Name: whole-brain 3d activation and functional connectivity mapping in mice using transcranial functional ultrasound imaging
Uploaded: 2021-02-24T15:00:00
Duration: 11 min 57 s
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Este trabajo fue apoyado por la Beca Avanzada N° 339244-FUSIMAGINE del Consejo Europeo de Investigación (ERC), la Agencia Nacional de Investigación que financia 'Pinch' (ANR-18-CE37-005), el Inserm Research Technology Accelerator in Biomedical Ultrasound, el núcleo técnico ElfUS del IPNP, Inserm U1266, el programa de investigación europeo FUSIMICE del Proyecto Cerebro Humano, y EMBO Short-Term Fellowship 8439 a Andrea Kliewer.

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	<li>Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+small+animal+magnetic+resonance+imaging+as+a+translational+tool.">Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool.</a> Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).</li><li>Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ultrasound+neuroimaging:+a+review+of+the+preclinical+and+clinical+state+of+the+art.">Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).</li><li>Rabut, C., et al. <a target="_blank" 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+functions+linking+neural+calcium+to+single+voxel+functional+ultrasound+signal.">Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal.</a> Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).</li><li>Bimbard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+mapping+along+the+auditory+hierarchy+using+high-resolution+functional+ultrasound+in+the+awake+ferret.">Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret.</a> eLife. 7, 35028 (2018).</li><li>Boido, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoscopic+and+microscopic+imaging+of+sensory+responses+in+the+same+animal.">Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal.</a> Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).</li><li>Kislin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat-floored+air-lifted+platform:+A+new+method+for+combining+behavior+with+microscopy+or+electrophysiology+on+awake+freely+moving+rodents.">Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).</li><li>Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+behavioral+correlates+in+the+head-fixed+method:+stress+measurements,+habituation+dynamics,+locomotion,+and+motor-skill+learning+in+mice.">Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice.</a> Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).</li></ol>

Jeremy Ferrier y Bruno-Félix Osmanski son empleados de Iconeus. Thomas Deffieux, Zsolt Lenkei, Bruno-Félix Osmanski y Mickael Tanter son cofundadores y accionistas de Iconeus.

Los métodos de imágenes cerebrales completas son herramientas cruciales para comprender mejor la fisiología y la patología del cerebro. El método descrito aquí permite la cuantificación precisa de las señales hemodinámicas en el cerebro vivo directamente en el banco. La sensibilidad inigualable y la resolución espacio-temporal del ultrasonido funcional son particularmente adecuadas para la fisiología del ratón. Las respuestas funcionales y las redes de estado de reposo se pueden mapear dentro de tiempos de adquisición cortos, longitudinalmente y sin tener que promediar ensayos o sujetos para obtener una medida confiable. La combinación relevante de sondas lineales ultrasónicas de alta sensibilidad y configuraciones motorizadas rápidas permite realizar imágenes volumétricas transcraneales de fUS en ratones dentro de tiempos de adquisición razonables. Este protocolo se puede realizar en ratones anestesiados o despiertos utilizando una jaula de casa móvil.
La estimulación del bigotes, el estímulo sensorial utilizado como ejemplo ilustrativo en este manuscrito, es un paradigma de activación funcional estándar en roedores y una lectura fiable para estudiar el procesamiento sensorial, el acoplamiento neurovascular y sus alteraciones5,6,10,11. Si bien el cepillado manual grueso de los bigotes puede ser preferido por su facilidad de uso, este método carece de precisión espacial y temporal. El uso de un estimulador automático, como el aquí descrito activado con el escáner de imágenes fUS, permite un mejor control de varios parámetros, incluido el momento de inicio, el desplazamiento de amplitud, la frecuencia y el ángulo de la punta Q / peine, lo que resulta en una mejor reproducibilidad inter-animal. Además, un momento más preciso de la estimulación permite el modelado de la Función de Respuesta Hemodinámica (FCR) mediante la determinación del tiempo hasta el inicio y el tiempo hasta el pico de los parámetros12,13. Para garantizar una mejor precisión en el número de bigotes desviados durante la estimulación (y por lo tanto en el área de la región activada), se pueden adaptar estimuladores más sofisticados a este protocolo. Muchos otros estímulos como la luz8,el sonido14 o la presentación del olor15 se pueden implementar utilizando el mismo protocolo.
La compatibilidad de la ecografía funcional con animales despiertos y de comportamiento es una ventaja importante en comparación con otras técnicas de neuroimagen, lo que permite el mapeo de activación funcional sin el sesgo de anestesia. El uso de una plataforma móvil con elevación neumétrica es una buena alternativa a otros aparatos fijos de cabeza existentes, como las cintas de correr lineales o esféricas. Mientras está firmemente fijo en la cabeza, el movimiento de la casa le da al ratón la ilusión de navegar por el entorno, lo que permite acoplar una amplia gama de pruebas de comportamiento a fUS imaging16. Sin embargo, el procedimiento de habituación a la fijación de la cabeza constituye un paso importante para disminuir el estrés, especialmente para experimentos donde puede considerarse un factor de confusión. El procedimiento detallado aquí (6 días de manipulación y habituación a la fijación de la cabeza) proporciona resultados sólidos para la estimulación sensorial y la conectividad funcional en estado de reposo. Sin embargo, podría ser necesario extender el período de habituación para pruebas de comportamiento más refinadas17.

