildet som er beregnet fra angio-skanningen.</li>
	<li>I IcoScan-programvaren går du inn i probeposisjoneringspanelet og klikker på Skriv inn BPS-koordinater. Bruk koordinatene som er angitt i trinn 5.4. Sonden beveger seg og justerer seg på det målrettede bildeplanet.</li>
	<li>Utfør en live view-anskaffelse og kontroller at gjeldende bildeplan tilsvarer prediksjonen gitt i trinn 5.4. MERK: Det er også mulig å velge parasagittale/ikke-ortogonale plan.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig3v2.jpg"> Figur 3: Rask transkraniell angiografisk skanning og hjerneregistrering for presis sondeposisjonering. En. Skjematisk representasjon av musehjernen som skannes transcranially av ultralydsonden fra den første koronalskiven (grønn) til den siste koronalskiven (blå) under en rask angiografisk skanning. Den nåværende avbildede skive (representert i rødt) beveger seg trinnvis fra baksiden (grønn) til forsiden (blå) av hjernen. Opprettet med BioRender.com B. Skjermbilde av IcoScan-oppkjøpsprogramvare i Angio 3D-panelet. De forhåndsinnstilte parameterne til høyre konfigurerer hurtigskanningen. Posisjonene i mm av den første skive, den siste skive og trinnstørrelse må være godt valgt for å skanne lineært hele hjernen. C. Skjermbilde av IcoStudio-behandlingsprogramvaren. Den raske Angio 3D-skanningen registreres automatisk i en referansemal for musehjernen. Tre-visninger (venstre) viser superposisjonen av vaskulaturen og musehjernen Allen atlas i koronal, sagittal og aksial utsikt. D. Lineær lay-out (montasje) av 16 skiver (av 31) fra 3D angio skanning, med den registrerte Allen referanse atlas lagt på vaskulaturen. E. Skjermbilde av Hjernenavigasjon-panelet som viser det predikerte bildeplanet som tilsvarer motorkoordinatene som er beregnet av programvaren, takket være de to markørene som er plassert i midten av venstre og høyre primære somatosensoriske cortex, fatfeltregion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig3v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
6. Oppgave-fremkalt eksperiment: whisker stimulering
<ol><li>Fordefiner stimuleringssekvensen, inkludert stimuleringstid, tid mellom stimulering og antall repetisjoner.</li>
	<li>Kjør en 3D fUS-sekvens ved å definere den totale anskaffelsestiden, antall stillinger og dødtid mellom stillinger. Ved automatisk stimulering synkronisert med oppkjøpssystemet gjennom TTL-inngang, velger du Trig-IN-alternativet før du starter oppkjøpet. MERK: For resultatene som presenteres i dette arbeidet, ble stimulering levert ved hjelp av bomullspinne plassert slik at de fleste whiskers kan avledes i dorsal/ventral retning. Det ble fikset på en servomotor drevet av et Arduino UNO-kort, koblet til Iconeus One-systemet for å sikre synkronisering. De anbefalte parametrene for stimulering er 30 s ON, 30 s OFF, amplitude på 20° og 4 Hz frekvens. Alternativt kan stimuleringen også leveres manuelt ved å avlede whiskers på de definerte tidspunktene under oppkjøpet.</li>
	<li>Åpne oppkjøpet i IcoStudio-programvaren og gå inn i aktiveringskartmenyen. Fyll ut aktiveringsmønsterfeltet med start- og sluttidspunkt, og beregn aktiveringstilordningen. Juster visningsparameterne for visualisering. Eksporter aktiveringstilordningen som en H5-fil for frakoblet analyse. MERK: Aktiveringen estimeres ved hjelp av en generalisert lineær modell (GLM) tilnærming med stimulansen innviklet av en standard muse hemodynamisk respons (HRF). Alternativt kan aktivering visualiseres direkte ved å estimere Pearson-korrelasjonen mellom stimuleringsmønsteret og det hemodynamiske signalet fra hver voxel.</li>
</ol>7. 4D funksjonell tilkobling
<ol><li>Kjør en 3D fUS-sekvens ved å definere den totale anskaffelsestiden, antall bildeplanposisjoner samt dødtid mellom posisjoner. MERK: For 4D-funksjonell tilkobling anbefaler vi anskaffelsestid mellom hvert volum < 2,5 s (samplingsfrekvens på minst 0,4 Hz) og en samlet anskaffelsestid på minst 10 minutter (antall tidspunkter > 180).</li>
	<li>Lagre oppkjøpet og last det inn i IcoStudio-programvaren. Last om nødvendig inn BPS-filen og allenmusens hjernekoordinatrammeverk. I Atlas-lederenvelger du områder av atlaset som interesseområder (ROI).</li>
