Name: toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00
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Unterstützt vom Lowy Medical Research Institute. Wir bedanken uns bei der Familie Lowy für die Unterstützung des MacTel-Projekts. Wir danken Mari Gantner, Mike Dorrell und Lea Scheppke für ihren intellektuellen Input und ihre Unterstützung bei der Erstellung des Manuskripts.

1. Auftauen, Durchlässigkeit und Expansion von iPS-Zellen/ES-Zellen
HINWEIS: Verwenden Sie für alle Zellkultivierungsschritte Best Practices, um eine sterile Zellkultur zu erhalten.
<ol><li>Beschichten Sie eine 6-Well-Zellkulturplatte mit Basalmembranmatrixmedium.<ol><li>Um 1x dieses Mediums herzustellen, befolgen Sie die Produktspezifikationen oder verdünnen Sie 75 μl Kaltmatrixmedium mit 9 mL DMEM/F12. 1,5 ml frisch zubereitetes 1x Medium pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte geben. Bei...

<ol>
	<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Muller's+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2.">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li><li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy.">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li><li>Scerri, T. 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K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields.">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).</li></ol>

Variationen des Differenzierungsprotokolls Seit der Erfindung selbstformender optischer Becher durch Yoshiki Sasais Gruppe20 haben viele Labore Protokolle entwickelt, um Netzhautorganoide zu erzeugen, die bei fast jedem Schritt variieren können 5,18,19,21. Eine vollständige Liste der Protokolle findet sich in Capowski et al.22</sup...