En las últimas dos décadas, la neuroimagen se ha convertido en una herramienta importante para estudiar la función y la organización del cerebro, lo que permite a los investigadores hacer importantes descubrimientos en el campo de la neurociencia. Hoy en día, la resonancia magnética funcional (fMRI) se ha convertido en la técnica de neuroimagen clínica estándar de oro para evaluar la activación cerebral evocada por tareas o medicamentos y para mapear la conectividad funcional en reposo. Mientras que la resonancia magnética funcional humana tiene una alta confiabilidad y sensibilidad, la resonancia magnética funcional con ratones sigue siendo técnicamente desafiante por numerosas razones1. En primer lugar, la resonancia magnética funcional tiene una resolución espacial y temporal deficiente. El pequeño tamaño del cerebro del ratón requiere el uso de campos magnéticos fuertes utilizando escáneres costosos para lograr una resolución espacial razonable. En segundo lugar, mantener parámetros fisiológicos estables dentro del rango estrecho que permite un acoplamiento neurovascular eficiente es muy difícil en ratones anestesiados. Finalmente, la señal dependiente del nivel de oxígeno en la sangre (BOLD) en la que se basan los estudios de fMRI tiene una sensibilidad relativamente pobre, lo que lleva a una baja relación señal-ruido cuando se aplica a ratones y, a menudo, requiere una presentación de estímulo repetida durante una adquisición prolongada para detectar pequeñas variaciones. Siendo el ratón el modelo animal más utilizado en la investigación biomédica preclínica, estas limitaciones son en parte responsables de la brecha traslacional en la neuropsiquiatría, lo que dificulta la transposición de nuevas dianas terapéuticas prometedoras en el banco en tratamientos efectivos a pie de cama.
La ecografía funcional (fUS) es una técnica de neuroimagen desarrollada recientemente basada en doppler ultrarrápido2. Al muestrear directamente el volumen sanguíneo cerebral, esta técnica permite sondear la actividad cerebral en tiempo real a través del acoplamiento neurovascular. En comparación con otras técnicas de neuroimagen, fUS produce una resolución espacial de 100 μm y una resolución temporal en decenas de milisegundos. Esta técnica permite obtener imágenes de todo el cerebro de secciones coronales completas del cerebro del ratón, de forma completamente no invasiva. Además, es totalmente compatible con animales conscientes y de comportamiento3,4,5. Una de las principales limitaciones actuales de fUS es su característica 2D, que permite grabar un solo plano coronal al mismo tiempo. Si bien el fUS 3D volumétrico que utiliza transductores de matriz 2D ya se ha demostrado con éxito enratas 6 y se ha confirmado en ratones7,su falta actual de sensibilidad requiere una craneotomía completa, así como un promedio de un número importante de ensayos para detectar un ligero cambio de actividad. Alternativamente, los transductores lineales se pueden escalonar a través de múltiples posiciones y realizar imágenes funcionales plano por plano para cubrir todo el cerebro. Sin embargo, esta técnica requiere numerosas repeticiones de paradigmas experimentales y como tales largos tiempos de adquisición (3-4 horas para el cerebro delratón) 8,9.
En el presente trabajo, describimos una plataforma experimental robusta que incluye un ecógrafo funcional disponible comercialmente y un transductor lineal de conmutación rápida de plano con procedimientos para adquirir datos fUS 3D en ratones anestesiados y despiertos, lo que permite un mapeo funcional volumétrico y transcraneal del cerebro del ratón, de forma no invasiva, sin agente de contraste y en tiempos de adquisición cortos. Ilustramos esta característica mediante el mapeo de la activación de la corteza somatosensorial después de la estimulación del bigote, así como la conectividad funcional en estado de reposo. Además de la preparación animal y la recopilación de datos, también describimos el procedimiento para la visualización, el registro del atlas y el análisis de las señales fUS en tiempo real.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD Plastipak 1 mL syringes</td>
			<td>Dutscher, France</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 26 Gauge needles</td>
			<td>Dutscher, France</td>
			<td>303800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe)</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>TCAT-2DF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Arduino Uno-Rev3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole</td>
			<td>Orion Pharma, France</td>
			<td>Antisedan&#174;</td>
			<td>5 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Ciment</td>
			<td>Sun M&#233;dical, Shiga, japan</td>
			<td>Superbond C&#38;B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Klorane</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>TVM, UK</td>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair trimmer</td>
			<td>Wella Profesionnals</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head plates</td>
			<td>Neurotar, Finland</td>
			<td>Model 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iconeus One standard package for fUS</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>Iconeus One</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IcoScan acquisition software (v1.0)</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>IcoScan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IcoStudio analysis software (v1.0)</td>
			<td>Iconeus, France</td>
			<td>IcoStudio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthesia station</td>
			<td>Minerve, Esternay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Virbac, France</td>
			<td>Ketamine1000</td>
			<td>100 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>Lurocaine&#174;</td>
			<td>20 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma, France</td>
			<td>Domitor&#174;</td>
			<td>1 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Boehringer lingelheim</td>
			<td>Metacam&#174;</td>
			<td>0.5 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobile HomeCage Large with tracking capability</td>
			<td>Neurotar, Finland</td>
			<td>MHC-L-T-V4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitoring of ECG and breathing rate</td>
			<td>AD Systems, (USA) and LabChart software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servomotor</td>
			<td>Feetech</td>
			<td>FT90B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf (Tujunga, USA)</td>
			<td>900-WA</td>
			<td>Using Mouse Adaptor&#160; (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical glue</td>
			<td>3M, USA</td>
			<td>Vetbond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>KD Scientific, USA</td>
			<td>Legato&#174; 130, Cat# 788130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel</td>
			<td>DREXCO medical, France</td>
			<td>Medi&#39;Gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 2%</td>
			<td>Bayer, France</td>
			<td>Rompun&#174;</td>
			<td>20 mg/ml injectable solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-brain 3d activation and functional connectivity mapping in mice using transcranial functional ultrasound imaging

