Name: toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

Ondersteund door het Lowy Medical Research Institute. We willen de familie Lowy bedanken voor hun steun aan het MacTel-project. We willen Mari Gantner, Mike Dorrell en Lea Scheppke bedanken voor hun intellectuele inbreng en hulp bij het voorbereiden van het manuscript.

1. Ontdooien, passeren en uitbreiden van iPSC's / SER's
OPMERKING: Gebruik voor alle celkweekstappen best practices om een steriele celcultuur te behouden.
<ol><li>Bedek een 6-well celkweekplaat met keldermembraanmatrixmedium.<ol><li>Om 1x van dit medium te bereiden, volgt u de productspecificaties of verdunt u 75 μL koudmatrixmedium met 9 ml DMEM/F12. Voeg 1,5 ml vers bereid 1x medium per putje toe in een 6-well plaat. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.</li>
		<li>Zuig het keldermembraa...

<ol>
	<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development.">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li><li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down,+mice+are+not+just+small+humans.">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 39-44 (2005).</li><li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina.">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+retinal+development+and+disease+with+human+pluripotent+stem+cells.">Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).</li><li>Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+pathways+in+neurodegeneration,+from+genetics+to+mechanisms.">Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).</li><li>Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+estimates+of+macular+telangiectasia+type+2:+the+Melbourne+collaborative+cohort+study.">The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study.</a> Retina. 30 (3), 473-478 (2010).</li><li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+retinal+neurodegeneration+in+patients+with+macular+telangiectasia+type+2:+A+randomized+clinical+trial.">Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial.</a> Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).</li><li>Gass, J. D., Blodi, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study.">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li><li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study.">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Muller's+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2.">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li><li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy.">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li><li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2.">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li><li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway.">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li><li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients:+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy.">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li><li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields.">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).</li></ol>

Differentiatieprotocolvariaties Sinds de uitvinding van zelfvormende optische cups door Yoshiki Sasai's groep20, hebben veel laboratoria protocollen ontwikkeld om retinale organoïden te genereren die kunnen variëren bij bijna elke stap 5,18,19,21. Een uitputtende lijst van protocollen is te vinden in Capowski et al.22. Het di...

