Name: whole-brain 3d activation and functional connectivity mapping in mice using transcranial functional ultrasound imaging
Uploaded: 2021-02-24T15:00:00
Duration: 11 min 57 s
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Este trabalho foi apoiado pelo European Research Council (ERC) Advanced Grant N° 339244-FUSIMAGINE, a Agência Nacional de Pesquisa financiando 'Pinch' (ANR-18-CE37-005), o Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasound, o núcleo técnico do IPNP, o Inserm U1266, o programa europeu de pesquisa FUSIMICE do Projeto Cérebro Humano, e a EmBO Short-Term Fellowship 8439 para Andrea Kliewer.

<ol>
	<li>Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+small+animal+magnetic+resonance+imaging+as+a+translational+tool.">Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool.</a> Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).</li><li>Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ultrasound+neuroimaging:+a+review+of+the+preclinical+and+clinical+state+of+the+art.">Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).</li><li>Rabut, C., et al. <a target="_blank" 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functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).</li><li>Claron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+functional+ultrasound+imaging+of+the+spinal+cord+reveals+in+depth+spatiotemporal+responses+of+spinal+nociceptive+circuits+in+both+normal+and+inflammatory+state.">Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state.</a> Pain. , (2020).</li><li>Aydin, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+functions+linking+neural+calcium+to+single+voxel+functional+ultrasound+signal.">Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal.</a> Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).</li><li>Bimbard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+mapping+along+the+auditory+hierarchy+using+high-resolution+functional+ultrasound+in+the+awake+ferret.">Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret.</a> eLife. 7, 35028 (2018).</li><li>Boido, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoscopic+and+microscopic+imaging+of+sensory+responses+in+the+same+animal.">Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal.</a> Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).</li><li>Kislin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat-floored+air-lifted+platform:+A+new+method+for+combining+behavior+with+microscopy+or+electrophysiology+on+awake+freely+moving+rodents.">Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).</li><li>Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+behavioral+correlates+in+the+head-fixed+method:+stress+measurements,+habituation+dynamics,+locomotion,+and+motor-skill+learning+in+mice.">Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).</li></ol>

Jeremy Ferrier e Bruno-Félix Osmanski são funcionários da Iconeus. Thomas Deffieux, Zsolt Lenkei, Bruno-Félix Osmanski e Mickael Tanter são co-fundadores e acionistas da Iconeus.

Métodos de imagem cerebral inteiros são ferramentas cruciais para entender melhor a fisiologia cerebral e a patologia. O método descrito aqui permite a quantificação precisa de sinais hemodinâmicos no cérebro vivo diretamente no banco. A sensibilidade incomparável e a resolução espátula-temporal do ultrassom funcional é particularmente adequada para a fisiologia do camundongo. Respostas funcionais e redes de estado de repouso podem ser mapeadas em curtos tempos de aquisição, longitudinalmente e sem ter que fazer testes ou sujeitos médios para obter uma medida confiável. A combinação relevante de sondas lineares ultrassônicas de alta sensibilidade e configurações motorizadas rápidas permite realizar imagens fUS volumétricas transcranais em camundongos dentro de tempos razoáveis de aquisição. Este protocolo pode ser realizado em camundongos anestesiados ou acordados usando uma gaiola doméstica móvel.
A estimulação do whisker, o estímulo sensorial usado como exemplo ilustrativo neste manuscrito, é um paradigma de ativação funcional padrão em roedores e uma leitura confiável para estudar o processamento sensorial, o acoplamento neurovascular e suas alterações5,6,10,11. Embora a escovação manual grosseira dos bigodes possa ser preferida por sua facilidade de uso, este método carece de precisão espacial e temporal. O uso de um estimulador automático, como o descrito aqui acionado com o scanner de imagem fUS, permite um melhor controle de vários parâmetros, incluindo o tempo de início, o deslocamento da amplitude, a frequência, bem como o ângulo da ponta Q/pente, resultando em uma melhor reprodutibilidade entre animais. Além disso, um tempo mais preciso de estimulação permite a modelagem da Função de Resposta Hemodinâmica (HRF) determinando o tempo de início e o tempo para os parâmetros de pico12,13. Para garantir melhor precisão no número de bigodes desviados durante a estimulação (e, portanto, na área da região ativada), estimuladores mais sofisticados podem ser adaptados a este protocolo. Muitos outros estímulos como luz8,som14 ou apresentação de odor15 podem ser implementados usando o mesmo protocolo.
A compatibilidade do ultrassom funcional com animais acordados e comportados é uma vantagem importante em relação a outras técnicas de neuroimagem, permitindo o mapeamento de ativação funcional sem o viés da anestesia. O uso de uma base doméstica móvel levantada a ar é uma boa alternativa para outros aparelhos fixos na cabeça existentes, como esteiras lineares ou esféricas. Ao ser firmemente fixado na cabeça, o movimento da base dá ao mouse a ilusão de navegar pelo ambiente, permitindo que uma ampla gama de testes comportamentais seja acoplado à imagem fUS16. No entanto, o procedimento de habitação para fixação da cabeça constitui um passo importante para diminuir o estresse, especialmente para experimentos onde pode ser considerado um fator de confusão. O procedimento aqui detalhado (6 dias de manuseio e habituação à fixação da cabeça) dá resultados robustos para estimulação sensorial e conectividade funcional de estado de repouso. No entanto, pode ser necessário estender o período de habituação para testes comportamentais mais refinados17.