La ecografía funcional (fUS) es una nueva modalidad de imagen cerebral que se basa en la medida de alta sensibilidad del volumen sanguíneo cerebral lograda por la angiografía doppler ultrarrápida. Como la perfusión cerebral está fuertemente vinculada a la actividad neuronal local, esta técnica permite el mapeo 3D de todo el cerebro de la activación regional inducida por tareas, así como la conectividad funcional en estado de reposo, de forma no invasiva, con una resolución espacio-temporal inigualable y simplicidad operativa. En comparación con la resonancia magnética funcional (fMRI), una de las principales ventajas de las imágenes fUS consiste en permitir una compatibilidad completa con los experimentos con animales despiertos y que se comportan. Además, el mapeo cerebral de fMRI en ratones, el modelo preclínico más utilizado en Neurociencia, sigue siendo técnicamente desafiante debido al pequeño tamaño del cerebro y la dificultad para mantener condiciones fisiológicas estables. Aquí presentamos un protocolo simple, confiable y robusto para imágenes de fUS de todo el cerebro en ratones anestesiados y despiertos utilizando un sistema fUS comercial listo para usar con un transductor lineal motorizado, que produce una activación cortical significativa después de la estimulación sensorial, así como un patrón de conectividad funcional 3D reproducible para la identificación de la red.