	<li>Gå inn i menyen Funksjonell tilkobling, og velg de ønskede områdene i ROI-behandling. Visualiser resultatene som tilkoblingsmatrise (overvåket analyse) eller frøbasert korrelasjonskart (uten tilsyn). Velg og juster båndbreddefiltrene etter ønske og eksporter korrelasjonsresultater for statistisk analyse. MERK: I 3D fUS-bildebehandlingsmodus stilles de relative sondeposisjonene manuelt inn. Derfor er to typer skanninger mulig og kan velges avhengig av funksjonell applikasjon: tette skanninger kontra sparsomme skanninger (Figur 2C).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+small+animal+magnetic+resonance+imaging+as+a+translational+tool.">Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool.</a> Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).</li><li>Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ultrasound+neuroimaging:+a+review+of+the+preclinical+and+clinical+state+of+the+art.">Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).</li><li>Rabut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmaco-fUS:+Quantification+of+pharmacologically-induced+dynamic+changes+in+brain+perfusion+and+connectivity+by+functional+ultrasound+imaging+in+awake+mice.">Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice.</a> NeuroImage. 222, 117231 (2020).</li><li>Tiran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+functional+ultrasound+imaging+in+freely+moving+awake+mice+and+anesthetized+young+rats+without+contrast+agent.">Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).</li><li>Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+evidence+for+task-induced+deactivation+and+disconnection+of+a+major+default+mode+network+hub+in+the+mouse+brain.">Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).</li><li>Rabut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+functional+ultrasound+imaging+of+whole-brain+activity+in+rodents.">4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents.</a> Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).</li><li>Brunner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platform+for+brain-wide+volumetric+functional+ultrasound+imaging+and+of+circuit+dynamics+in+awake+mice.">A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice.</a> Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).</li><li>Gesnik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+functional+ultrasound+imaging+of+the+cerebral+visual+system+in+rodents.">3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents.</a> NeuroImage. 149, 267-274 (2017).</li><li>Mac&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+functional+ultrasound+imaging+reveals+brain+modules+for+visuomotor+integration.">Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration.</a> Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).</li><li>Mac&#233;, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ultrasound+imaging+of+the+brain.">Functional ultrasound imaging of the brain.</a> Nature Methods. 8 (8), 662-664 (2011).</li><li>Tiran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+functional+ultrasound+imaging+in+freely+moving+awake+mice+and+anesthetized+young+rats+without+contrast+agent.">Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).</li><li>Claron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+functional+ultrasound+imaging+of+the+spinal+cord+reveals+in+depth+spatiotemporal+responses+of+spinal+nociceptive+circuits+in+both+normal+and+inflammatory+state.">Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state.</a> Pain. , (2020).</li><li>Aydin, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+functions+linking+neural+calcium+to+single+voxel+functional+ultrasound+signal.">Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal.</a> Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).</li><li>Bimbard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+mapping+along+the+auditory+hierarchy+using+high-resolution+functional+ultrasound+in+the+awake+ferret.">Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret.</a> eLife. 7, 35028 (2018).</li><li>Boido, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoscopic+and+microscopic+imaging+of+sensory+responses+in+the+same+animal.">Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal.</a> Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).</li><li>Kislin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat-floored+air-lifted+platform:+A+new+method+for+combining+behavior+with+microscopy+or+electrophysiology+on+awake+freely+moving+rodents.">Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).</li><li>Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+behavioral+correlates+in+the+head-fixed+method:+stress+measurements,+habituation+dynamics,+locomotion,+and+motor-skill+learning+in+mice.">Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).</li></ol>

