Name: toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

Støttet af Lowy Medical Research Institute. Vi vil gerne takke Lowy-familien for deres støtte til MacTel-projektet. Vi vil gerne takke Mari Gantner, Mike Dorrell og Lea Scheppke for deres intellektuelle input og hjælp til at udarbejde manuskriptet.

1. Optøning, gennemtøning og udvidelse af iPSC'er/ESC'er
BEMÆRK: For alle celledyrkningstrin skal du bruge bedste praksis til at opretholde en steril cellekultur.
<ol><li>Overtræk en 6-brønds cellekulturplade med kældermembranmatrixmedium.<ol><li>For at klargøre 1x af dette medium skal du følge produktspecifikationerne eller fortynde 75 μL koldmatrixsubstrat med 9 ml DMEM/F12. Tilsæt 1,5 ml frisklavet 1x medium pr. brønd i en plade med 6 huller. Der inkuberes ved 37 °C i 30 minut...

<ol>
	<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development.">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li><li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down,+mice+are+not+just+small+humans.">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 39-44 (2005).</li><li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina.">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+retinal+development+and+disease+with+human+pluripotent+stem+cells.">Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).</li><li>Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+pathways+in+neurodegeneration,+from+genetics+to+mechanisms.">Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).</li><li>Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+estimates+of+macular+telangiectasia+type+2:+the+Melbourne+collaborative+cohort+study.">The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study.</a> Retina. 30 (3), 473-478 (2010).</li><li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+retinal+neurodegeneration+in+patients+with+macular+telangiectasia+type+2:+A+randomized+clinical+trial.">Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial.</a> Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).</li><li>Gass, J. D., Blodi, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study.">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li><li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study.">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Muller's+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2.">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li><li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy.">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li><li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2.">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li><li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway.">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li><li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients:+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy.">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li><li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields.">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).</li></ol>

Variationer i differentieringsprotokol Siden opfindelsen af selvdannende optiske kopper af Yoshiki Sasais gruppe20 har mange laboratorier udviklet protokoller til generering af retinale organoider, der kan variere ved næsten hvert trin 5,18,19,21. En udtømmende liste over protokoller findes i Capowski et al.22. Den differenti...