Este protocolo describe la cuantificación 3D de las variaciones hemodinámicas cerebrales transcranialmente en el cerebro del ratón, en reposo o en respuesta a la estimulación sensorial. La estimulación de bigotes, un paradigma estándar para mapear la activación funcional cerebral en roedores, ha sido seleccionada como un ejemplo de respuesta evocada por estimulación sensorial. La Figura 4 muestra un mapa de activación representativo en respuesta a la estimulación mecánica de bigotes en un ratón anestesiado obtenido mediante imágenes transcraneales de fUS. El tiempo total de prueba fue de 760 s, con una línea de base de 60 s (antes y después de la estimulación), una estimulación de 80 s y un tiempo de recuperación de 60 s, repetido 5x. La activación significativa se determinó con la resolución de un modelo lineal general (GLM) utilizando una función de respuesta hemodinámica (HRF) de ratón predeterminada. Las regiones activadas (puntuaciones Z con valor p >0.0000006 después de una estricta corrección de Bonferroni para comparación múltiple) se muestran como valores codificados por colores superpuestos en la plantilla de marco de coordenadas común de Allen. El curso temporal de la corteza somatosensorial primaria contralateral, región de campo de barril (S1BF) reveló un aumento del 15-20% del CBV en comparación con la línea de base.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig4v2.jpg"> Figura 4: Activación transcraneal Mapas y curso de tiempo rCBV después de la estimulación de bigotes en ratones anestesiados con ketamina/xilazina. Un. Mapa de activación que muestra vóxeles significativamente activados después de la estimulación mecánica de los bigotes derechos (80 s ON, 60 s OFF, 5x) bajo anestesia con ketamina / xilazina. Los mapas se obtuvieron mediante el cálculo de puntuaciones Z basadas en el análisis de modelo lineal general (GLM) con corrección de Bonferroni para comparación múltiple. Las puntuaciones Z (codificadas por colores) se superponen en la plantilla Allen brain 3D (después del registro con el sistema de posicionamiento cerebral) y se muestran en tres vistas: coronal (izquierda), sagital (centro) y axial (derecha). Las regiones anatómicas del marco de coordenadas comunes del cerebro del ratón Allen se muestran como referencia. Los vóxeles activados están bien ubicados dentro de la corteza S1BF izquierda. Barra de escala: 1 mm. Cada volumen de muestra se escaneó en más de 2,8 mm (correspondiente a 7 cortes en la dirección de elevación) en 3,85 s, lo que permite registrar 20 muestras volumicas durante cada respuesta funcional. B. Representación 3D del aumento del volumen sanguíneo cerebral relativo (rCBV) evocado por la estimulación del bigote en comparación con el nivel basal. La delineación anatómica del S1BF se indica en azul. C. Curso de tiempo de las variaciones del CBV en el S1BF izquierdo (azul) y el estímulo correspondiente aplicado (rojo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El mismo paradigma se ha aplicado en un ratón de comportamiento fijo en la cabina móvil utilizando el preset despierto de IcoScan. La Figura 5 presenta el mapa de activación después de un experimento de estimulación de bigotes múltiples utilizando la configuración experimental descrita en la Figura 2. Se estimularon algunos bigotes posteriores y caudales con el siguiente patrón: 30 s basales seguidos de cinco ensayos consecutivos de 30 s ON (4 Hz) y 30 s OFF(Figura 5C). La estimulación se realizó utilizando un servomotor accionado por una tarjeta Arduino UNO que activa la secuencia de adquisición de imágenes para la sincronización. La activación significativa se determinó con la resolución de un modelo lineal general (GLM) utilizando una función de respuesta hemodinámica (HRF) de ratón predeterminada. La corrección de comparación múltiple se realizó con el método de Bonferroni. El nivel alfa convencional de 0,05 se normalizó por el número total de vóxeles en el volumen de adquisición, lo que resultó en un umbral estricto final de 0,000003.