Die Modellierung menschlicher Krankheiten in Zellkultur- und Tiermodellen hat unschätzbare Werkzeuge für die Entdeckung, Modifikation und Validierung pharmakologischer Therapeutika geliefert, die es ihnen ermöglichen, vom Wirkstoffkandidaten zur zugelassenen Therapie zu gelangen. Obwohl eine Kombination von In-vitro- und nicht-humanen In-vivo-Modellen seit langem ein wichtiger Bestandteil der Arzneimittelentwicklungspipeline ist, können sie häufig nicht die klinische Leistung neuartiger Arzneimittelkandidaten vorhersagen1. Es besteht ein klarer Bedarf an der Entwicklung von Technologien, die die Lücke zwischen vereinfachenden humanzellulären Monokulturen und klinischen Studien schließen. Jüngste technologische Fortschritte bei selbstorganisierten dreidimensionalen Gewebekulturen, Organoiden, haben ihre Treue zu den von ihnen modellierten Geweben verbessert, was sie zu vielversprechenden Werkzeugen in der präklinischen Arzneimittelentwicklungspipelinemacht 2.
Ein großer Vorteil der menschlichen Zellkultur gegenüber nicht-menschlichen In-vivo-Modellen ist die Fähigkeit, die spezifischen Feinheiten des menschlichen Stoffwechsels zu replizieren, die selbst zwischen Wirbeltieren höherer Ordnung wie Menschen und Mäusen erheblich variieren können3. Diese Spezifität kann jedoch durch einen Verlust der Gewebekomplexität überschattet werden; Dies ist der Fall bei Netzhautgewebe, wo mehrere Zelltypen kompliziert miteinander verwoben sind und ein einzigartiges symbiotisches metabolisches Zusammenspiel zwischen zellulären Subtypen aufweisen, das in einer Monokultur nicht repliziert werdenkann 4. Humane Organoide, die ein Faksimile komplexer menschlicher Gewebe mit der Zugänglichkeit und Skalierbarkeit von Zellkulturen liefern, haben das Potenzial, die Mängel dieser Krankheitsmodellierungsplattformen zu überwinden.
Aus Stammzellen gewonnene Netzhautorganoide haben sich bei der Modellierung des komplexen Gewebes der menschlichen neuralen Netzhaut als besonders zuverlässig erwiesen5. Dies hat das retinale Organoidmodell zu einer vielversprechenden Technologie für die Erforschung und Behandlung von Netzhauterkrankungen gemacht 6,7. Bisher konzentrierte sich ein Großteil der Krankheitsmodellierung in Netzhautorganoiden auf monogene Netzhauterkrankungen, bei denen Netzhautorganoide von iPS-Zelllinien mit krankheitsverursachenden genetischen Varianten abgeleitet werden7. Dies sind im Allgemeinen hochpenetrante Mutationen, die sich als Entwicklungsphänotypen manifestieren. Weniger Arbeit wurde effektiv an alternden Krankheiten durchgeführt, bei denen genetische Mutationen und Umweltstressoren sich auf Gewebe auswirken, das sich normal entwickelt hat. Neurodegenerative Erkrankungen des Alterns können eine komplexe genetische Vererbung und Beiträge von Umweltstressoren haben, die mit Kurzzeitzellkulturen von Natur aus schwer zu modellieren sind. In vielen Fällen können diese komplexen Krankheiten jedoch auf gemeinsamen zellulären oder metabolischen Stressoren zusammentreffen, die, wenn sie an einem voll entwickelten menschlichen Gewebe getestet werden, aussagekräftige Einblicke in neurodegenerative Erkrankungen des Alterns liefern können8.
Die spät einsetzende degenerative Makulaerkrankung, Makulateleangiektasien Typ II (MacTel), ist ein gutes Beispiel für eine genetisch komplexe neurodegenerative Erkrankung, die auf einem gemeinsamen Stoffwechseldefekt beruht. MacTel ist eine seltene degenerative Erkrankung des Alterns der Netzhaut, die zu einem Verlust des Photorezeptors und der Müller-Glia in der Makula führt, was zu einem fortschreitenden Verlust des zentralen Sehens führt9,10,11,12,13. Bei MacTel führt eine unbestimmte, möglicherweise multifaktorielle genetische Vererbung zu einer häufigen Verringerung des zirkulierenden Serins bei Patienten, was zu einem Anstieg einer neurotoxischen Lipidspezies namens Desoxysphingolipide (DesoxySL) führt14,15. Um zu beweisen, dass die Akkumulation von DesoxySL für die Netzhaut toxisch ist, und um potenzielle pharmazeutische Therapeutika zu validieren, haben wir dieses Protokoll entwickelt, um die Photorezeptor-Toxizität in menschlichen Netzhautorganoiden zu untersuchen14.
Hier skizzieren wir ein spezifisches Protokoll zur Differenzierung menschlicher Netzhautorganoide, zur Etablierung eines Toxizitäts- und Rettungstests unter Verwendung von Organoiden und zur Quantifizierung der Ergebnisse. Wir liefern ein erfolgreiches Beispiel, in dem wir die gewebespezifische Toxizität eines vermuteten krankheitserregenden Wirkstoffs, DesoxySL, bestimmen und die Verwendung eines sicheren Generikums, Fenofibrat, für die potenzielle Behandlung der DesoxySL-induzierten Netzhauttoxizität validieren. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Fenofibrat den Abbau von DesoxySL erhöhen und das zirkulierende DesoxySL bei Patienten senken kann, seine Wirksamkeit bei der Verringerung der DesoxySL-induzierten Netzhauttoxizität wurde jedoch nicht getestet16,17. Obwohl wir ein konkretes Beispiel präsentieren, kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Wirkung einer beliebigen Anzahl von metabolischen/umweltbedingten Stressoren und potenziellen therapeutischen Medikamenten auf das Netzhautgewebe zu bewerten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125mL Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-deoxysphinganine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver 6900 Mini-Blade</td>
			<td>Beaver-Visitec</td>
			<td>BEAVER6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>A32794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, Heat Inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45001-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenofibrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Recoverin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Plus- O.C.T. compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>62534-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield-mounting medium</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wax pen-ImmEdge</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery

Organoide bieten eine vielversprechende Plattform, um Krankheitsmechanismen und Behandlungen direkt im Kontext von menschlichem Gewebe mit der Vielseitigkeit und dem Durchsatz von Zellkulturen zu untersuchen. Reife humane Netzhautorganoide werden verwendet, um potenzielle pharmazeutische Behandlungen für die altersbedingte retinale degenerative Erkrankung Makulateleangiektasien Typ 2 (MacTel) zu untersuchen.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass MacTel durch erhöhte Konzentrationen einer atypischen Lipidspezies, der Desoxysphingolipide (DesoxySLs), verursacht werden kann. Diese Lipide sind toxisch für die Netzhaut und können den Photorezeptorverlust verursachen, der bei MacTel-Patienten auftritt. Um Medikamente auf ihre Fähigkeit zu untersuchen, die Toxizität von DesoxySL-Photorezeptoren zu verhindern, erzeugten wir humane Netzhautorganoide aus einer nicht-MacTel-induzierten pluripotenten Stammzelllinie (iPSC) und reiften sie bis zu einem postmitotischen Alter, in dem sie alle von der neuronalen Linie abgeleiteten Zellen der Netzhaut entwickeln, einschließlich funktionell reifer Photorezeptoren. Die retinalen Organoide wurden mit einem DesoxySL-Metaboliten behandelt und die Apoptose innerhalb der Photorezeptorschicht mittels Immunhistochemie gemessen. Unter Verwendung dieses Toxizitätsmodells wurden pharmakologische Verbindungen, die den DesoxySL-induzierten Photorezeptortod verhindern, untersucht. Mit einem gezielten Kandidatenansatz stellten wir fest, dass Fenofibrat, ein Medikament, das üblicherweise zur Behandlung von hohem Cholesterinspiegel und Triglyceriden verschrieben wird, auch die DesoxySL-Toxizität in den Zellen der Netzhaut verhindern kann.
Das Toxizitäts-Screening identifizierte erfolgreich ein von der FDA zugelassenes Medikament, das den Tod von Photorezeptoren verhindern kann. Dies ist aufgrund des getesteten hochgradig krankheitsrelevanten Modells ein direkt umsetzbarer Befund. Diese Plattform kann leicht modifiziert werden, um eine beliebige Anzahl von metabolischen Stressoren und potenziellen pharmakologischen Interventionen für die zukünftige Behandlungsforschung bei Netzhauterkrankungen zu testen.

Retinale Organoide wurden aus einer Nicht-MacTel-Kontroll-iPSC-Linie erzeugt. Nachdem die Organoide 26 Wochen in Kultur erreicht hatten, wurden sie ausgewählt und in Versuchsgruppen aufgeteilt. Organoide wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von DesoxySA behandelt, um festzustellen, ob DesoxySA für Photorezeptoren toxisch ist. Es wurden vier Konzentrationen von DesoxySA von 0 bis 1 μM getestet (Abbildung 2) und Organoide wurden 8 Tage lang behandelt, wobei die Medien jeden zweiten ...

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Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, um reife menschliche Netzhautorganoide zu erzeugen und sie in einem Photorezeptor-Toxizitätstest zu verwenden, um pharmazeutische Kandidaten für die altersbedingte retinale degenerative Erkrankung Makulateleangiektasien Typ 2 (MacTel) zu identifizieren.