Jeremy Ferrier og Bruno-Félix Osmanski er ansatte i Iconeus. Thomas Deffieux, Zsolt Lenkei, Bruno-Félix Osmanski og Mickael Tanter er medstiftere og aksjonærer i Iconeus.

Hele hjernens avbildningsmetoder er viktige verktøy for å bedre forstå hjernefysiologi og patologi. Metoden beskrevet her tillater presis kvantifisering av hemodynamiske signaler i den levende hjernen direkte på benken. Den uovertruffen følsomhet og romlig-temporal oppløsning av funksjonell ultralyd er spesielt godt egnet for musen fysiologi. Funksjonelle svar og hviletilstandsnettverk kan kartlegges innen korte oppkjøpstider, langsgående og uten å måtte gjennomsnittlige studier eller forsøkspersoner for å oppnå et pålitelig tiltak. Den relevante kombinasjonen av høysensitive ultralyd lineære sonder og raske motoriserte oppsett gjør det mulig for en å utføre transkraniell volumetrisk fUS-avbildning hos mus innen rimelig oppkjøpstid. Denne protokollen kan utføres enten på bedøvede eller våkne mus ved hjelp av et bobilbur.
Whisker stimulering, den sensoriske stimulansen som brukes som et illustrerende eksempel i dette manuskriptet, er et standard funksjonelt aktiveringsparadigme hos gnagere og en pålitelig avlesning for å studere sensorisk behandling, nevrovaskulær kobling og deres endringer5,6,10,11. Mens grov manuell børsting av whiskers kan foretrekkes for brukervennlighet, mangler denne metoden romlig og tidsmessig presisjon. Bruken av en automatisk stimulator, som den som er beskrevet her utløst med fUS-bildeskanneren, gir bedre kontroll over flere parametere, inkludert tidspunktet for utbruddet, amplitudeforskyvningen, frekvensen samt vinkelen på Q-tip / kammen, noe som resulterer i en bedre reproduserbarhet mellom dyr. I tillegg muliggjør en mer presis stimuleringstidsberegning modellering av hemodynamisk responsfunksjon (HRF) ved å bestemme tid til utbrudd og tid til toppparametere12,13. For å sikre bedre presisjon på antall whiskers avbøyd under stimuleringen (og dermed området i den aktiverte regionen), kan mer sofistikerte stimulatorer tilpasses denne protokollen. Mange andre stimuli som lys8, lyd14 eller luktpresentasjon15 kan implementeres ved hjelp av samme protokoll.
Kompatibiliteten til funksjonell ultralyd med våken og oppførende dyr er en viktig fordel sammenlignet med andre nevroimaging teknikker, muliggjør funksjonell aktivering kartlegging uten anestesi bias. Bruk av en luftløftet husvogn er et godt alternativ til andre eksisterende hodefaste apparater som lineære eller sfæriske tredemøller. Mens du er fast hodefast, gir bevegelsen til homecage musen en illusjon om å navigere i miljøet, slik at et bredt spekter av atferdstestinger kan kobles til fUS-bildebehandling16. Imidlertid utgjør habituation-prosedyren for hodefiksing et viktig skritt for å redusere stress, spesielt for eksperimenter der det kan betraktes som en forvirrende faktor. Prosedyren som er beskrevet her (6-dagers håndtering og habituation til hodefiksering) gir robuste resultater for sensorisk stimulering og hviletilstand funksjonell tilkobling. Det kan imidlertid være nødvendig å forlenge habituation-perioden for mer raffinerte atferdstester17.