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig5v2.jpg"> Figura 5: Mapas de activación y curso de tiempo rCBV después de la estimulación de bigotes en ratones despiertos que se comportan. Un. Mapa de activación que muestra vóxeles significativamente activados después de la estimulación mecánica de los bigotes derechos (30 s ON, 30 s OFF, 5x) en un ratón despierto en la casa móvil. Los mapas se obtuvieron mediante el cálculo de puntuaciones Z basadas en el análisis de modelo lineal general (GLM) con corrección de Bonferroni para comparación múltiple (normalización por el número total de vóxeles). Las puntuaciones Z (codificadas por colores) se superponen en la plantilla 3D del cerebro de Allen (después del registro en el Sistema de Posicionamiento Cerebral) y se muestran en tres vistas: coronal (izquierda), sagital (centro) y axial (derecha). Las regiones anatómicas del Marco de Coordenadas Comunes del Cerebro de Ratón de Allen se muestran como referencia. Los vóxeles activados están bien ubicados dentro de la corteza S1BF izquierda. Barras de escamas, 1 mm. Cada volumen de muestra se escaneó a más de 1,6 mm (correspondiente a 3 cortes en la dirección de elevación) en 3,85 s, lo que permite registrar 17 muestras volumicas durante cada respuesta funcional. B. Representación 3D del aumento relativo del volumen sanguíneo cerebral (rCBV) evocado por la estimulación del bigote en comparación con el nivel basal. La delineación anatómica del S1BF se indica en azul. C. Ilustración del ratón en la casa móvil durante el experimento de estimulación del bigote derecho, durante el cual se realizaron cinco ensayos de 30 s para un tiempo total de adquisición de 330 s. D. Curso de tiempo cbV relativo instantáneo extraído dentro del área activada (azul), con el estímulo correspondiente superpuesto (rojo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La Figura 6 muestra las correlaciones temporales de las fluctuaciones espontáneas normalizadas de cbV de baja frecuencia (<0,2 Hz) entre las regiones cerebrales 3D (identificadas a partir del registro al marco de coordenadas comunes de Allen) en un ratón anestesiado con ketamina-xilazina. El tiempo total de adquisición fue de 20 min (1200 s). El análisis supervisado por Atlas reveló fuertes patrones de conectividad interhemisférica, con valores de coeficiente de correlación resultantes de hasta 0,8. El análisis basado en semillas en el hipocampo dorsal reveló una conectividad interhemisférica significativa entre el hipocampo derecho e izquierdo, así como las regiones retrohipocampales profundas y las cortezas piriformes. Una región de semilla seleccionada en el S1BF también resultó en un patrón de correlación simétrica (cortico-cortical), como se describió anteriormente.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62267/62267fig6v2.jpg"> Figura 6:Conectividad funcional transcraneal volumétrica en estado de reposo del cerebro del ratón bajo anestesia con ketamina/xilazina evaluada en una adquisición de fUS 3D de 20 min. Un. Matriz de correlación basada en regiones 3D del marco de coordenadas comunes de Allen registradas en la adquisición funcional transcraneal. La matriz se obtiene calculando la correlación normalizada de Pearson de fluctuaciones espontáneas de baja frecuencia (<0,1 Hz) de las señales de tiempo promedio de todos los vóxeles incluidos en cada ROI identificado después de la corrección de tiempo de corte. Cada volumen muestreado se escaneó sobre 1,6 mm en la dirección de elevación (correspondiente a 4 rebanadas) adquiridas sobre 2,2 s. B. Análisis basado en semillas proyectado en una plantilla 3D. La semilla se seleccionó dentro del hipocampo dorsal derecho a β - 2.1 mm. El mapa de correlación se obtiene calculando el coeficiente de correlación de Pearson entre las señales temporales de la semilla y cada vóxel de toda la adquisición después de la corrección de tiempo de corte. C. Mapa de correlación 3D basado en análisis basado en semillas con región de semilla seleccionada dentro del S1BF a β - 2.1 mm. Barras de escala: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62267/62267fig6v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging

Este protocolo describe la cuantificación de las variaciones hemodinámicas cerebrales volumétricas en el cerebro del ratón mediante ultrasonido funcional (fUS). Los procedimientos para el mapa de activación funcional 3D después de la estimulación sensorial, así como la conectividad funcional en estado de reposo se proporcionan como ejemplos ilustrativos, en ratones anestesiados y despiertos.

Activación 3D de todo el cerebro y mapeo de conectividad funcional en ratones utilizando imágenes de ultrasonido funcional transcraneal

Functional ultrasound (fUS) imaging is a novel brain imaging modality that relies on the high-sensitivity measure of the cerebral blood volume achieved by ...

La ecografía funcional es una nueva modalidad de neuroimagen que permite mapear el volumen sanguíneo cerebral en el cerebro de roedores vivos. Usando imágenes de ondas planas ultrarrápidas, podemos medir las respuestas hemodinámicas de todo el cerebro con una resolución y sensibilidad temporal especiales inigualables. Este protocolo explica cómo realizar imágenes de ultrasonido funcional transcraneal en ratones, tanto para experimentos con animales anestesiados como despiertos.En comparación con otras técnicas de imagen funcional de todo el cerebro, como la RMF, el ultrasonido funcional proporciona una alta portabilidad, facilidad de uso y permite experimentos en sujetos despiertos y que se mueven libremente, evitando el sesgo de anestesia y permitiendo estudios de comportamiento. Hasta hace poco, las imágenes FUS solo se utilizaba en colaboración con expertos en ultrasonido. Ahora, esta tecnología está disponible para la amplia comunidad de neurociencias, gracias a los escáneres disponibles comercialmente y el software dedicado para imágenes cerebrales preclínicas, lo que hace que FUS sea bastante fácil de usar sin ningún fondo en ultrasonido.Para una sesión de imágenes anestesiadas, aplique ungüento para los ojos del ratón para evitar cualquier daño corneal y afeite la cabeza del ratón con un temblor. Aplique un poco de crema depilatoria y enjuague después de un par de minutos. Repita esto hasta que el vello se elimine por completo.Inserte alfileres subcutáneos en las extremidades para el registro del electrocardiograma y coloque gel de ultrasonido centrifugado en la cabeza. Para los experimentos con ratones despiertos, se requiere una cirugía preliminar para la fijación de la cabeza. Coloque el ratón anestesiado y un marco estereotáctico sobre una almohadilla térmica de 37 grados centígrados.Aplique gel protector para los ojos y administre lidocaína por vía subcutánea debajo del cuero cabelludo con una aguja calibre 26, luego espere unos minutos. Haga una incisión después de la sutura sagital desde detrás del hueso occipital hasta el comienzo del hueso nasal, luego use tijeras quirúrgicas para extirpar la piel sobre ambos hemisferios. Limpie el cráneo con una solución de yodo al uno por ciento y retire el periostio restante.Usando la placa de la cabeza como plantilla, marque dos orificios en el cráneo para colocar los tornillos de anclaje. Coloque la placa de la cabeza con los tornillos y use cemento dental para fijar los tornillos y la placa de la cabeza en la parte delantera y posterior del marco para mantener un buen agarre del implante. Retire al animal del marco estereotáctico después de que el cemento esté seco y revierta la anestesia mediante inyección subcutánea de un miligramo por kilogramo de atipamezole.Administrar meloxicam profiláctico para el dolor postoperatorio. Coloque una tapa magnética impresa en 3D sobre la placa de la cabeza para protegerse y permita que el mouse se recupere durante cuatro a seis días antes del comienzo de la habituación a la jaula de la casa móvil. Coloque al animal en una jaula de recuperación en una almohadilla térmica durante unas horas, luego devuelva el ratón a su jaula de origen con compañeros de camada.En los días cuatro y cinco después de la recuperación, sujete repetidamente el mouse a la jaula de la casa móvil y aumente gradualmente el tiempo fijo de la cabeza, a partir de cinco