Name: toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

بدعم من معهد لوي للبحوث الطبية. نود أن نشكر عائلة لوي على دعمهم لمشروع MacTel. نود أن نشكر ماري جانتنر ومايك دوريل وليا شيبك على مساهمتهم الفكرية ومساعدتهم في إعداد المخطوطة.

1. إذابة وتمرير وتوسيع iPSCs / ESCs
ملاحظة: بالنسبة لجميع خطوات زراعة الخلايا ، استخدم أفضل الممارسات للحفاظ على مزرعة الخلايا المعقمة.
<ol><li>قم بتغطية لوحة استزراع الخلايا المكونة من 6 آبار بوسط مصفوفة غشاء القاعدة.<ol><li>لتحضير 1x من هذا الوسط ، اتبع مواصفات المنتج أو قم بتخفيف وسط ?...

<ol>
	<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development.">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li><li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down,+mice+are+not+just+small+humans.">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 39-44 (2005).</li><li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina.">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+retinal+development+and+disease+with+human+pluripotent+stem+cells.">Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).</li><li>Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+pathways+in+neurodegeneration,+from+genetics+to+mechanisms.">Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).</li><li>Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+estimates+of+macular+telangiectasia+type+2:+the+Melbourne+collaborative+cohort+study.">The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study.</a> Retina. 30 (3), 473-478 (2010).</li><li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+retinal+neurodegeneration+in+patients+with+macular+telangiectasia+type+2:+A+randomized+clinical+trial.">Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial.</a> Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).</li><li>Gass, J. D., Blodi, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study.">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li><li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study.">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Muller's+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2.">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li><li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy.">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li><li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2.">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li><li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway.">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li><li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients:+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy.">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li><li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields.">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).</li></ol>

اختلافات بروتوكول التمايز منذ اختراع الأكواب البصرية ذاتية التكوين من قبل مجموعة YoshikiSasai 20 ، طورت العديد من المختبرات بروتوكولات لتوليد عضويات شبكية يمكن أن تختلف في كل خطوة تقريبا5،18،19،21. يمكن ...