Modellering af menneskelig sygdom i cellekultur og dyremodeller har givet uvurderlige værktøjer til opdagelse, modifikation og validering af farmakologisk terapi, så de kan gå videre fra kandidatlægemiddel til godkendt behandling. Selv om en kombination af in vitro- og ikke-humane in vivo-modeller længe har været en kritisk komponent i lægemiddeludviklingspipelinen, undlader de ofte at forudsige den kliniske ydeevne af nye lægemiddelkandidater1. Der er et klart behov for udvikling af teknologier, der bygger bro mellem forenklede humane cellulære monokulturer og kliniske forsøg. Nylige teknologiske fremskridt inden for selvorganiserede tredimensionelle vævskulturer, organoider, har forbedret deres troskab til de væv, de modellerer, hvilket gør dem lovende værktøjer i den prækliniske lægemiddeludviklingspipeline2.
En stor fordel ved human cellekultur i forhold til ikke-menneskelige in vivo-modeller er evnen til at replikere de specifikke forviklinger i menneskelig metabolisme, som kan variere betydeligt selv mellem hvirveldyr af højere orden som mennesker og mus3. Denne specificitet kan imidlertid overskygges af et tab i vævskompleksitet; Dette er tilfældet for nethindevæv, hvor flere celletyper er indviklet sammenvævet og har et unikt symbiotisk metabolisk samspil mellem cellulære undertyper, der ikke kan replikeres i en monokultur4. Humane organoider, som giver en faksimile af komplekse humane væv med tilgængelighed og skalerbarhed af cellekultur, har potentialet til at overvinde manglerne ved disse sygdomsmodelleringsplatforme.
Retinale organoider afledt af stamceller har vist sig at være særligt trofaste i modellering af det komplekse væv i den menneskelige neurale nethinden5. Dette har gjort retinal organoidmodellen til en lovende teknologi til undersøgelse og behandling af retinal sygdom 6,7. Hidtil har meget af sygdomsmodelleringen i retinale organoider fokuseret på monogene nethindesygdomme, hvor retinale organoider stammer fra iPSC-linjer med sygdomsfremkaldende genetiske varianter7. Disse er generelt meget penetrerende mutationer, der manifesterer sig som udviklingsfænotyper. Mindre arbejde er blevet effektivt gjort på aldrende sygdomme, hvor genetiske mutationer og miljømæssige stressfaktorer påvirker væv, der har udviklet sig normalt. Neurodegenerative aldringssygdomme kan have kompleks genetisk arv og bidrag fra miljømæssige stressfaktorer, der i sagens natur er vanskelige at modellere ved hjælp af kortvarige cellekulturer. Imidlertid kan disse komplekse sygdomme i mange tilfælde samles på almindelige cellulære eller metaboliske stressfaktorer, der, når de testes på et fuldt udviklet humant væv, kan give kraftig indsigt i neurodegenerative aldringssygdomme8.
Den sent indsættende makuladegenerative sygdom, makula telangiectasia type II (MacTel), er et godt eksempel på en genetisk kompleks neurodegenerativ sygdom, der samler sig på en fælles metabolisk defekt. MacTel er en usædvanlig retinal degenerativ aldringssygdom, der resulterer i fotoreceptor og Müller glia tab i makulaen, hvilket fører til et progressivt tab i centralt syn 9,10,11,12,13. I MacTel driver en ubestemt, muligvis multifaktoriel, genetisk arv en almindelig reduktion i cirkulerende serin hos patienter, hvilket resulterer i en stigning i en neurotoksisk lipidart kaldet deoxysphingolipider (deoxySL)14,15. For at bevise, at akkumulering af deoxySL er giftigt for nethinden og for at validere potentielle farmaceutiske behandlinger, udviklede vi denne protokol til at analysere fotoreceptortoksicitet i humane retinale organoider14.
Her skitserer vi en specifik protokol til differentiering af humane retinale organoider, etablering af et toksicitets- og redningsassay ved hjælp af organoider og kvantificering af resultater. Vi giver et vellykket eksempel, hvor vi bestemmer den vævsspecifikke toksicitet af et mistænkt sygdomsfremkaldende middel, deoxySL, og validerer brugen af et sikkert generisk lægemiddel, fenofibrat, til potentiel behandling af deoxySL-induceret retinal toksicitet. Tidligere arbejde har vist, at fenofibrat kan øge nedbrydningen af deoxySL og lavere cirkulerende deoxySL hos patienter, men dets effektivitet til reduktion af deoxySL-induceret retinal toksicitet er ikke blevet testet16,17. Selvom vi præsenterer et specifikt eksempel, kan denne protokol bruges til at evaluere effekten af et vilkårligt antal metaboliske / miljømæssige stressorer og potentielle terapeutiske lægemidler på nethindevæv.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125mL Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-deoxysphinganine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver 6900 Mini-Blade</td>
			<td>Beaver-Visitec</td>
			<td>BEAVER6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>A32794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, Heat Inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45001-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenofibrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Recoverin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Plus- O.C.T. compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>62534-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield-mounting medium</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wax pen-ImmEdge</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery

Organoider giver en lovende platform til at studere sygdomsmekanismer og behandlinger direkte i forbindelse med humant væv med alsidighed og gennemstrømning af cellekultur. Modne humane retinale organoider bruges til at screene potentielle farmaceutiske behandlinger for den aldersrelaterede retinale degenerative sygdom makulær telangiectasia type 2 (MacTel).
Vi har for nylig vist, at MacTel kan være forårsaget af forhøjede niveauer af en atypisk lipidart, deoxysphingolipider (deoxySL'er). Disse lipider er giftige for nethinden og kan drive fotoreceptortabet, der opstår hos MacTel-patienter. For at screene lægemidler for deres evne til at forhindre deoxySL-fotoreceptortoksicitet genererede vi humane retinale organoider fra en ikke-MacTel-induceret pluripotent stamcellelinje (iPSC) og modnede dem til en postmitotisk alder, hvor de udvikler alle de neuronale afstamningsafledte celler i nethinden, herunder funktionelt modne fotoreceptorer. De retinale organoider blev behandlet med en deoxySL-metabolit, og apoptose blev målt inden for fotoreceptorlaget ved hjælp af immunhistokemi. Ved hjælp af denne toksicitetsmodel blev farmakologiske forbindelser, der forhindrer deoxySL-induceret fotoreceptordød, screenet. Ved hjælp af en målrettet kandidattilgang fastslog vi, at fenofibrat, et lægemiddel, der almindeligvis ordineres til behandling af højt kolesteroltal og triglycerider, også kan forhindre deoxySL-toksicitet i cellerne i nethinden.
Toksicitetsskærmen identificerede med succes et FDA-godkendt lægemiddel, der kan forhindre fotoreceptordød. Dette er et direkte handlingsmæssigt fund på grund af den meget sygdomsrelevante model, der testes. Denne platform kan let ændres til at teste et vilkårligt antal metaboliske stressorer og potentielle farmakologiske indgreb til fremtidig behandlingsopdagelse i nethindesygdomme.