minutos y hasta 30 minutos. Aplique un poco de solución salina y gel de ultrasonido en la ventana de imágenes para habituar al ratón. Repita este proceso en el sexto día después de la recuperación.Inicie el software y cree una sesión de experimento. Vaya al menú Mover sonda para ajustar la posición de la sonda de ultrasonido usando el teclado de navegación. Inicie la adquisición de vista en vivo y ajuste la posición de la sonda si es necesario a través de imágenes en tiempo real del volumen de sangre cerebral del animal, o CBV.Alinee el cerebro en el centro de la imagen y, a continuación, optimice los parámetros de imagen para capturar la mayor relación señal/ruido. Abra la opción Angio 3D del software de adquisición. En el panel preestablecido, ajuste los parámetros de escaneo de la primera rebanada, la última rebanada y el tamaño del paso para escanear todo el cerebro y comenzar la adquisición.Deje el software de adquisición abierto e inicie el software para el análisis y la visualización de datos, luego cargue el escaneo Angio 3D. Navegue por el volumen de adquisición utilizando el panel de tres vistas y seleccione la dirección de escaneo coronal, anteroposterior o postural anterior. Vaya al panel de registro cerebral y cargue la plantilla de referencia del mouse para el proceso de registro.Registre el escaneo en Allen Mouse Common Coordinates Framework utilizando los modos de registro totalmente automático o manual. Compruebe el resultado observando la superposición del escaneo Angio 3D y la plantilla de referencia, o mirando la superposición del escaneo y el Atlas de referencia de Allen utilizando el panel administrador de Atlas. Guarde el registro como un archivo BPS.En el software del estudio ICO, asegúrese de que la exploración angiográfica y su archivo BPS estén cargados. Vaya al panel de navegación cerebral. En el panel Atlas Manager, navegue por el ratón Allen Brain Atlas con el navegador de árbol padre hijo.Busque las regiones anatómicas específicas y selecciónelas para superponerlas al escaneo en las tres vistas. Visualice las regiones objetivo en el panel de tres vistas y elija un plano de imagen que se superponga a las regiones objetivo para el experimento estableciendo manualmente dos marcadores en la posición coronal que incluye la región de interés. Haga clic en Sistema de posicionamiento cerebral, o BPS, para extraer las coordenadas motoras resultantes que corresponden a la posición de la sonda para obtener una imagen del plano objetivo.Verifique la vista previa de la imagen que se calcula a partir de la angio exploración. En el software de escaneo ICO, ingrese al panel de posicionamiento de la sonda y haga clic en ingresar coordenadas BPS, luego aplique las coordenadas extraídas, haciendo que la sonda se mueva y se alinee en el plano de imagen objetivo. Realice una adquisición de vista en vivo y compruebe que el plano de imagen actual corresponde a la predicción.Predefina la secuencia de estimulación, incluido el tiempo de estimulación, el tiempo de estimulación del interés y el número de repeticiones. Ejecute una secuencia FUS 3D definiendo el tiempo total de adquisición, el número de posiciones y el tiempo muerto entre posiciones. Para la estimulación automática sincronizada con el sistema de adquisición a través de la entrada TTL, seleccione la opción trig in antes de iniciar la adquisición.Abra la adquisición en el software ICO studio e ingrese al menú del mapa de activación, luego complete el campo del patrón de activación con una hora de inicio y finalización y calcule el mapa de activación. Ajuste los parámetros de visualización para la visualización y exporte el mapa de activación como un archivo H5 para el análisis sin conexión. Ejecute una secuencia FUS 3D definiendo el tiempo total de adquisición, el número de posiciones del plano de imagen y el tiempo muerto entre posiciones.Guarde la adquisición y cárgándola en el software de estudio ICO. Si es necesario, cargue el archivo BPS y el marco de coordinación de Allen Mouse Brain. En el Administrador del Atlas, seleccione las