Toxizitätsscreens in humanen Netzhautorganoiden für die pharmazeutische Forschung

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Dieses Protokoll bietet einen präklinischen Ansatz zur Entdeckung und Validierung pharmazeutischer Behandlungen für metabolische Netzhauterkrankungen direkt im menschlichen Netzhautgewebe. Diese Technik kombiniert die Komplexität des Stoffwechsels in menschlichem Gewebe mit der Vielseitigkeit und dem Durchsatz von Zellkulturen. Wir haben diesen Assay verwendet, um präklinische Daten für die Behandlung der degenerativen Netzhauterkrankung MacTel unter Verwendung eines gängigen und sicheren lipidverändernden Medikaments, Fenofibrat, zu erhalten, das sich derzeit in klinischen Sicherheitsstudien befindet.Dieser Ansatz kann auf eine beliebige Anzahl von häufigen retinalen Stressoren angewendet werden, die zu Krankheiten führen, einschließlich Nährstoffmangel, Hypoxie, Lichttoxizität und anderen toxischen Lipiden. Überprüfen Sie in der 24. Kulturwoche die Organoide auf die Bildung rudimentärer Segmente an der Außenseite des Organoids. In den Wochen 26 bis 28 sollten die äußeren Segmente eine dicke Schicht gebildet haben.Wenn ein verdicktes Zweiflersegment beobachtet werden kann, verdünnen Sie eine millimolare DesoxySA-Stammlösung auf 0,51. Ein- und zwei mikromolare Konzentrationen in drei Millilitern retinalem Differenzierungsmedium plus. Wählen Sie mit einem Dissektionsmikroskop und einer sterilen Sonde vier Gruppen von Organoiden von ungefähr gleicher Größe und Form mit mindestens fünf Organoiden pro Gruppe aus und teilen Sie die Gruppen in einzelne Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit extrem niedriger Befestigung auf.Wenn alle Organoide gesammelt wurden, entfernen Sie so viel Medium wie möglich aus jeder Vertiefung und geben Sie eine Konzentration der DesoxySA-Lösung in jede Vertiefung. Fügen Sie die Fahrzeugkontrolle zur vierten Gruppe von Organoiden hinzu. Ersetzen Sie nach zwei Tagen Kultur die Kulturüberstände durch die entsprechende frische DesoxySA- oder Kontrollverdünnung.Nach viertägiger Kultur wird der Kryoschnitt eingebettet und die Organoide gemäß den Standardprotokollen gefärbt, um die Beurteilung des Zelltods in jeder Kultur zu ermöglichen. Verwenden Sie nach dem Färben eine fünf- bis 10-fache Vergrößerung, um einen Bereich des geschnittenen Organoidabschnitts zu lokalisieren, der intakt, gut geformt und in einer Ebene ist, die einen repräsentativen Querschnitt des Organoids abtastet. Der Abschnitt sollte eine ausgeprägte äußere Kernschicht von Photorezeptoren aufweisen, die mindestens einige Zellen dick ist, und eine separate und deutliche Schicht von Kernen, die keine Erholung und Färbung aufweisen.Rahmen Sie das Bild ein und erhöhen Sie die Vergrößerung auf das 20-fache. Gestalten Sie dann die Folie erneut, um das Bild mit so viel wie möglich von der Photorezeptorschicht zu füllen. Legen Sie die Z-Ebene fest und legen Sie die oberen unteren Grenzen des Z-Bereichs fest, um die gesamte Tiefe des Slices abzubilden.Stellen Sie dann alle drei Kanäle des Fluorophors in einer Z-Stapel-Aufnahme dar und speichern Sie das Bild in einem Dateiformat, das das Verhältnis der Fläche pro Pixel beibehält. Um die Anzahl der toten Zellen in jeder Probe zu quantifizieren, öffnen Sie die Bildstapel in Fidschi. Vergewissern Sie sich im Fenster mit den Importoptionen des Bio-Formats, dass keine Kontrollkästchen unter dem Abschnitt "In separate Fenster aufteilen" aktiviert sind, und wählen Sie "Bild", "Stapel" und "Z-Projekt" aus, um ein neues Bild für die Quantifizierung zu erstellen.Wählen Sie den Bildkanal aus, der die Wiederherstellung und Färbung anzeigt, und verwenden Sie das Polygonauswahlwerkzeug, um einen kontinuierlichen Bereich von Photorezeptoren im Bild zu skizzieren. Klicken