Nas últimas duas décadas, a neuroimagem tornou-se uma importante ferramenta para estudar a função e a organização do cérebro, permitindo que os pesquisadores façam descobertas importantes no campo da neurociência. Hoje, a ressonância magnética funcional (fMRI) tornou-se a técnica de neuroimagem clínica padrão ouro para avaliar tarefa ou ativação cerebral evocada por drogas e mapear a conectividade funcional em repouso. Embora o fMRI humano tenha alta confiabilidade e sensibilidade, o fMRI do mouse permanece tecnicamente desafiador por inúmeras razões1. Primeiro, a ressonância magnética tem uma resolução espacial e temporal ruim. O pequeno tamanho do cérebro do camundongo requer o uso de campos magnéticos fortes usando scanners caros para alcançar uma resolução espacial razoável. Em segundo lugar, manter parâmetros fisiológicos estáveis dentro da faixa estreita permitindo um acoplamento neuro vascular eficiente é muito difícil em camundongos anestesiados. Finalmente, o sinal dependente do nível de oxigênio no sangue (BOLD) no qual os estudos de ressonância magnética dependem tem sensibilidade relativamente ruim, levando a baixa relação sinal-ruído quando aplicado a camundongos e muitas vezes requer apresentação repetida de estímulos durante a aquisição longa para detectar pequenas variações. Sendo o camundongo o modelo animal mais utilizado em pesquisas biomédicas pré-clínicas, essas limitações são parcialmente responsáveis pela lacuna translacional na neuropsiquiatria, dificultando que novos alvos terapêuticos promissores no banco sejam transpostos em tratamentos eficazes ao lado da cama.
Ultrassom funcional (fUS) é uma técnica de neuroimagem recentemente desenvolvida baseada em dopplerultrarrápido 2. Ao amostrar diretamente o volume sanguíneo cerebral, esta técnica permite sondar a atividade cerebral em tempo real através do acoplamento neurovascular. Em comparação com outras técnicas de neuroimagem, a FUS produz uma resolução espacial de 100 μm e uma resolução temporal nas dezenas de milissegundos. Esta técnica permite imagens cerebrais inteiras de seções coronais completas do cérebro do camundongo, completamente não invasivamente. Além disso, é totalmente compatível com animais conscientes e comportados3,4,5. Uma das principais limitações atuais do fUS é o seu recurso 2D, permitindo gravar um único plano coronal ao mesmo tempo. Embora o fUS 3D volumoso usando transdutores de matriz 2D já tenha sido demonstrado com sucesso em ratos6 e confirmado em camundongos7, sua atual falta de sensibilidade requer uma craniotomia completa, bem como uma média de um número importante de ensaios para detectar uma ligeira mudança de atividade. Alternativamente, transdutores lineares podem ser pisados em várias posições e realizar imagens funcionais plano por plano para cobrir todo o cérebro. No entanto, essa técnica requer inúmeras repetições de paradigma experimentais e, como esses longos tempos de aquisição (3-4 horas para o cérebro do camundongo)8,9.
No presente trabalho, descrevemos uma plataforma experimental robusta, incluindo um scanner de ultrassom funcional comercialmente disponível e um transdutor linear de mudança de avião rápido com procedimentos para adquirir dados fUS 3D em camundongos anestesiados e acordados, permitindo mapeamento funcional volumétrico e transcranário do cérebro do camundongo, não invasivamente, sem agente de contraste e em curtos tempos de aquisição. Ilustramos esse recurso mapeando a ativação do córtex somatosensorial após a estimulação do bigode, bem como a conectividade funcional de estado de repouso. Além da preparação animal e coleta de dados, descrevemos também o procedimento de visualização, registro de atlas e análise de sinais fUS em tempo real.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Plastipak 1 mL syringes</td>
			<td>Dutscher, France</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 26 Gauge needles</td>
			<td>Dutscher, France</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe)</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>TCAT-2DF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Arduino Uno-Rev3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Orion Pharma, France</td>
			<td>Antisedan&#174;</td>
			<td>5 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Ciment</td>
			<td>Sun M&#233;dical, Shiga, japan</td>
			<td>Superbond C&#38;B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Klorane</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>TVM, UK</td>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair trimmer</td>
			<td>Wella Profesionnals</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head plates</td>
			<td>Neurotar, Finland</td>
			<td>Model 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iconeus One standard package for fUS</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>Iconeus One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IcoScan acquisition software (v1.0)</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>IcoScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IcoStudio analysis software (v1.0)</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>IcoStudio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthesia station</td>
			<td>Minerve, Esternay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Virbac, France</td>
			<td>Ketamine1000</td>
			<td>100 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>Lurocaine&#174;</td>
			<td>20 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma, France</td>
			<td>Domitor&#174;</td>
			<td>1 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Boehringer lingelheim</td>
			<td>Metacam&#174;</td>
			<td>0.5 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile HomeCage Large with tracking capability</td>
			<td>Neurotar, Finland</td>
			<td>MHC-L-T-V4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring of ECG and breathing rate</td>
			<td>AD Systems, (USA) and LabChart software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servomotor</td>
			<td>Feetech</td>
			<td>FT90B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf (Tujunga, USA)</td>
			<td>900-WA</td>
			<td>Using Mouse Adaptor&#160; (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical glue</td>
			<td>3M, USA</td>
			<td>Vetbond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>KD Scientific, USA</td>
			<td>Legato&#174; 130, Cat# 788130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>DREXCO medical, France</td>
			<td>Medi&#39;Gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Bayer, France</td>
			<td>Rompun&#174;</td>
			<td>20 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-brain 3d activation and functional connectivity mapping in mice using transcranial functional ultrasound imaging