قدمت نمذجة الأمراض البشرية في زراعة الخلايا والنماذج الحيوانية أدوات لا تقدر بثمن لاكتشاف وتعديل والتحقق من صحة العلاجات الدوائية ، مما يسمح لها بالتقدم من دواء مرشح إلى علاج معتمد. على الرغم من أن الجمع بين النماذج في المختبر وغير البشرية في الجسم الحي كان منذ فترة طويلة مكونا حاسما في خط أنابيب تطوير الأدوية ، إلا أنها تفشل في كثير من الأحيان في التنبؤ بالأداء السريري للأدوية المرشحة الجديدة1. هناك حاجة واضحة لتطوير التقنيات التي تسد الفجوة بين الزراعات الأحادية الخلوية البشرية المبسطة والتجارب السريرية. أدت التطورات التكنولوجية الحديثة في مزارع الأنسجة ثلاثية الأبعاد ذاتية التنظيم ، العضوية ، إلى تحسين دقتها للأنسجة التي تضعها في نمذجتها مما يجعلها أدوات واعدة في خط أنابيب تطوير الأدوية قبل السريرية2.
الميزة الرئيسية لزراعة الخلايا البشرية على النماذج غير البشرية في الجسم الحي هي القدرة على تكرار التعقيدات المحددة لعملية التمثيل الغذائي البشري والتي يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا حتى بين الفقاريات ذات الترتيب الأعلى مثل البشر والفئران3. ومع ذلك ، يمكن أن تطغى على هذه الخصوصية فقدان في تعقيد الأنسجة. هذا هو الحال بالنسبة لأنسجة الشبكية حيث تتشابك أنواع متعددة من الخلايا بشكل معقد ولها تفاعل استقلابي تكافلي فريد بين الأنواع الفرعية الخلوية التي لا يمكن تكرارها في الزراعة الأحادية4. الكائنات العضوية البشرية ، التي توفر نسخة طبق الأصل من الأنسجة البشرية المعقدة مع إمكانية الوصول إلى زراعة الخلايا وقابليتها للتوسع ، لديها القدرة على التغلب على أوجه القصور في منصات نمذجة الأمراض هذه.
أثبتت عضويات الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية أنها مخلصة بشكل خاص في نمذجة الأنسجة المعقدة للشبكية العصبية البشرية5. وقد جعل هذا النموذج العضوي للشبكية تقنية واعدة لدراسة وعلاج أمراض الشبكية 6,7. حتى الآن ، ركزت الكثير من نمذجة المرض في عضويات الشبكية على أمراض الشبكية أحادية المنشأ حيث يتم اشتقاق عضويات الشبكية من خطوط iPSC مع المتغيرات الجينية المسببة للأمراض7. هذه بشكل عام طفرات عالية الاختراق تظهر كأنماط ظاهرية تنموية. تم القيام بعمل أقل بشكل فعال على أمراض الشيخوخة حيث تؤثر الطفرات الجينية والضغوطات البيئية على الأنسجة التي تطورت بشكل طبيعي. يمكن أن يكون للأمراض التنكسية العصبية للشيخوخة وراثة جينية معقدة ومساهمات من الضغوطات البيئية التي يصعب بنمذجتها بطبيعتها باستخدام مزارع الخلايا قصيرة الأجل. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، يمكن أن تتجمع هذه الأمراض المعقدة على الضغوطات الخلوية أو الأيضية الشائعة التي ، عند اختبارها على أنسجة بشرية متطورة بالكامل ، يمكن أن توفر رؤى قوية للأمراض التنكسية العصبية للشيخوخة8.
يعد المرض التنكسي البقعي المتأخر ، توسع الشعيرات البقعي من النوع الثاني (MacTel) ، مثالا رائعا على مرض تنكسي عصبي معقد وراثيا يتجمع على عيب استقلابي شائع. MacTel هو مرض تنكسي غير شائع في شبكية العين يؤدي إلى فقدان مستقبلات الضوء ومولر الدبقية في البقعة ، مما يؤدي إلى فقدان تدريجي في الرؤية المركزية9،10،11،12،13. في MacTel ، يؤدي الوراثة الجينية غير المحددة ، وربما متعددة العوامل ، إلى انخفاض شائع في سيرين الدورة الدموية في المرضى ، مما يؤدي إلى زيادة في أنواع الدهون السمية العصبية تسمى deoxysphingolipids (deoxySL) 14,15. لإثبات أن تراكم deoxySL سام لشبكية العين وللتحقق من صحة العلاجات الصيدلانية المحتملة ، قمنا بتطوير هذا البروتوكول لفحص سمية المستقبلات الضوئية في عضويات شبكية العين البشرية14.
نحدد هنا بروتوكولا محددا للتمييز بين عضويات الشبكية البشرية ، وإنشاء مقايسة السمية والإنقاذ باستخدام المواد العضوية ، وتحديد النتائج. نحن نقدم مثالا ناجحا حيث نحدد السمية الخاصة بالأنسجة لعامل مسبب للمرض المشتبه به ، deoxySL ، ونتحقق من صحة استخدام دواء عام آمن ، fenofibrate ، للعلاج المحتمل لسمية الشبكية التي يسببها deoxySL. أظهرت الأعمال السابقة أن فينوفايبرات يمكن أن يزيد من تدهور deoxySL وانخفاض deoxySL المنتشر في المرضى ، ومع ذلك ، لم يتم اختبار فعاليته في الحد من سمية الشبكية التي يسببها deoxySL16,17. على الرغم من أننا نقدم مثالا محددا ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم تأثير أي عدد من الضغوطات الأيضية / البيئية والأدوية العلاجية المحتملة على أنسجة الشبكية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125mL Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-deoxysphinganine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver 6900 Mini-Blade</td>
			<td>Beaver-Visitec</td>
			<td>BEAVER6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>A32794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, Heat Inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45001-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenofibrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Recoverin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Plus- O.C.T. compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>62534-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield-mounting medium</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wax pen-ImmEdge</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery

توفر المواد العضوية منصة واعدة لدراسة آلية المرض والعلاجات ، مباشرة في سياق الأنسجة البشرية مع براعة وإنتاجية زراعة الخلايا. تستخدم عضويات الشبكية البشرية الناضجة لفحص العلاجات الصيدلانية المحتملة لمرض توسع الشعيرات البقعي المرتبط بالعمر من النوع 2 (MacTel).
لقد أظهرنا مؤخرا أن MacTel يمكن أن يكون ناتجا عن مستويات مرتفعة من أنواع الدهون غير النمطية ، deoxysphingolipids (deoxySLs). هذه الدهون سامة لشبكية العين وقد تؤدي إلى فقدان مستقبلات الضوء التي تحدث في مرضى MacTel. لفحص الأدوية لقدرتها على منع سمية مستقبلات الضوء deoxySL ، قمنا بتوليد عضويات شبكية بشرية من خط الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) غير المستحث من MacTel ونضجها إلى عصر ما بعد الانقسام حيث يطورون جميع الخلايا المشتقة من السلالة العصبية في شبكية العين ، بما في ذلك المستقبلات الضوئية الناضجة وظيفيا. تمت معالجة عضويات الشبكية بمستقلب deoxySL وتم قياس موت الخلايا المبرمج داخل طبقة المستقبلات الضوئية باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية. باستخدام نموذج السمية هذا ، تم فحص المركبات الدوائية التي تمنع موت المستقبلات الضوئية الناجم عن deoxySL. باستخدام نهج مرشح مستهدف ، قررنا أن فينوفايبرات ، وهو دواء يوصف عادة لعلاج ارتفاع الكوليسترول والدهون الثلاثية ، يمكن أن يمنع أيضا سمية deoxySL في خلايا شبكية العين.
نجح فحص السمية في تحديد دواء معتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية يمكنه منع موت المستقبلات الضوئية. هذه نتيجة قابلة للتنفيذ بشكل مباشر بسبب النموذج ذي الصلة بالمرض الذي تم اختباره. يمكن تعديل هذه المنصة بسهولة لاختبار أي عدد من الضغوطات الأيضية والتدخلات الدوائية المحتملة لاكتشاف العلاج في المستقبل في أمراض الشبكية.

تم إنشاء عضويات الشبكية من خط iPSC غير تحكم MacTel. بعد أن وصلت المواد العضوية إلى 26 أسبوعا في الثقافة ، تم اختيارها وتقسيمها إلى مجموعات تجريبية. تمت معالجة المواد العضوية بتركيزات متفاوتة من deoxySA لتحديد ما إذا كان deoxySA ساما للمستقبلات الضوئية. تم اختبار أربعة تركيزات من deoxySA ، من 0 إلى 1 ميكرومتر...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

نقدم هنا بروتوكولا خطوة بخطوة لتوليد عضويات شبكية بشرية ناضجة واستخدامها في مقايسة سمية مستقبلات ضوئية لتحديد الأدوية المرشحة لمرض توسع الشعيرات البقعي المرتبط بالعمر من النوع 2 (MacTel).