I løpet av de siste to tiårene har neuroimaging blitt et viktig verktøy for å studere hjernefunksjon og organisering, slik at forskere kan gjøre viktige funn innen nevrovitenskap. I dag har funksjonell magnetisk resonansavbildning (fMRI) blitt gullstandarden klinisk neuroimaging teknikk for å vurdere oppgave eller legemiddel-fremkalt hjerneaktivering og å kartlegge funksjonell tilkobling i ro. Mens menneskelig fMRI har høy pålitelighet og følsomhet, forblir mus fMRI teknisk utfordrende av mange grunner1. For det første har fMRI en dårlig romlig og tidsmessig oppløsning. Den lille størrelsen på musehjernen krever bruk av sterke magnetiske felt ved hjelp av dyre skannere for å oppnå rimelig romlig oppløsning. For det andre er det svært vanskelig å opprettholde stabile fysiologiske parametere innenfor det smale området som tillater effektiv nevrovaskulær kobling hos bedøvede mus. Til slutt har det oksygennivåavhengige (BOLD) signalet i blodet som fMRI-studier er avhengige av, relativt dårlig følsomhet, noe som fører til lavt signal-til-støy-forhold når det brukes på mus, og krever ofte gjentatt stimuluspresentasjon over lang oppkjøp for å oppdage små variasjoner. Musen er den mest brukte dyremodellen i biomedisinsk preklinisk forskning, disse begrensningene er delvis ansvarlige for oversettelsesgapet i nevropsykiatri, noe som hindrer at nye lovende terapeutiske mål på benken blir transponert til effektive behandlinger på sengen.
Funksjonell ultralyd (fUS) er en nylig utviklet neuroimaging teknikk basert på ultrarask doppler2. Ved direkte prøvetaking av cerebral blodvolum, tillater denne teknikken å undersøke hjerneaktivitet i sanntid gjennom nevrovaskulær kobling. Sammenlignet med andre nevroimaging teknikker, fUS gir en romlig oppløsning på 100 μm og en temporal oppløsning i titalls millisekunder. Denne teknikken tillater helhjerneavbildning av komplette koronaldeler av musehjernen, helt ikke-invasivt. Videre er den fullt kompatibel med bevisste og oppførende dyr3,4,5. En av de viktigste nåværende begrensningene ved fUS er 2D-funksjonen, slik at du kan registrere et enkelt koronalplan samtidig. Mens volumetrisk 3D fUS ved hjelp av 2D matrise array transdusere har allerede blitt vellykket demonstrert hos rotter6 og bekreftet hos mus7, krever den nåværende mangelen på følsomhet en full kraniotomi samt gjennomsnitt av et viktig antall studier for å oppdage en liten endring av aktiviteten. Alternativt kan lineære transdusere tråkkes over flere posisjoner og utføre funksjonell bildeplan etter plan for å dekke hele hjernen. Denne teknikken krever imidlertid mange eksperimentelle paradigme repetisjoner og som sådan lange oppkjøpstider (3-4 timer for musehjernen)8,9.
I det nåværende arbeidet beskriver vi en robust eksperimentell plattform, inkludert en kommersielt tilgjengelig funksjonell ultralydskanner og en rask planbyttende lineær svinger med prosedyrer for å skaffe 3D fUS-data hos bedøvede og våkne mus, slik at volumetrisk og transkraniell funksjonell kartlegging av musehjernen, ikke-invasivt, uten kontrastmiddel og innen korte oppkjøpstider. Vi illustrerer denne funksjonen ved å kartlegge somatosensorisk cortex-aktivering etter whiskerstimulering samt hviletilstand funksjonell tilkobling. Bortsett fra dyreforberedelse og datainnsamling, beskriver vi også prosedyren for visualisering, atlasregistrering og analyse av sanntids fUS-signaler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Plastipak 1 mL syringes</td>
			<td>Dutscher, France</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 26 Gauge needles</td>
			<td>Dutscher, France</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe)</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>TCAT-2DF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Arduino Uno-Rev3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Orion Pharma, France</td>
			<td>Antisedan&#174;</td>
			<td>5 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Ciment</td>
			<td>Sun M&#233;dical, Shiga, japan</td>
			<td>Superbond C&#38;B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Klorane</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>TVM, UK</td>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair trimmer</td>
			<td>Wella Profesionnals</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head plates</td>
			<td>Neurotar, Finland</td>
			<td>Model 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iconeus One standard package for fUS</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>Iconeus One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IcoScan acquisition software (v1.0)</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>IcoScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IcoStudio analysis software (v1.0)</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>IcoStudio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthesia station</td>
			<td>Minerve, Esternay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Virbac, France</td>
			<td>Ketamine1000</td>
			<td>100 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>Lurocaine&#174;</td>
			<td>20 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma, France</td>
			<td>Domitor&#174;</td>
			<td>1 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Boehringer lingelheim</td>
			<td>Metacam&#174;</td>
			<td>0.5 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile HomeCage Large with tracking capability</td>
			<td>Neurotar, Finland</td>
			<td>MHC-L-T-V4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring of ECG and breathing rate</td>
			<td>AD Systems, (USA) and LabChart software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servomotor</td>
			<td>Feetech</td>
			<td>FT90B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf (Tujunga, USA)</td>
			<td>900-WA</td>
			<td>Using Mouse Adaptor&#160; (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical glue</td>
			<td>3M, USA</td>
			<td>Vetbond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>KD Scientific, USA</td>
			<td>Legato&#174; 130, Cat# 788130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>DREXCO medical, France</td>
			<td>Medi&#39;Gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Bayer, France</td>
			<td>Rompun&#174;</td>
			<td>20 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-brain 3d activation and functional connectivity mapping in mice using transcranial functional ultrasound imaging

Funksjonell ultralyd (fUS) avbildning er en ny hjerneavbildningsmodalitet som er avhengig av det høysensitive målet på hjerneblodvolumet oppnådd ved ultrarask dopplerangiografi. Siden hjerneperfusjon er sterkt knyttet til lokal nevronaktivitet, tillater denne teknikken 3D-kartlegging av oppgaveindusert regional aktivering samt hviletilstand funksjonell tilkobling, ikke-invasivt, med uovertruffen romlig-temporal oppløsning og operasjonell enkelhet. Sammenlignet med fMRI (funksjonell magnetisk resonansavbildning), består en stor fordel med fUS-avbildning i å muliggjøre en fullstendig kompatibilitet med våkne og oppførende dyreforsøk. Videre er fMRI hjernekartlegging hos mus, den mest brukte prekliniske modellen i nevrovitenskap, fortsatt teknisk utfordrende på grunn av den lille størrelsen på hjernen og vanskeligheten med å opprettholde stabile fysiologiske forhold. Her presenterer vi en enkel, pålitelig og robust protokoll for fUS-avbildning i hele hjernen i bedøvede og våkne mus ved hjelp av et off-the-shelf kommersielt fUS-system med en motorisert lineær svinger, noe som gir betydelig kortikale aktivering etter sensorisk stimulering samt reproduserbart 3D-funksjonelt tilkoblingsmønster for nettverksidentifikasjon.