A imagem de ultrassom funcional (fUS) é uma nova modalidade de imagem cerebral que se baseia na medida de alta sensibilidade do volume sanguíneo cerebral alcançado pela angiografia doppler ultrarrápida. Como a perfusão cerebral está fortemente ligada à atividade neuronal local, essa técnica permite o mapeamento 3D do cérebro inteiro da ativação regional induzida por tarefas, bem como conectividade funcional de estado de repouso, não invasivamente, com resolução spatio-temporal incomparável e simplicidade operacional. Em comparação com a ressonância magnética (ressonância magnética funcional), uma das principais vantagens da imagem fUS consiste em permitir uma compatibilidade completa com experimentos animais acordados e comportados. Além disso, o mapeamento cerebral de ressonância magnética em camundongos, o modelo pré-clínico mais utilizado na Neurociência, permanece tecnicamente desafiador devido ao pequeno tamanho do cérebro e à dificuldade de manter condições fisiológicas estáveis. Aqui apresentamos um protocolo simples, confiável e robusto para imagens de fUS cérebro inteiro em camundongos anestesiados e acordados usando um sistema fUS comercial fora da prateleira com um transdutor linear motorizado, produzindo ativação cortical significativa após estimulação sensorial, bem como padrão de conectividade funcional 3D reprodutível para identificação de rede.