شاشات السمية في عضويات شبكية العين البشرية لاكتشاف الأدوية

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

يوفر هذا البروتوكول نهجا قبل السريري لاكتشاف والتحقق من صحة العلاجات الصيدلانية لأمراض الشبكية الأيضية مباشرة داخل أنسجة الشبكية البشرية. تجمع هذه التقنية بين تعقيد عملية التمثيل الغذائي في الأنسجة البشرية مع براعة وإنتاجية زراعة الخلايا. لقد استخدمنا هذا الاختبار للحصول على بيانات ما قبل السريرية لعلاج مرض تنكس الشبكية ، MacTel ، باستخدام دواء شائع وآمن لتغيير الدهون ، fenofibrate ، والذي هو الآن في تجارب السلامة السريرية.يمكن تطبيق هذا النهج على أي عدد من ضغوط الشبكية الشائعة التي تؤدي إلى المرض بما في ذلك نقص المغذيات ونقص الأكسجة والسمية الضوئية والدهون السامة الأخرى. في الأسبوع 24 من الثقافة ، تحقق من المواد العضوية لتشكيل شرائح بدائية على السطح الخارجي للعضوي. بحلول الأسبوع 26 إلى 28 ، يجب أن تكون الأجزاء الخارجية قد شكلت طبقة سميكة.عندما يمكن ملاحظة جزء متشكك سميك ، قم بتخفيف محلول مخزون deoxySA واحد بالمليمولار إلى 0.51. واحد واثنين من تركيزات ميكرومولار في ثلاثة ملليلتر من وسط تمايز الشبكية زائد. باستخدام مجهر تشريح ومسبار معقم ، حدد أربع مجموعات من المواد العضوية من نفس الحجم والشكل تقريبا مع ما لا يقل عن خمسة عضويات لكل مجموعة ، وقم بتقسيم المجموعات إلى آبار فردية من صفيحة 6 آبار منخفضة للغاية.عندما يتم جمع جميع المواد العضوية ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط من كل بئر وأضف تركيزا واحدا من محلول deoxySA إلى كل بئر. أضف التحكم في السيارة إلى المجموعة الرابعة من المواد العضوية. بعد يومين من المزرعة ، استبدل طاف الاستزراع ب deoxySA الطازج المناسب أو تخفيف التحكم.بعد أربعة أيام من المزرعة ، قم بتضمين قسم التبريد وصبغ الكائنات العضوية وفقا للبروتوكولات القياسية للسماح بتقييم موت الخلايا داخل كل مزرعة. بعد التلوين ، استخدم تكبيرا من خمسة إلى 10 أضعاف لتحديد منطقة من قسم العضوي المقطع السليم والتكوين الجيد وفي مستوى يأخذ عينات من مقطع عرضي تمثيلي للعضوي. يجب أن يحتوي القسم على طبقة نووية خارجية مميزة من المستقبلات الضوئية التي لا يقل سمكها عن بضع خلايا ، وطبقة منفصلة ومميزة من النوى التي لا تحتوي على تعافي وتلطيخ.ضع إطارا للصورة وقم بزيادة التكبير إلى 20x. ثم قم بتأطير الشريحة مرة أخرى لملء الصورة بأكبر قدر ممكن من طبقة مستقبلات الضوء. اضبط المستوى Z واضبط الحدود السفلية للطرف العلوي للنطاق Z لتصوير عمق الشريحة بالكامل.ثم قم بتصوير جميع قنوات الفلوروفور الثلاث في عملية استحواذ على Z-stack ، واحفظ الصورة بتنسيق ملف يحافظ على نسبة المساحة لكل بكسل. لتحديد عدد الخلايا الميتة في كل عينة ، افتح مكدسات الصور في فيجي. في نافذة خيارات استيراد التنسيق الحيوي ، تأكد من عدم تحديد أي مربعات ضمن قسم الانقسام إلى نوافذ منفصلة وحدد مشروع الصورة والمكدسات و Z لإنشاء صورة جديدة للقياس الكمي.حدد قناة الصورة التي تعرض الاسترداد والتلوين واستخدم أداة تحديد المضلع لتحديد منطقة متصلة من المستقبلات الضوئية في الصورة. انقر فوق تحليل وتعيين القياسات وحدد مربع المنطقة. انقر فوق تحليل وقياس ، لقياس مساحة المستقبلات الضوئية ، لحساب الخلايا المحتضرة.