Denne protokollen beskriver 3D-kvantifisering av cerebral hemodynamiske variasjoner transcranially i musehjernen, i ro eller som svar på sensorisk stimulering. Whisker stimulering, et standard paradigme for å kartlegge hjernens funksjonelle aktivering hos gnagere, har blitt valgt som et eksempel på sensorisk stimulering-fremkalt respons. Figur 4 viser et representativt aktiveringskart som svar på mekanisk whiskerstimulering i en bedøvet mus oppnådd ved hjelp av transkraniell fUS-avbildning. Den totale prøvetiden var 760 s, med en 60 s baseline (før og etter stimuleringen), en 80 s stimulering og en 60 s utvinningstid, gjentatt 5x. Betydelig aktivering ble bestemt med oppløsningen av en generell lineær modell (GLM) ved hjelp av en standard muse hemodynamisk responsfunksjon (HRF). De aktiverte områdene (Z-poengsummer med p-verdi->0,00000006 etter streng Bonferroni-korrigering for flere sammenligninger) vises som fargekodede verdier lagt over den felles rammeverkmalen for Allen-koordinat. Voxel-klok tidsforløp for den kontralaterale primære somatosensoriske cortexen, fatfeltregionen (S1BF) avslørte en 15-20% økning av CBV sammenlignet med baseline.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig4v2.jpg"> Figur 4: Transkraniell aktivering Kart og rCBV-tidskurs etter whiskers stimulering i ketamin/xylazin bedøvet mus. En. Aktiveringskart som viser signifikant aktiverte voxels etter mekanisk stimulering av høyre whiskers (80 s ON, 60 s OFF,5x) under ketamin/xylazinbedøvelse. Kart ble oppnådd ved å beregne Z-poeng basert på generell lineær modellanalyse (GLM) med Bonferroni-korreksjon for flere sammenligninger. Z-score (fargekodet) legges på Allen brain 3D-malen (etter registrering med hjernens posisjoneringssystem) og vises i tre visninger: coronal (venstre), sagittal (midten) og aksial (høyre). Anatomiske regioner fra Allen mus hjernen felles koordinat rammeverk vises for referanse. Aktiverte voxels er godt plassert inne i venstre S1BF cortex. Skalastang: 1 mm. Hvert prøvevolum ble skannet over 2,8 mm (tilsvarende 7 skiver i høyderetningen) i 3,85 s, noe som gjør det mulig å registrere 20 volumprøver under hver funksjonelle respons. B. 3D-gjengivelse av whisker stimulering-fremkalt relativ cerebral blodvolum (rCBV) økning sammenlignet med baseline nivå. Den anatomiske avgrensningen av S1BF er indikert i blått. C. Tidsforløpet for CBV-variasjoner i venstre S1BF (blå) og den tilsvarende stimulansen som brukes (rød). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig4v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Det samme paradigmet har blitt brukt i en hodefast oppførende mus i det mobile homecage ved hjelp av den våkne forhåndsinnstillingen til IcoScan. Figur 5 viser aktiveringskartet etter et multippel whiskerstimuleringseksperiment ved hjelp av det eksperimentelle oppsettet som er beskrevet i figur 2. Noen få bakre og kaudale whiskers ble stimulert med følgende mønster: 30 s baseline etterfulgt av fem påfølgende studier av 30 s ON (4 Hz) og 30 s OFF (Figur 5C). Stimulering ble levert ved hjelp av en servomotor drevet av et Arduino UNO-kort som utløste bildeanskaffelsessekvensen for synkronisering. Betydelig aktivering ble bestemt med oppløsningen av en generell lineær modell (GLM) ved hjelp av en standard muse hemodynamisk responsfunksjon (HRF). Flere sammenligningskorreksjoner ble utført med Bonferroni-metoden. Det konvensjonelle alfanivået på 0,05 ble normalisert av det totale antallet voxels i oppkjøpsvolumet, noe som resulterte i en endelig streng terskel på 0,0000003.