Este protocolo descreve a quantificação 3D de variações hemodinâmicas cerebrais transcranicamente no cérebro do camundongo, em repouso ou em resposta à estimulação sensorial. A estimulação do whisker, um paradigma padrão para mapear a ativação funcional cerebral em roedores, foi selecionada como um exemplo de resposta sensorial evocada por estimulação. A Figura 4 mostra um mapa de ativação representativo em resposta à estimulação mecânica do bigode em um rato anestesiado obtido usando imagens transcranianas fUS. O tempo total de ensaio foi de 760, com uma linha de base de 60 s (antes e depois da estimulação), uma estimulação de 80 s e um tempo de recuperação de 60 s, repetido 5x. A ativação significativa foi determinada com a resolução de um modelo linear geral (GLM) utilizando uma função de resposta hemodinâmica padrão do mouse (HRF). As regiões ativadas (escores Z com valor p >0,0000006 após a rigorosa correção de Bonferroni para comparação múltipla) são exibidas como valores codificados por cores sobrepostos ao modelo de estrutura de coordenadas comum allen. O curso de tempo do córtex somatosensorial primário contralateral, região do campo de barril (S1BF) revelou um aumento de 15-20% do CBV em comparação com a linha de base.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig4v2.jpg"> Figura 4: Ativação transcraniana Mapas e curso de tempo rCBV seguindo estimulação de bigodes em ketamina/xilazine anesthetized mouse. Um. Mapa de ativação mostrando voxels significativamente ativados após estimulação mecânica dos bigodes certos (80 s ON, 60 s OFF ,5x) sob anestesia cetamina/xilazina. Os mapas foram obtidos por cálculo de escores Z com base na análise geral do modelo linear (GLM) com correção de Bonferroni para comparação múltipla. As pontuações Z (codificadas por cores) são sobrepostas no modelo 3D cerebral Allen (após o registro no sistema de posicionamento cerebral) e exibidas em três pontos: coronal (esquerda), sagital (meio) e axial (direita). Regiões anatômicas do cérebro do rato Allen são exibidas para referência. Os voxels ativados estão bem localizados dentro do córtex S1BF esquerdo. Barra de escala: 1 mm. Cada volume amostral foi escaneado acima de 2,8 mm (correspondendo a 7 fatias na direção de elevação) em 3,85 s, permitindo registrar 20 amostras volumicas durante cada resposta funcional. B. Renderização 3D do volume sanguíneo cerebral relativo evocado pela estimulação do bigode (rCBV) aumenta em comparação com o nível de linha de base. O delineamento anatômico do S1BF é indicado em azul. C. Curso de tempo das variações cbv no S1BF esquerdo (azul) e o estímulo correspondente aplicado (vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O mesmo paradigma foi aplicado em um mouse de comportamento fixo na base móvel usando o predefinição acordado do IcoScan. A Figura 5 apresenta o mapa de ativação após um experimento de estimulação de bigode múltiplo usando a configuração experimental descrita na Figura 2. Alguns bigodes posteriores e caudais foram estimulados com o seguinte padrão: linha de base de 30 s seguida por cinco ensaios consecutivos de 30 s ON (4 Hz) e 30 s OFF(Figura 5C). A estimulação foi fornecida usando um servo-motor conduzido por um cartão UNO Arduino desencadeando a sequência de aquisição de imagem para sincronização. A ativação significativa foi determinada com a resolução de um modelo linear geral (GLM) utilizando uma função de resposta hemodinâmica padrão do mouse (HRF). A correção de comparação múltipla foi realizada com o método Bonferroni. O nível alfa convencional de 0,05 foi normalizado pelo número total de voxels no volume de aquisição, resultando em um limite final rigoroso de 0,000003.