Het modelleren van menselijke ziekten in celkweek en diermodellen heeft waardevolle hulpmiddelen opgeleverd voor de ontdekking, wijziging en validatie van farmacologische therapieën, waardoor ze van kandidaat-geneesmiddel naar goedgekeurde therapie kunnen gaan. Hoewel een combinatie van in vitro en niet-menselijke in vivo modellen al lang een cruciaal onderdeel is van de pijplijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, slagen ze er vaak niet in om de klinische prestaties van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen te voorspellen1. Er is een duidelijke behoefte aan de ontwikkeling van technologieën die de kloof overbruggen tussen simplistische menselijke cellulaire monoculturen en klinische proeven. Recente technologische vooruitgang in zelfgeorganiseerde driedimensionale weefselculturen, organoïden, hebben hun trouw aan de weefsels die ze modelleren verbeterd, waardoor ze veelbelovende hulpmiddelen zijn in de pijplijn voor de ontwikkeling van preklinische geneesmiddelen2.
Een groot voordeel van menselijke celkweek ten opzichte van niet-menselijke in vivo modellen is het vermogen om de specifieke fijne kneepjes van het menselijk metabolisme te repliceren, die aanzienlijk kunnen variëren, zelfs tussen gewervelde dieren van hogere orde zoals mensen en muizen3. Deze specificiteit kan echter worden overschaduwd door een verlies aan weefselcomplexiteit; Dit is het geval voor netvliesweefsel waar meerdere celtypen ingewikkeld met elkaar verweven zijn en een uniek symbiotisch metabolisch samenspel hebben tussen cellulaire subtypen die niet kunnen worden gerepliceerd in een monocultuur4. Menselijke organoïden, die een facsimile van complexe menselijke weefsels bieden met de toegankelijkheid en schaalbaarheid van celkweek, hebben het potentieel om de tekortkomingen van deze ziektemodelleringsplatforms te overwinnen.
Retinale organoïden afgeleid van stamcellen hebben bewezen bijzonder trouw te zijn in het modelleren van het complexe weefsel van het menselijke neurale netvlies5. Dit heeft het retinale organoïde model tot een veelbelovende technologie gemaakt voor de studie en behandeling van netvliesaandoeningen 6,7. Tot op heden heeft veel van de ziektemodellering in retinale organoïden zich gericht op monogene retinale ziekten waarbij retinale organoïden zijn afgeleid van iPSC-lijnen met ziekteverwekkende genetische varianten7. Dit zijn over het algemeen zeer penetrante mutaties die zich manifesteren als ontwikkelingsfenotypen. Er is minder effectief gewerkt aan verouderingsziekten waarbij genetische mutaties en omgevingsstressoren van invloed zijn op weefsel dat zich normaal heeft ontwikkeld. Neurodegeneratieve verouderingsziekten kunnen complexe genetische overerving en bijdragen van omgevingsstressoren hebben die inherent moeilijk te modelleren zijn met behulp van kortdurende celculturen. In veel gevallen kunnen deze complexe ziekten echter samensmelten op gemeenschappelijke cellulaire of metabole stressoren die, wanneer getest op een volledig ontwikkeld menselijk weefsel, krachtige inzichten kunnen bieden in neurodegeneratieve ziekten van veroudering8.
De maculaire degeneratieve ziekte met late aanvang, macula teleangiëctasieën type II (MacTel), is een goed voorbeeld van een genetisch complexe neurodegeneratieve ziekte die samensmelt op een gemeenschappelijk metabolisch defect. MacTel is een zeldzame retinale degeneratieve ziekte van veroudering die resulteert in fotoreceptor en Müller glia verlies in de macula, wat leidt tot een progressief verlies in het centrale zicht 9,10,11,12,13. In MacTel zorgt een onbepaalde, mogelijk multifactoriële, genetische overerving voor een gemeenschappelijke vermindering van circulerende serine bij patiënten, wat resulteert in een toename van een neurotoxische lipidesoort genaamd deoxysfingolipiden (deoxySL)14,15. Om te bewijzen dat accumulatie van deoxySL giftig is voor het netvlies en om potentiële farmaceutische therapieën te valideren, hebben we dit protocol ontwikkeld om fotoreceptortoxiciteit in menselijke retinale organoïden te testen14.
Hier schetsen we een specifiek protocol voor het differentiëren van menselijke retinale organoïden, het vaststellen van een toxiciteits- en reddingstest met behulp van organoïden en het kwantificeren van uitkomsten. We geven een succesvol voorbeeld waarbij we de weefselspecifieke toxiciteit van een vermoedelijk ziekteverwekkend middel, deoxySL, bepalen en het gebruik van een veilig generiek medicijn, fenofibraat, valideren voor de mogelijke behandeling van deoxySL-geïnduceerde retinale toxiciteit. Eerder werk heeft aangetoond dat fenofibraat de afbraak van deoxySL kan verhogen en de circulerende deoxySL bij patiënten kan verlagen, maar de werkzaamheid ervan bij het verminderen van deoxySL-geïnduceerde retinale toxiciteit is niet getest16,17. Hoewel we een specifiek voorbeeld presenteren, kan dit protocol worden gebruikt om het effect van een aantal metabole / omgevingsstressoren en potentiële therapeutische geneesmiddelen op netvliesweefsel te evalueren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125mL Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-deoxysphinganine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver 6900 Mini-Blade</td>
			<td>Beaver-Visitec</td>
			<td>BEAVER6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>A32794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, Heat Inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45001-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenofibrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Recoverin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Plus- O.C.T. compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>62534-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield-mounting medium</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wax pen-ImmEdge</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery

Organoïden bieden een veelbelovend platform om ziektemechanismen en behandelingen te bestuderen, direct in de context van menselijk weefsel met de veelzijdigheid en doorvoer van celkweek. Volwassen menselijke retinale organoïden worden gebruikt om potentiële farmaceutische behandelingen te screenen voor de leeftijdsgebonden retinale degeneratieve ziekte macula teleangiëctasieën type 2 (MacTel).
We hebben onlangs aangetoond dat MacTel kan worden veroorzaakt door verhoogde niveaus van een atypische lipidesoort, deoxysphingolipiden (deoxySLs). Deze lipiden zijn giftig voor het netvlies en kunnen het verlies van fotoreceptoren veroorzaken dat optreedt bij MacTel-patiënten. Om geneesmiddelen te screenen op hun vermogen om deoxySL-fotoreceptortoxiciteit te voorkomen, genereerden we menselijke retinale organoïden uit een niet-MacTel-geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) -lijn en rijpten ze tot een post-mitotische leeftijd waar ze alle neuronale afstammingscellen van het netvlies ontwikkelen, inclusief functioneel volwassen fotoreceptoren. De retinale organoïden werden behandeld met een deoxySL-metaboliet en apoptose werd gemeten in de fotoreceptorlaag met behulp van immunohistochemie. Met behulp van dit toxiciteitsmodel werden farmacologische verbindingen die deoxySL-geïnduceerde fotoreceptordood voorkomen, gescreend. Met behulp van een gerichte kandidaatbenadering hebben we vastgesteld dat fenofibraat, een medicijn dat vaak wordt voorgeschreven voor de behandeling van hoog cholesterol en triglyceriden, ook deoxySL-toxiciteit in de cellen van het netvlies kan voorkomen.
Het toxiciteitsscherm identificeerde met succes een door de FDA goedgekeurd medicijn dat fotoreceptordood kan voorkomen. Dit is een direct bruikbare bevinding vanwege het zeer ziekterelevante model dat is getest. Dit platform kan eenvoudig worden aangepast om een willekeurig aantal metabole stressoren en potentiële farmacologische interventies te testen voor toekomstige behandelingsontdekking bij netvliesaandoeningen.