regiones del Atlas como regiones de interés.Ingrese al menú de conductividad funcional y seleccione las regiones deseadas y el administrador de ROI. Visualice los resultados como matriz de conectividad o mapa de correlación basado en semillas, luego seleccione y ajuste los filtros de ancho de banda como desee y exporte los resultados de correlación para el análisis estadístico. Este protocolo se utilizó para la cuantificación 3D de las variaciones hemodinámicas cerebrales transcranialmente en el cerebro del ratón.La estimulación del bigote fue seleccionada como un ejemplo de estimulación sensorial de la respuesta evocada. La activación significativa se determinó con una resolución de un modelo lineal general, o GLM, utilizando la función de respuesta hemodinámica predeterminada del ratón. El tiempo total de prueba fue de 760 segundos, con una línea de base de 60 segundos, una estimulación de 80 segundos y un tiempo de recuperación de 60 segundos repetido cinco veces.Usando un curso de tiempo sabio de vóxel de la corteza somatosensorial primaria contralateral, la región del campo de barril, o S1BF, reveló un aumento del 15 al 20% del CBV en comparación con la línea de base. El mismo paradigma se aplicó en un ratón de comportamiento fijo de cabeza en la jaula de la casa móvil utilizando el preset despierto de ICO scan. El mapa de activación después de un experimento de estimulación de bigotes múltiples se muestra aquí.La activación significativa se determinó con la resolución de un GLM utilizando una función de respuesta hemodinámica predeterminada del ratón. Las correlaciones temporales han normalizado las fluctuaciones espontáneas de cbV de baja frecuencia entre las regiones cerebrales 3D en un ratón anestesiado con ketamina xilazina se muestran aquí. El análisis basado en semillas y el hipocampo dorsal revelaron la conductividad interhemisférica significativa entre el hipocampo derecho e izquierdo, así como regiones retro del hipocampo más profundas y cortesías piriformes.Una región de semilla seleccionada en el S1BF también dio como resultado un patrón de correlación simétrica. El punto crítico para experimentos exitosos es la preparación animal, en particular el nivel de anestesia para experimentos con animales anestesiados y la protección de un cráneo en experimentos en animales despiertos. Si US nos permitió estudiar funciones cerebrales importantes en animales despiertos que se ocupan de cuestiones fundamentales sobre el sueño, el aprendizaje o el comportamiento, pero también la modulación farmacológica de la conectividad funcional para el descubrimiento de fármacos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Mapeo funcional con MEG y EEG simultáneo

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Investigación

Neurociencias

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound (fTCD)

Assessment of Cerebral Lateralization in Children using Functional Transcranial Doppler Ultrasound fTCD

Evaluación de la lateralización cerebral en niños con ultrasonido Doppler transcraneal funcional (FTCD)

There are many unanswered questions about cerebral lateralization.  In particular, it remains unclear which aspects of language and nonverbal ability are ...

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Imagen de calcio funcionales en el desarrollo de redes corticales

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Grabación electrocorticográfica Humanos (ECoG) Las señales de la investigación neurocientífica y en tiempo real el mapeo cortical funcional

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Imágenes funcionales de la corteza auditiva en los gatos adultos el uso de alto campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Utilizando tomografía de coherencia óptica y respuesta Optokinetic como lecturas de sistema Visual estructural y funcional en ratones y ratas

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Realización de experimentos de Hyperscanning con funcional espectroscopia del infrarrojo cercano

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...