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig5v2.jpg"> Figura 5: Mapas de ativação e curso de tempo rCBV seguindo a estimulação dos bigodes no mouse de comportamento acordado. Um. Mapa de ativação mostrando voxels significativamente ativados após estimulação mecânica dos bigodes certos (30 s ON, 30 s OFF, 5x) em um mouse acordado na base móvel. Os mapas foram obtidos por pontuação de Z-scores com base na análise geral do modelo linear (GLM) com correção de Bonferroni para comparação múltipla (normalização pelo número total de voxels). As pontuações Z (codificadas por cores) são sobrepostas no modelo 3D cérebro Allen (após o registro no Sistema de Posicionamento cerebral) e exibidas em três pontos: coronal (esquerda), sagital (médio) e axial (direita). Regiões anatômicas do Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework são exibidas para referência. Os voxels ativados estão bem localizados dentro do córtex S1BF esquerdo. Barras de escala, 1 mm. Cada volume amostral foi escaneado acima de 1,6 mm (correspondendo a 3 fatias na direção de elevação) em 3,85 s, permitindo registrar 17 amostras volumicas durante cada resposta funcional. B. Renderização 3D do volume sanguíneo relativo (rCBV) evocado pela estimulação do bigode (rCBV) aumenta em comparação com o nível de linha de base. O delineamento anatômico do S1BF é indicado em azul. C. Ilustração do mouse na homecage móvel durante o experimento de estimulação do bigode direito, durante o qual cinco ensaios de 30 foram realizados para um tempo total de aquisição de 330 s. D. Curso de tempo relativo instantâneo cbv extraído dentro da área ativada (azul), com o estímulo correspondente sobreposto (vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig5v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A Figura 6 mostra as correlações temporais de flutuações espontâneas de CBV de baixa frequência (<0,2 Hz) entre regiões cerebrais 3D (identificadas desde o registro para a estrutura coordenada comum de Allen) em um camundongo anesthetizado de cetamina xylazina. O tempo total de aquisição foi de 20 min (1200 s). A análise supervisionada pelo Atlas revelou fortes padrões de conectividade interhemisférica, com valores de coeficiente de correlação resultantes de até 0,8. A análise baseada em sementes no hipocampo dorsal revelou uma conectividade interhemisférica significativa entre o hipocampo direito e esquerdo, bem como regiões retro-hipocampais profundas e cortices piriformes. Uma região de sementes selecionada no S1BF também resultou em um padrão de correlação simétrico (cortico-cortical), como descrito anteriormente.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig6v2.jpg"> Figura 6: Conectividade funcional de estado de repouso volátrico transcranal do cérebro do camundongo sob anestesia cetamina/xilazina avaliada em uma aquisição de 20 min 3D fUS. Um. Matriz de correlação baseada em regiões 3D da estrutura coordenada comum de Allen registrada na aquisição funcional transcranária. A matriz é obtida pela computação da correlação normalizada de Pearson de flutuações espontâneas de baixa frequência (<0,1 Hz) dos sinais de tempo médio de todos os voxels incluídos em cada ROI identificado após correção de tempo de fatia. Cada volume amostrado foi escaneado ao longo de 1,6 mm na direção de elevação (correspondente a 4 fatias) adquiridos ao longo de 2,2 s. B. Análise baseada em sementes projetada em um modelo 3D. A semente foi selecionada dentro do hipocampo dorsal direito em β - 2,1 mm. O mapa de correlação é obtido computando o coeficiente de correlação de Pearson entre os sinais temporais da semente e cada voxel de toda a aquisição após correção do tempo da fatia. Mapa de correlação 3D com base na análise baseada em sementes com região de sementes selecionada dentro do S1BF em β - 2,1 mm. Barras de escala: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig6v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