Retinale organoider blev genereret fra en ikke-MacTel kontrol iPSC-linje. Efter organoider nåede 26 uger i kultur, blev de udvalgt og opdelt i eksperimentelle grupper. Organoider blev behandlet med varierende koncentrationer af deoxySA for at afgøre, om deoxySA er toksisk for fotoreceptorer. Fire koncentrationer af deoxySA blev testet, fra 0 til 1 μM (figur 2), og organoider blev behandlet i 8 dage med medieskift hver anden dag. Celledød som reaktion på deoxySA er koncentrationsafhængi...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Her præsenterer vi en trinvis protokol til generering af modne humane retinale organoider og udnytter dem i et fotoreceptortoksicitetsassay for at identificere farmaceutiske kandidater til den aldersrelaterede retinale degenerative sygdom makulær telangiectasia type 2 (MacTel).

Toksicitetsskærme i humane retinale organoider til farmaceutisk opdagelse

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Denne protokol giver en præklinisk tilgang til at opdage og validere farmaceutiske behandlinger for de metaboliske retinale sygdomme direkte i humant nethindevæv. Denne teknik kombinerer kompleksiteten af metabolisme i humane væv med alsidigheden og gennemstrømningen af cellekultur. Vi har brugt dette assay til at indsamle prækliniske data til behandling af den retinale degenerative sygdom, MacTel, ved hjælp af et almindeligt og sikkert lipidændrende lægemiddel, fenofibrat, som nu er i kliniske sikkerhedsforsøg.Denne tilgang kan anvendes på et vilkårligt antal almindelige retinale stressorer, der fører til sygdom, herunder næringsstofmangel, hypoxi, lystoksicitet og andre giftige lipider. I uge 24 af kulturen skal du kontrollere organoiderne for dannelse af rudimentære segmenter på ydersiden af organoiden. I uge 26 til 28 skulle de ydre segmenter have dannet et tykt lag.Når et fortykket tvivlersegment kan observeres, fortyndes en millimolær deoxySA-stamopløsning til 0,51. En og to mikromolære koncentrationer i tre ml retinal differentieringsmedium plus. Ved hjælp af et dissektionsmikroskop og en steril sonde vælges fire grupper af organoider af omtrent samme størrelse og form med mindst fem organoider pr. Gruppe, og opdel grupperne i individuelle brønde med en ultra-lav vedhæftningsplade med 6 brønde.Når alle organoiderne er blevet opsamlet, fjernes så meget medium fra hvert hul som muligt, og der tilsættes en koncentration af deoxySA-opløsningen til hvert hul. Tilføj køretøjsstyringen til den fjerde gruppe af organoider. Efter to dages dyrkning erstattes kultursupernatanterne med passende frisk deoxySA eller kontrolfortynding.Efter fire dages dyrkning skal du integrere kryosektion og plette organoiderne i henhold til standardprotokoller for at muliggøre vurdering af celledød inden for hver kultur. Efter farvning skal du bruge en fem til 10x forstørrelse til at lokalisere et område af den skivede organoidsektion, der er intakt, velformet og i et plan, der prøver et repræsentativt tværsnit af organoiden. Sektionen skal have et særskilt ydre nukleart lag af fotoreceptorer, der er mindst et par celler tykke, og et separat og tydeligt lag af kerner, der ikke har genopretning og farvning.Indram billedet, og øg forstørrelsen til 20x. Indram derefter lysbilledet igen for at udfylde billedet med så meget af fotoreceptorlaget som muligt. Indstil Z-planet, og indstil den øvre ende nedre grænser for Z-området for at afbilde hele dybden af udsnittet.Afbild derefter alle tre kanaler af fluorofor i en Z-stack-erhvervelse, og gem billedet i et filformat, der bevarer forholdet mellem areal pr. pixel. Hvis du vil kvantificere antallet af døde celler i hver prøve, skal du åbne billedstablerne på Fiji. I bioformatets vindue med importindstillinger skal du bekræfte, at ingen felter under afsnittet opdelt i