Sie auf Analysieren und Festlegen von Messungen, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bereich. Klicken Sie auf Analysieren und Messen, um die Fläche der Photorezeptoren zu messen und die sterbenden Zellen zu zählen.Die Messung wird in einem Popup-Fenster angezeigt. Um die Apoptose-positiven Kerne in der ausgewählten Photorezeptorregion zu zählen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktwerkzeug, um das Mehrpunktwerkzeug auszuwählen, und wählen Sie die Apoptose-positive Färbung aus, die sich mit einem DAPI-positiven Kern überlappt, und erholen und färben. Wechseln Sie zwischen den Kanälen, um die positiven Zellen zu validieren.Teilen Sie dann die Anzahl der Apoptose-positiven Zellen durch die Fläche, um einen normalisierten Wert für den Zelltod innerhalb der Photorezeptoren pro Organoid zu erhalten. Nachdem Sie die DesoxySA-Konzentration bestimmt haben, die den Zielzelltod induziert, verwenden Sie eine sterile Sonde, um drei Gruppen von Organoiden von ungefähr gleicher Größe und Form mit mindestens fünf Organoiden pro Gruppe auszuwählen. Und fügen Sie die Gruppen zu einzelnen Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz hinzu.Fügen Sie die Zielzelltodkonzentration von DesoxySA, die Zielzelltodkonzentration von DesoxySA, ergänzt mit dem interessierenden Arzneimittel oder dem Kontrollmedium, in die entsprechende Vertiefung oder Organoide hinzu. Ersetzen Sie nach zwei Tagen den Überstand in jeder Vertiefung durch die entsprechende Konzentration an frischem Behandlungs- oder Kontrollmedium. Beurteilen Sie nach vier Tagen Kultur die Kulturen wie gezeigt auf Zelltod.In dieser repräsentativen Analyse wurden retinale Organoide, die aus einer nicht-makulären Teleangiektasie-Typ-2-Kontroll-induzierten pluripotenten Stammzelllinie generiert wurden, mit vier Konzentrationen von DesoxySA behandelt. Der Zelltod als Reaktion auf DesoxySA war konzentrationsabhängig und in nur 50 nanomolaren DesoxySA nachweisbar. Die höchste getestete Konzentration induzierte einen robusten Zelltod, während die Integrität des Netzhautorganoids erhalten blieb.Die Behandlung mit 20 mikromolaren Fenofibrat verhinderte die DeoxySA-induzierte Toxizität in den Photorezeptoren von Netzhautorganoiden und reduzierte den Zelltod nach viertägiger Behandlung signifikant um etwa 80%. Denken Sie daran, gut geformte und gesunde Organoide auszuwählen, um sicherzustellen, dass der Assay in Netzhautzellen durchgeführt wird. Die Organoide können für die RNA-Sammlung verarbeitet werden, um die Genexpression zu quantifizieren, was die Bewertung von Stresssignalen und die Validierung toxischer Wirkungen und Rettungen ermöglicht.Mit dieser Technik konnten wir den nachgeschalteten Stoffwechsel mehrerer verschiedener Lipide in Organoiden untersuchen und so die Untersuchung des Fettstoffwechsels in der menschlichen Netzhaut eröffnen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Fluoreszierende Nanopartikel für die Messung von Ionen-Konzentration in biologischen Systemen

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Forschung

Biotechnik

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: eine automatisierte Plattform für Biomasse Enzym-Entdeckung und Cocktail-Optimierung

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gentransfer und Transfektion in humanen Pankreaskarzinom-Zellen mit Epidermal Growth Factor Gelatin-Based Engineered Nanovektoren Rezeptor-gezielte

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Niedermolekulare Protein Enrichment auf mesoporösem Siliciumdioxid Dünnschichten für Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Luzifergelb - Ein robuster parazellulärer Permeabilitätsmarker in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Barriere

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...