Este protocolo descreve a quantificação de variações hemodinâmicas cerebrais volumosas no cérebro do camundongo usando ultrassom funcional (fUS). Procedimentos para mapa de ativação funcional 3D após estimulação sensorial, bem como conectividade funcional de estado de repouso são fornecidos como exemplos ilustrativos, em camundongos anestesiados e acordados.

Ativação 3D do cérebro inteiro e mapeamento de conectividade funcional em camundongos usando imagens de ultrassom funcional transcranário

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

O ultrassom funcional é uma nova modalidade de neuroimagem que permite o mapeamento do volume sanguíneo cerebral no cérebro de roedores vivos. Usando imagens de ondas de avião ultra rápidas, podemos medir respostas hemodinâmicas cerebrais inteiras com resolução temporária e sensibilidade especiais incomparáveis. Este protocolo explica como realizar imagens de ultrassom funcional transcrancial em camundongos, tanto para experimentos anestoetizados quanto acordados em animais.Em comparação com outras técnicas de imagem funcional do cérebro, como a FMRI, o ultrassom funcional proporciona alta portabilidade, facilidade de uso e permite experimentos em indivíduos acordados e livremente em movimento, evitando viés de anestesia e permitindo estudos comportamentais. Até recentemente, a imagem de FUS só era usada em colaboração com o especialista em ultrassom. Agora, esta tecnologia está disponível para a ampla comunidade de neurociências, graças a scanners comercialmente disponíveis e software dedicado para imagens cerebrais pré-clínicas, tornando o FUS muito fácil de usar sem qualquer fundo no ultrassom.Para uma sessão de imagem anestesiada, aplique pomada ocular nos olhos do rato para evitar qualquer dano na córnea e raspe a cabeça do rato usando um tremor. Aplique um pouco de creme depilatório e enxágue depois de alguns minutos. Repita isso até que o cabelo esteja completamente removido.Insira pinos subcutâneos nos membros para gravação de eletrocardiograma e coloque gel de ultrassom centrifugado na cabeça. Para experimentos com camundongos acordados, uma cirurgia preliminar é necessária para fixação da cabeça. Coloque o mouse anestesiado e um quadro estereotático em uma almofada de aquecimento de 37 graus Celsius.Aplique gel protetor para os olhos e administrou subcutâneamente a administração de lidocaína sob o couro cabeludo usando uma agulha de calibre 26, em seguida, espere alguns minutos. Faça uma incisão seguindo a sutura sagital de trás do osso occipital até o início do osso nasal, em seguida, use uma tesoura cirúrgica para extirer a pele sobre ambos os hemisférios. Limpe o crânio com uma solução de iodo de um por cento e remova qualquer periosteum restante.Usando a placa da cabeça como modelo, marque dois orifícios no crânio para posicionar os parafusos de ancoragem. Posicione a placa da cabeça com os parafusos e use cimento dental para fixar os parafusos e a placa da cabeça na frente e atrás da estrutura para manter uma boa aderência do implante. Remova o animal da estrutura estereotática depois que o cimento estiver seco e reverta a anestesia através de injeção subcutânea de um miligrama por quilograma de atipamezole.Administre meloxicam profilatática para dor pós-operatória. Coloque uma tampa impressa 3D magnética sobre a placa da cabeça para proteção e permita que o mouse se recupere por quatro a seis dias antes do início da habituação à gaiola doméstica móvel. Coloque o animal em uma gaiola de recuperação em uma almofada de aquecimento por algumas horas, em seguida, devolva o rato para sua gaiola de origem com companheiros de lixo.Nos dias quatro e cinco pós-recuperação, fixar repetidamente o mouse na gaiola doméstica móvel e aumentar gradualmente o tempo fixo da cabeça, começando de cinco minutos e até 30 minutos. Aplique um pouco de gel salino e ultrassom na janela de imagem para habituar o mouse. Repita este processo no sexto dia após a recuperação.Inicie o software e crie uma sessão de experimentos. Vá para o menu da sonda de movimento para ajustar a posição da sonda de ultrassom usando o teclado de navegação. Inicie a aquisição da visualização ao vivo e ajuste a posição da sonda, se necessário, através de imagens em tempo real do volume sanguíneo cerebral animal, ou CBV.Alinhe o cérebro no centro da imagem e, em seguida, otimize os parâmetros de imagem para capturar a maior relação sinal/ruído. Abra a opção Angio 3D do software de aquisição. No painel predefinido, ajuste os parâmetros de varredura da primeira fatia, última fatia e tamanho da etapa, a fim de escanear todo o cérebro e iniciar a aquisição.Deixe o software de aquisição aberto e inicie o software para análise e visualização de dados e, em seguida, carregue a varredura Angio 3D. Navegue pelo volume de aquisição usando o painel de três visualizações e selecione a direção de varredura coronal, anteroposterior ou postural anterior. Vá ao painel de registro cerebral e carregue o modelo de referência do mouse para o processo de registro.Registre a varredura no Allen Mouse Common Coordinates Framework usando os modos de registro totalmente automáticos ou manuais. Verifique o resultado olhando para a superposição da varredura Angio 3D e o modelo de referência, ou olhando para a superposição da digitalização e do Atlas de Referência Allen usando o painel gerenciador atlas. Salve o registro como um arquivo BPS.No software de estúdio da ICO, certifique-se de que a varredura angiográfica e seu arquivo BPS estejam carregados. Vá para o painel de navegação cerebral. No painel do Atlas Manager, navegue pelo mouse Allen Brain Atlas com o navegador de árvore de crianças-mãe.Encontre as regiões-alvo anatômicas e selecione-as para