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig5v2.jpg"> Figur 5: Aktiveringskart og rCBV-tidskurs etter whiskers stimulering i våken oppførende mus. En. Aktiveringskart som viser betydelig aktiverte voxels etter mekanisk stimulering av høyre whiskers (30 s ON, 30 s OFF, 5x) i en våken mus i den mobile homecage. Kart ble oppnådd ved å beregne Z-score basert på generell lineær modellanalyse (GLM) med Bonferroni-korreksjon for flere sammenligninger (normalisering av totalt antall voxels). Z-score (fargekodet) er lagt på Allen brain 3D-malen (etter registrering med Brain Positioning System) og vises i tre visninger: coronal (venstre), sagittal (midten) og aksial (høyre). Anatomiske regioner fra Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework vises som referanse. Aktiverte voxels er godt plassert inne i venstre S1BF cortex. Vekter stenger, 1 mm. Hvert prøvevolum ble skannet over 1,6 mm (tilsvarende 3 skiver i høyderetningen) i 3,85 s, noe som gjør det mulig å registrere 17 volumprøver under hver funksjonelle respons. B. 3D-gjengivelse av whisker stimulering-fremkalt relativ Cerebral Blood Volume (rCBV) økning sammenlignet med baseline nivå. Den anatomiske avgrensningen av S1BF er indikert i blått. C. Illustrasjon av musen i bobilen under høyre whisker stimulering eksperiment, hvor fem 30 s forsøk ble utført for en total oppkjøpstid på 330 s. D. Øyeblikkelig relativ CBV-tidskurs ekstrahert inne i det aktiverte området (blå), med den tilsvarende stimulansen lagt over (rød). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig5v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Figur 6 viser de tidsmessige korrelasjonene mellom normaliserte lavfrekvente (<0,2 Hz) spontane CBV-svingninger mellom 3D-hjerneregioner (identifisert fra registrering til Allen common coordinate framework) i en ketamin-xylazin bedøvet mus. Samlet anskaffelsestid var 20 min (1200 s). Atlas-overvåket analyse avdekket sterke interhemisfæriske tilkoblingsmønstre, med resulterende korrelasjonskoeffisientverdier opp til 0,8. Frøbasert analyse i dorsal hippocampus avslørte en betydelig interhemisfærisk forbindelse mellom høyre og venstre hippocampus, samt dype retro-hippocampal regioner og piriform kortikaler. En frøregion valgt i S1BF resulterte også i et symmetrisk (kortiko-kortikale) korrelasjonsmønster, som tidligere beskrevet.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig6v2.jpg"> Figur 6: Transkraniell volumetrisk hviletilstand funksjonell tilkobling av musehjernen under ketamin/xylazinbedøvelse vurdert på et 20 min 3D fUS-oppkjøp. En. Korrelasjonsmatrise basert på 3D-regioner i Allens felles koordinatrammeverk registrert på det transkranielle funksjonelle oppkjøpet. Matrisen oppnås ved å beregne den normaliserte Pearsons korrelasjon av spontane lavfrekvente svingninger (<0,1 Hz) av gjennomsnittlige tidssignaler fra alle voxlene som er inkludert i hver identifiserte avkastning etter korrigering av stykketid. Hvert prøvevolum ble skannet over 1,6 mm i høyderetningen (tilsvarende 4 skiver) som er anskaffet over 2,2 s. B. Frøbasert analyse projisert på en 3D-mal. Frøet ble valgt innenfor høyre dorsal hippocampus på β - 2,1 mm. Korrelasjonskart oppnås ved å beregne Pearson Correlation-koeffisienten mellom frøets temporale signaler og hver voxel av hele oppkjøpet etter korrigering av skivetid. C. 3D korrelasjonskart basert på frøbasert analyse med frøregion valgt innenfor S1BF ved β - 2,1 mm. Skalastenger: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig6v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging at JoVE.com

Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

Denne protokollen beskriver kvantifisering av volumetriske cerebral hemodynamiske variasjoner i musehjernen ved hjelp av funksjonell ultralyd (fUS). Prosedyrer for 3D funksjonell aktiveringskart etter sensorisk stimulering samt hviletilstand funksjonell tilkobling er gitt som illustrerende eksempler, i bedøvede og våkne mus.

3D-aktivering av hele hjernen og funksjonell tilkoblingskartlegging hos mus ved hjelp av transkraniell funksjonell ultralydavbildning

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

Funksjonell ultralyd er en ny neuroimaging modalitet som tillater kartlegging av cerebral blodvolum i den levende gnagerhjernen. Ved hjelp av ultrarask planbølgeavbildning kan vi måle hele hjernens hemodynamiske responser med uovertruffen spesiell midlertidig oppløsning og følsomhet. Denne protokollen forklarer hvordan man utfører transkraniell funksjonell ultralydavbildning hos mus, både for bedøvede og våkne dyreforsøk.Sammenlignet med andre funksjonelle bildeteknikker som FMRI, gir funksjonell ultralyd høy bærbarhet, brukervennlighet og tillater eksperimenter hos våken og fritt bevegelige personer, unngå anestesibias og muliggjør atferdsstudier. Inntil nylig ble FUS-avbildning bare brukt i samarbeid med ultralydekspert. Nå er denne teknologien tilgjengelig for det brede nevrovitenskapssamfunnet, takket være kommersielt tilgjengelige skannere og dedikert programvare for preklinisk hjerneavbildning, noe som gjør FUS ganske enkel å bruke uten bakgrunn i ultralyd.For en bedøvet bildebehandlingsøkt, bruk øyesalve på museøyne for å unngå hornhinneskader og barber musehodet ved hjelp av skjelving. Påfør litt depilatorisk krem og skyll etter et par minutter. Gjenta dette til håret er helt fjernet.Sett inn subkutane pinner i lemmer for elektrokardiogramopptak og plasser sentrifugert ultralydgel på hodet. For våken mus eksperimenter, er det nødvendig med en foreløpig kirurgi for hodefiksering. Plasser den bedøvede musen og en stereotaktisk ramme på en 37 grader Celsius varmepute.Påfør beskyttende gel for øynene og administrer lidokain under hodebunnen med en 26 gauge nål, og vent deretter noen minutter. Lag et snitt etter sagittal sutur fra bak occipital bein til begynnelsen av nesebenet, og bruk deretter kirurgisk saks for å skille ut huden over begge halvkule. Rengjør skallen med en prosent jodoppløsning og fjern eventuell gjenværende periosteum.Bruk hodeplaten som mal, merk to hull i skallen for å plassere forankringsskruene. Plasser hodeplaten med skruene og bruk tannsement til å feste skruene og hodeplaten foran og bak på rammen for å opprettholde godt grep på implantatet. Fjern dyret fra den stereotaktiske rammen etter at sementen er tørr og reversere anestesi via subkutan injeksjon av ett milligram per kilo atipamezol.Administrer profylaktisk meloksikam for postoperativ smerte. Plasser en magnetisk 3D-trykt hette over hodeplaten for beskyttelse og la musen gjenopprette i fire til seks dager før begynnelsen av habituation til bobilburet. Plasser dyret i et gjenopprettingsbur på en varmepute i noen timer, og returner deretter musen til hjemmeburet med kullkamerater.På dag fire og fem etter gjenoppretting, klem musen gjentatte ganger til det mobile hjemmeburet og øk gradvis hodet fast tid, fra fem minutter og opptil 30 minutter. Påfør litt saltvann og ultralydgel på bildevinduet for å habituate musen. Gjenta denne prosessen på dag seks etter gjenoppretting.Start programvaren og opprett en eksperimentøkt. Gå til menyen for å flytte proben for å justere posisjonen til ultralydsonden ved hjelp av navigasjonstastaturet. Start live view-oppkjøpet og juster sondeposisjonen om nødvendig via sanntidsavbildning av dyrets cerebral blodvolum, eller CBV.Juster hjernen i midten av bildet, og optimaliser deretter bildebehandlingsparametrene for å fange opp det høyeste signal-til-støy-forholdet. Åpne Angio 3D-alternativet for oppkjøpsprogramvaren. På det forhåndsinnstilte panelet justerer du de første skanneparametrene for skive- og trinnstørrelse for å skanne hele hjernen og starte oppkjøpet.La anskaffelsesprogramvaren være åpen og start programvaren for dataanalyse og visualisering, og last deretter angio 3D-skanningen. Naviger gjennom anskaffelsesvolumet ved hjelp av panelet med tre visninger, og velg koronalskanningsretningen, anteroposterioren eller den posturale fremre. Gå til hjerneregistreringspanelet og last inn musereferansemalen for registreringsprosessen.Registrer skanningen på Allen Mouse Common Coordinates Framework ved hjelp av helautomatiske eller manuelle registreringsmoduser. Kontroller resultatet ved å se på superposisjonen til Angio 3D-skanningen og referansemalen, eller ved å se på superposisjonen til skanningen og Allen Reference Atlas ved hjelp av Atlas-managerpanelet. Lagre registreringen som en BPS-fil.I ICO studio programvare, sørg for at angiografisk skanning og dens BPS fil er lastet. Gå til hjernenavigasjonspanelet. I Atlas Manager-panelet navigerer du gjennom allen brain atlas med musen med den overordnede underordnede trenavigatoren.Finn de anatomiske målområdene, og velg dem for å legge dem over skanningen i de tre visningene. Visualiser de målrettede områdene i panelet