Retinale organoïden werden gegenereerd uit een niet-MacTel-controle-iPSC-lijn. Nadat organoïden 26 weken in cultuur waren geweest, werden ze geselecteerd en opgesplitst in experimentele groepen. Organoïden werden behandeld met verschillende concentraties deoxySA om te bepalen of deoxySA giftig is voor fotoreceptoren. Vier concentraties deoxySA werden getest, van 0 tot 1 μM (figuur 2) en organoïden werden gedurende 8 dagen behandeld, met mediaveranderingen om de andere dag. Celdood als r...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol om volwassen menselijke retinale organoïden te genereren en deze te gebruiken in een fotoreceptortoxiciteitstest om farmaceutische kandidaten te identificeren voor de leeftijdsgebonden retinale degeneratieve ziekte maculaire teleangiëctasieën type 2 (MacTel).

Toxiciteitsscreenings in humane retinale organoïden voor farmaceutische ontdekking

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Dit protocol biedt een preklinische benadering voor het ontdekken en valideren van farmaceutische behandelingen voor de metabole retinale ziekten direct in menselijk netvliesweefsel. Deze techniek combineert de complexiteit van het metabolisme in menselijke weefsels met de veelzijdigheid en doorvoer van celkweek. We hebben deze test gebruikt om preklinische gegevens te verkrijgen voor de behandeling van de retinale degeneratieve ziekte, MacTel, met behulp van een gemeenschappelijk en veilig lipidenveranderend medicijn, fenofibraat, dat nu in klinische veiligheidsonderzoeken is.Deze aanpak kan worden toegepast op een aantal veel voorkomende retinale stressoren die leiden tot ziekte, waaronder tekort aan voedingsstoffen, hypoxie, lichttoxiciteit en andere toxische lipiden. Controleer in week 24 van de kweek de organoïden op de vorming van rudimentaire segmenten aan de buitenkant van de organoïde. In week 26 tot en met 28 moeten de buitenste segmenten een dikke laag hebben gevormd.Wanneer een verdikt twijfelersegment kan worden waargenomen, verdunt u één millimolaire deoxySA-stamoplossing tot 0,51. Eén en twee micromolaire concentraties in drie milliliter retinale differentiatiemedium plus. Selecteer met behulp van een dissectiemicroscoop en een steriele sonde vier groepen organoïden van ongeveer dezelfde grootte en vorm met een minimum van vijf organoïden per groep en splits de groepen in individuele putten van een ultralage aanhechtingsplaat met 6 putten.Wanneer alle organoïden zijn verzameld, verwijdert u zoveel mogelijk medium uit elk putje en voegt u één concentratie van de deoxySA-oplossing toe aan elk putje. Voeg de voertuigbesturing toe aan de vierde groep organoïden. Vervang na twee dagen kweek de kweeksupernatanten door de juiste verse deoxySA of controleverdunning.Na vier dagen kweek, sluit cryosectie in en kleurt de organoïden volgens standaardprotocollen om de celdood binnen elke cultuur te kunnen beoordelen. Gebruik na het kleuren een vergroting van vijf tot 10x om een gebied van het gesneden organoïde gedeelte te lokaliseren dat intact, goed gevormd en in een vlak is dat een representatieve doorsnede van de organoïde bemonstert. De sectie moet een duidelijke buitenste nucleaire laag van fotoreceptoren hebben die ten minste een paar cellen dik is, en een afzonderlijke en afzonderlijke laag kernen die geen herstel en kleuring hebben.Kader de afbeelding in en verhoog de vergroting tot 20x. Kader de dia vervolgens opnieuw in om de afbeelding te vullen met zoveel mogelijk van de fotoreceptorlaag. Stel het Z-vlak in en stel de bovenste ondergrenzen van het Z-bereik in om de volledige diepte van het segment weer te geven.Maak vervolgens een afbeelding van alle drie de kanalen van fluorofoor in een Z-stack-acquisitie en sla de afbeelding op in een bestandsindeling die de verhouding van het gebied per pixel behoudt. Als u het aantal dode cellen in elk monster wilt kwantificeren, opent u de afbeeldingsstapels in Fiji. Controleer in het venster