separate vinduer er markeret, og vælge Billede, stakke og Z-projekt for at oprette et nyt billede til kvantificering.Vælg den billedkanal, der viser gendannelse og farvning, og brug polygonmarkeringsværktøjet til at skitsere et kontinuerligt område af fotoreceptorer i billedet. Klik på Analysér og indstil målinger, og vælg feltet Område. Klik på Analysér og mål for at måle fotoreceptorernes areal for at tælle de døende celler.Målingen vises i et pop op-vindue. For at tælle de apoptosepositive kerner i det valgte fotoreceptorområde skal du højreklikke på punktværktøjet for at vælge multipunktværktøjet og vælge den apoptosepositive farvning, der overlapper med en DAPI-positiv kerne og gendanne og farve. Skift mellem kanalerne for at validere de positive celler.Derefter divideres antallet af apoptosepositive celler med området for at opnå en normaliseret værdi for celledød inden for fotoreceptorerne pr. Organoid. Efter bestemmelse af deoxySA-koncentrationen, der inducerer målcelledød, skal du bruge en steril sonde til at vælge tre grupper af organoider af omtrent samme størrelse og form med mindst fem organoider pr. Gruppe. Og tilføj grupperne til individuelle brønde i en 6-brøndplade med ultralav fastgørelse.DeoxySA's målcelledødskoncentration, målcelledødskoncentrationen af deoxySA suppleret med det pågældende lægemiddel eller kontrolmediet tilsættes til den relevante brønd eller organoider. Efter to dage erstattes supernatanten i hvert hul med en passende koncentration af frisk behandling eller kontrolmedium. Efter fire dages kultur skal du vurdere kulturerne for celledød som demonstreret.I denne repræsentative analyse blev retinale organoider genereret fra en ikke-makula telangiectasia type 2 kontrolinduceret pluripotent stamcellelinje behandlet med fire koncentrationer af deoxySA. Celledød som reaktion på deoxySA var koncentrationsafhængig og påviselig i så lidt som 50 nanomolære deoxySA. Den højeste testede koncentration inducerede en robust celledød, mens den stadig opretholdt integriteten af retinal organoid.Behandling med 20 mikromolært fenofibrat forhindrede deoxySA-induceret toksicitet i fotoreceptorerne hos retinale organoider, hvilket signifikant reducerede celledød med ca. 80% efter fire dages behandling. Husk at vælge velformede og sunde organoider for at sikre, at analysen udføres i retinale celler. Organoiderne kan behandles til RNA-indsamling for at kvantificere genekspression, hvilket muliggør evaluering af stresssignaler og validering af toksiske virkninger og redninger.Ved hjælp af denne teknik har vi været i stand til at analysere nedstrøms metabolisme af flere forskellige lipider i organoider, hvilket åbner undersøgelsen af lipidmetabolisme i menneskelige nethinder.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: En automatiseret platform for biomasse Enzyme Discovery og Cocktail optimering

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Levering og transfektion i Human bugspytkirtelkræftceller hjælp epidermal vækstfaktor receptor-målrettede Gelatine-baseret Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Lav Molekylær Vægt Protein berigelse mesoporøse silica Tynde Film til biomarkør Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolering af primære murin retinalganglionceller (RGC&#39;er) ved flowcytometri

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrofluid Bioprinting for Engineering vaskulariserede væv og Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Undertrykke gen transskription ved at omdirigere cellulære maskiner med kemiske epigenetiske modifikatorer

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer Yellow-en robust Paracellulær permeabilitet markør i en celle model af humant blod-hjerne barrieren

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...