sobrepor-as ao scan nas três visualizações. Visualize as regiões-alvo no painel de três visualizações e escolha um plano de imagem que se sobreponha às regiões-alvo para o experimento, definindo manualmente dois marcadores na posição coronal que inclui a região de interesse. Clique no Sistema de Posicionamento cerebral, ou BPS, para extrair as coordenadas do motor resultantes que correspondem à posição da sonda para visualizar o plano alvo.Verifique a visualização da imagem que é computada a partir da varredura angio. No software de varredura ICO, digite o painel de posicionamento do teste e clique em entrar nas coordenadas do BPS e, em seguida, aplique as coordenadas extraídas, fazendo com que a sonda se mova e se alinhe no plano de imagem alvo. Realize uma aquisição de visualização ao vivo e verifique se o plano de imagem atual corresponde à previsão.Predefine a sequência de estimulação, incluindo tempo de estimulação, tempo de estimulação de juros e número de repetições. Execute uma sequência de FUS 3D definindo o tempo total de aquisição, o número de posições e o tempo morto entre as posições. Para estimular a estimulação automática sincronizada com o sistema de aquisição através da entrada TTL, selecione o trigonometria na opção antes de iniciar a aquisição.Abra a aquisição no software de estúdio da ICO e insira no menu do mapa de ativação, em seguida, preencha o campo padrão de ativação com um horário de início e fim e computação do mapa de ativação. Ajuste os parâmetros de exibição para visualização e exporte o mapa de ativação como um arquivo H5 para análise off-line. Execute uma sequência de FUS 3D definindo o tempo total de aquisição, o número de posições de avião de imagem e o tempo morto entre as posições.Salve a aquisição e carregue-a no software do estúdio da ICO. Se necessário, carregue o arquivo BPS e a Estrutura de Coordenação do Cérebro do Rato Allen. No Atlas Manager, selecione regiões do Atlas como regiões de interesse.Digite o menu de condutividade funcional e selecione as regiões desejadas e o gerenciador de ROI. Visualize os resultados como matriz de conectividade ou mapa de correlação baseado em sementes, selecione e ajuste os filtros de largura de banda conforme desejado e exporte resultados de correlação para análise estatística. Este protocolo foi usado para quantificação 3D de variações hemodinâmicas cerebrais transcranicamente no cérebro do camundongo.A estimulação do bigode foi selecionada como um exemplo de estimulação sensorial evocada resposta. A ativação significativa foi determinada com a resolução de um modelo linear geral, ou GLM, usando função de resposta hemodinâmica padrão do mouse. O tempo total de teste foi de 760 segundos, com uma linha de base de 60 segundos, uma estimulação de 80 segundos, e um tempo de recuperação de 60 segundos repetido cinco vezes.Usando um curso de tempo voxel sábio do córtex somatosensorial primário contralateral, a região do campo do barril, ou S1BF, revelou um aumento de 15 a 20% do CBV em comparação com a linha de base. O mesmo paradigma foi aplicado em um mouse de comportamento fixo na gaiola doméstica móvel usando a predefinição acordada da varredura de ICO. O mapa de ativação após um experimento de estimulação de bigode múltiplo é mostrado aqui.A ativação significativa foi determinada com a resolução de um GLM usando uma função de resposta hemodinâmica padrão do mouse. As correlações temporais normalizaram flutuações espontâneas de CBV de baixa frequência entre regiões cerebrais 3D em um camundongo anesthetizado de cetamina xilazina são mostrados aqui. A análise baseada em sementes e o hipocampo dorsal revelaram a condutividade interhemisférica significativa entre o hipocampo direito e esquerdo, bem como regiões hipocampais retrô mais profundas e cortesias piriformes.Uma região de sementes selecionada no S1BF também resultou em um padrão de correlação simétrica. O ponto crítico para experimentos bem-sucedidos é a preparação animal, em particular o nível de anestesia para experimentos envolvendo animais anestesiados e a proteção de um crânio em experimentos em animais acordados. Se os EUA nos permitiram estudar funções cerebrais importantes em animais acordados que lidam com questões fundamentais sobre sono, aprendizagem ou comportamento, mas também a modulação farmacológica da conectividade funcional para a descoberta de drogas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Mapeamento funcional com MEG e EEG em simultâneo

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Neurociência

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound (fTCD)

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound fTCD

Avaliação da lateralização cerebral em crianças usando Funcional ultra-som Doppler transcraniano (fTCD)

There are many unanswered questions about cerebral lateralization.  In particular, it remains unclear which aspects of language and nonverbal ability are ...

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Imagem de cálcio funcional em desenvolvimento de redes Cortical

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Gravação Humanos eletrocorticográfica (ECOG) Sinais para pesquisa neurocientífica e mapeamento em tempo real Funcional Cortical

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Imagem Funcional do Cortex Auditivo em gatos adultos usando de alta campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Usando a tomografia de coerência óptica e resposta Optokinetic como estrutural e funcional sistema Visual leituras em camundongos e ratos

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Hyperscanning experimentos com espectroscopia de infravermelho próximo funcional

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...