med tre visninger, og velg et bildeplan som overlapper de angitte områdene for eksperimentet ved å angi to markører manuelt på koronalposisjonen som inkluderer interesseområdet. Klikk på Brain Positioning System, eller BPS, for å trekke ut de resulterende motorkoordinatene som tilsvarer probeposisjonen for å avbilde det målrettede planet.Kontroller forhåndsvisningen av bildet som er beregnet fra angio-skanningen. I ICO-skanneprogramvaren går du inn i sondeposisjoneringspanelet og klikker på enter BPS-koordinater, og deretter bruker du de ekstraherte koordinatene, noe som får sonden til å bevege seg og justere på det målrettede bildeplanet. Utfør en live view-anskaffelse og kontroller at gjeldende bildeplan tilsvarer prediksjonen.Fordefiner stimuleringssekvensen, inkludert stimuleringstid, rentestimuleringstid og antall repetisjoner. Kjør en 3D FUS-sekvens ved å definere den totale anskaffelsestiden, antall stillinger og dødtiden mellom posisjoner. For automatisk stimulering synkronisert med oppkjøpssystemet gjennom TTL-inngang, velg trig i alternativet før du starter oppkjøpet.Åpne oppkjøpet i ICO studio programvare og gå inn i aktiveringskart menyen, deretter fylle aktivering mønster feltet med en start og sluttidspunkt og beregne aktiveringskartet. Juster visningsparameterne for visualisering og eksporter aktiveringstilordningen som en H5-fil for offline analyse. Kjør en 3D FUS-sekvens ved å definere den totale anskaffelsestiden, antall bildeplanposisjoner og dødtiden mellom posisjoner.Lagre oppkjøpet og last det inn i ICO studio programvare. Last om nødvendig bps-filen og Allen Mouse Brain Coordination Framework. I Atlas Manager velger du områder i Atlas som interesseområder.Gå inn i menyen for funksjonell konduktivitet, og velg de ønskede regionene og avkastningslederen. Visualiser resultatene som tilkoblingsmatrise eller frøbasert korrelasjonskart, velg og juster båndbreddefiltrene etter ønske og eksporter korrelasjonsresultater for statistisk analyse. Denne protokollen ble brukt til 3D-kvantifisering av cerebral hemodynamiske variasjoner transcranially i musehjernen.Whisker stimulering ble valgt som et eksempel på sensorisk stimulering fremkalt respons. Betydelig aktivering ble bestemt med en oppløsning av en generell lineær modell, eller GLM, ved hjelp av standard muse hemodynamisk responsfunksjon. Den totale prøvetiden var 760 sekunder, med en 60 sekunders basislinje, en 80 sekunders stimulering og en 60 sekunders restitusjonstid gjentatt fem ganger.Ved hjelp av et voxel klokt tidsforløp av den kontralaterale primære somatosensoriske cortexen, avslørte fatfeltregionen, eller S1BF, en 15 til 20% økning av CBV sammenlignet med baseline. Det samme paradigmet ble påført i et hode fast oppførende mus i det mobile hjemmeburet ved hjelp av den våkne forhåndsinnstillingen for ICO-skanning. Aktiveringskartet etter et multippel whisker stimuleringseksperiment vises her.Betydelig aktivering ble bestemt med oppløsningen til en GLM ved hjelp av en standard muse hemodynamisk responsfunksjon. De tidsmessige korrelasjonene har normalisert lavfrekvente spontane CBV-svingninger mellom 3D-hjerneregioner i en ketamin xylazin bedøvet mus er vist her. Frøbasert analyse og dorsal hippocampus avslørte den betydelige interhemisfæriske ledningsevnen mellom høyre og venstre hippocampus, samt dypere retro hippocampal regioner og piriform courtesies.Et frøområde valgt i S1BF resulterte også i et symmetrisk korrelasjonsmønster. Det kritiske punktet for vellykkede eksperimenter er dyreforberedelsene, spesielt anestesinivået for eksperimenter som involverer bedøvede dyr og beskyttelse av en skalle i eksperimenter hos våken dyr. Hvis USA gjorde det mulig for oss å studere viktige hjernefunksjoner hos våkne dyr som arbeider med grunnleggende spørsmål om søvn, læring eller atferd, men også den farmakologiske moduleringen av funksjonell tilkobling for narkotikaoppdagelse.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound (fTCD)

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound fTCD

There are many unanswered questions about cerebral lateralization.  In particular, it remains unclear which aspects of language and nonverbal ability are ...

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Funksjonell Kalsium Imaging in Developing kortikal Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Opptak menneskerettigheter Electrocorticographic (ECOG) Signaler for nevrovitenskapelig forskning og Real-time Funksjonell kortikal Mapping

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funksjonell Imaging av auditive cortex hos voksne katter ved hjelp av høy-feltet fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funksjonell testing av to netthinne etter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

I Vivo Functional Brain Imaging tilnærming basert på Bioluminescent Kalsium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Bruke Optical Coherence tomografi og Optokinetic respons som strukturelle og funksjonelle visuelle systemet Readouts i mus og rotter

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Gjennomføre Hyperscanning eksperimenter med funksjonell nær infrarød spektroskopi

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...