met importopties van de bio-indeling of er geen vakjes onder de sectie opsplitsing in afzonderlijke vensters zijn aangevinkt en selecteer Afbeelding, Stapels en Z-project om een nieuwe afbeelding voor kwantificering te maken.Selecteer het afbeeldingskanaal dat het herstel en de kleuring weergeeft en gebruik het gereedschap voor het selecteren van veelhoeken om een continu gebied van fotoreceptoren in de afbeelding te schetsen. Klik op Metingen analyseren en instellen en selecteer het vak Gebied. Klik op Analyseren en meten om het gebied van de fotoreceptoren te meten om de stervende cellen te tellen.De meting verschijnt in een pop-upvenster. Om de apoptosepositieve kernen in het geselecteerde fotoreceptorgebied te tellen, klikt u met de rechtermuisknop op het puntgereedschap om het meerpuntgereedschap te selecteren en selecteert u de apoptosepositieve kleuring die overlapt met een DAPI-positieve kernen en herstelt en kleurt. Schakel tussen de kanalen om de positieve cellen te valideren.Deel vervolgens het aantal apoptosepositieve cellen door het gebied om een genormaliseerde waarde voor de celdood binnen de fotoreceptoren per organoïde te verkrijgen. Na het bepalen van de deoxySA-concentratie die de doelceldood induceert, gebruikt u een steriele sonde om drie groepen organoïden van ongeveer dezelfde grootte en vorm te selecteren met een minimum van vijf organoïden per groep. En voeg de groepen toe aan individuele putten van een ultralage bevestiging 6-putplaat.Voeg de doelceldoodconcentratie van deoxySA, de doelceldoodconcentratie van deoxySA aangevuld met het geneesmiddel van belang of het controlemedium toe aan de juiste put of organoïden. Vervang na twee dagen het supernatant in elk putje door de juiste concentratie van verse behandeling of controlemedium. Beoordeel na vier dagen kweek de culturen op celdood zoals aangetoond.In deze representatieve analyse werden retinale organoïden gegenereerd uit een niet-maculaire teleangiëctasieën type 2 controle geïnduceerde pluripotente stamcellijn behandeld met vier concentraties deoxySA. Celdood als reactie op deoxySA was concentratieafhankelijk en detecteerbaar in slechts 50 nanomolaire deoxySA. De hoogste geteste concentratie veroorzaakte een robuuste celdood met behoud van de integriteit van de retinale organoïde.Behandeling met 20 micromolair fenofibraat voorkwam deoxySA-geïnduceerde toxiciteit in de fotoreceptoren van retinale organoïden, waardoor de celdood na vier dagen behandeling aanzienlijk met ongeveer 80% werd verminderd. Vergeet niet om goed gevormde en gezonde organoïden te selecteren om ervoor te zorgen dat de test wordt uitgevoerd in retinale cellen. De organoïden kunnen worden verwerkt voor RNA-verzameling om genexpressie te kwantificeren, waardoor de evaluatie van stresssignalen en de validatie van toxische effecten en reddingen mogelijk is.Met behulp van deze techniek hebben we het downstream-metabolisme van meerdere verschillende lipiden in organoïden kunnen testen, waardoor de studie van lipidenmetabolisme in menselijke netvliezen is geopend.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Fluorescerende Nanodeeltjes voor het meten van Ion Concentratie in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: een geautomatiseerd platform voor biomassa Enzym Discovery en Cocktail Optimalisatie

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Levering en Transfectie in Human alvleesklierkankercellen met epidermale groeifactor receptor-gerichte Gelatine-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Laag moleculair gewicht eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor de ontdekking van biomarkers

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC&#39;s) door Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer geel-een robuuste Paracellulaire permeabiliteit marker in een Celmodel van de menselijke bloed-hersen barrière

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...