سيظهر القياس في نافذة منبثقة. لحساب النوى الإيجابية لموت الخلايا المبرمج في منطقة مستقبلات الضوء المحددة ، انقر بزر الماوس الأيمن على أداة النقطة لتحديد الأداة متعددة النقاط وتحديد تلطيخ موت الخلايا المبرمج الإيجابي الذي يتداخل مع نوى DAPI الموجبة والتعافي والتلطيخ. قم بالتبديل بين القنوات للتحقق من صحة الخلايا الإيجابية.ثم قسم عدد الخلايا الإيجابية لموت الخلايا المبرمج على المنطقة للحصول على قيمة طبيعية لموت الخلايا داخل المستقبلات الضوئية لكل عضوي. بعد تحديد تركيز deoxySA الذي يحفز موت الخلية المستهدفة ، استخدم مسبارا معقما لاختيار ثلاث مجموعات من الكائنات العضوية من نفس الحجم والشكل تقريبا بحد أدنى خمسة عضويات لكل مجموعة. وأضف المجموعات إلى الآبار الفردية للوحة 6 آبار منخفضة للغاية.أضف تركيز موت الخلية المستهدفة ل deoxySA ، تركيز موت الخلية المستهدفة ل deoxySA المكمل بالدواء محل الاهتمام أو وسيط التحكم إلى البئر أو المواد العضوية المناسبة. بعد يومين ، استبدل المادة الطافية في كل بئر بالتركيز المناسب للمعالجة الطازجة أو وسط التحكم. بعد أربعة أيام من الثقافة ، قم بتقييم الثقافات لموت الخلايا كما هو موضح.في هذا التحليل التمثيلي ، عولجت عضويات الشبكية المتولدة من خط الخلايا الجذعية متعددة القدرات الناجم عن توسع الشعيرات غير البقعي من النوع 2 بأربعة تركيزات من deoxySA. كان موت الخلايا استجابة ل deoxySA يعتمد على التركيز ويمكن اكتشافه في أقل من 50 deoxySA نانومولار. أدى أعلى تركيز تم اختباره إلى موت قوي للخلايا مع الحفاظ على سلامة العضو العضوي في شبكية العين.منع العلاج ب 20 ميكرومولار فينوفايبرات السمية التي يسببها deoxySA في مستقبلات الصورة لعضويات الشبكية ، مما قلل بشكل كبير من موت الخلايا بنسبة 80٪ تقريبا بعد أربعة أيام من العلاج. تذكر أن تختار عضويات جيدة التكوين وصحية لضمان إجراء الفحص في خلايا الشبكية. يمكن معالجة المواد العضوية لجمع الحمض النووي الريبي لتحديد التعبير الجيني ، مما يسمح بتقييم إشارات الإجهاد والتحقق من الآثار السامة وعمليات الإنقاذ.باستخدام هذه التقنية ، تمكنا من فحص التمثيل الغذائي النهائي للعديد من الدهون المختلفة في المواد العضوية ، مما فتح دراسة استقلاب الدهون في شبكية العين البشرية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

الفلورسنت النانوية لقياس تركيز ايون في النظم البيولوجية

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT : منبرا الآلي لاكتشاف انزيم الكتلة الحيوية والتحسين كوكتيل

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

تسليم الجينات والخلايا البشرية في ترنسفكأيشن سرطان البنكرياس باستخدام مستقبلات عامل نمو البشرة استهداف الجيلاتين المستندة Nanovectors المهندسة

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

[ميكروأرس] البوليمر لاكتشاف إنتاجية عالية من المواد الحيوية

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

بروتين منخفض الوزن الجزيئي تخصيب اليورانيوم على أفلام السيليكا Mesoporous رقيقة لاكتشاف العلامات البيولوجية

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

عزل الخلايا العقدة الشبكية الفئران الأولية (رغس) عن طريق التدفق الخلوي

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

فاسكولاريزيد بيوبرينتينج موائع جزيئية لهندسة الأنسجة وأورجانويدس

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

لوسيفر الأصفر - علامة نفاذية شبه خلوية قوية في نموذج خلية من حاجز الدم في الدماغ البشري

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...