Name: toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00
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लोवी मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित। हम मैकटेल परियोजना के समर्थन के लिए लोवी परिवार को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम पांडुलिपि तैयार करने में उनके बौद्धिक इनपुट और सहायता के लिए मारी गैंटनर, माइक डोरेल और ली शेपके को धन्यवाद देना चाहते हैं।

1. आईपीएससी/ईएससी को पिघलाना, पास करना और विस्तार करना
नोट: सभी सेल संवर्धन चरणों के लिए, बाँझ सेल संस्कृति को बनाए रखने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का उपयोग करें।
<ol><li>तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध...

<ol>
	<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development.">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li><li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down,+mice+are+not+just+small+humans.">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 39-44 (2005).</li><li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina.">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+retinal+development+and+disease+with+human+pluripotent+stem+cells.">Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).</li><li>Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+pathways+in+neurodegeneration,+from+genetics+to+mechanisms.">Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).</li><li>Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+estimates+of+macular+telangiectasia+type+2:+the+Melbourne+collaborative+cohort+study.">The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study.</a> Retina. 30 (3), 473-478 (2010).</li><li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+retinal+neurodegeneration+in+patients+with+macular+telangiectasia+type+2:+A+randomized+clinical+trial.">Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial.</a> Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).</li><li>Gass, J. D., Blodi, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study.">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li><li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study.">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Muller's+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2.">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li><li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy.">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li><li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2.">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li><li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway.">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li><li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients:+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy.">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li><li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields.">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).</li></ol>

विभेदन प्रोटोकॉल भिन्नताएं योशिकी सासाई के समूह20 द्वारा स्व-निर्माण ऑप्टिक कप के आविष्कार के बाद से, कई प्रयोगशालाओं ने रेटिना ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैं...

सेल संस्कृति और पशु मॉडल में मानव रोग मॉडलिंग ने फार्माकोलॉजिकल चिकित्सीय की खोज, संशोधन और सत्यापन के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान किए हैं, जिससे उन्हें उम्मीदवार दवा से अनुमोदित चिकित्सा में आगे बढ़ने की अनुमति मिलती है। यद्यपि विवो मॉडल में इन विट्रो और गैर-मानव का संयोजन लंबे समय से दवा विकास पाइपलाइन का एक महत्वपूर्ण घटक रहा है, वे अक्सर नई दवा उम्मीदवारों के नैदानिक प्रदर्शन की भविष्यवाणी करने में विफलरहते हैं। प्रौद्योगिकियों के विकास की स्पष्ट आवश्यकता है जो सरलीकृत मानव सेलुलर मोनोकल्चर और नैदानिक परीक्षणों के बीच की खाई को पाटते हैं। स्व-संगठित त्रि-आयामी ऊतक संस्कृतियों, ऑर्गेनोइड्स में हालिया तकनीकी प्रगति ने उन ऊतकों के प्रति उनकी निष्ठा में सुधार किया है जो वे उन्हें प्रीक्लिनिकल दवा विकास पाइपलाइन2 में आशाजनक उपकरण बनाते हैं।
विवो मॉडल में गैर-मानव पर मानव कोशिका संस्कृति का एक प्रमुख लाभ मानव चयापचय की विशिष्ट पेचीदगियों को दोहराने की क्षमता है जो मनुष्यों और चूहों जैसे उच्च क्रम कशेरुकियों के बीच भी काफी भिन्न होसकता है। हालांकि, इस विशिष्टता को ऊतक जटिलता में नुकसान से कम किया जा सकता है; रेटिना ऊतक के लिए ऐसा मामला है जहां कई सेल प्रकार जटिल रूप से परस्पर जुड़े हुए हैं और सेलुलर उपप्रकारों के बीच एक अद्वितीय सहजीवी चयापचय परस्पर क्रिया है जिसे मोनोकल्चर4 में दोहराया नहीं जा सकता है। मानव ऑर्गेनोइड्स, जो सेल संस्कृति की पहुंच और स्केलेबिलिटी के साथ जटिल मानव ऊतकों का एक फेसिमाइल प्रदान करते हैं, इन रोग मॉडलिंग प्लेटफार्मों की कमियों को दूर करने की क्षमता रखते हैं।
स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त रेटिना ऑर्गेनोइड्स मानव तंत्रिका रेटिना 5 के जटिल ऊतक को मॉडलिंग में विशेष रूप से वफादार साबित हुएहैं। इसने रेटिना ऑर्गेनॉइड मॉडल को रेटिना रोग 6,7 के अध्ययन और उपचार के लिए एक आशाजनक तकनीक बना दिया है। आज तक रेटिना ऑर्गेनोइड्स में अधिकांश रोग मॉडलिंग ने मोनोजेनिक रेटिना रोगों पर ध्यान केंद्रित किया है जहां रेटिना ऑर्गेनोइड्स रोग पैदा करने वाले आनुवंशिक वेरिएंट 7 के साथ आईपीएससी लाइनों से प्राप्तहोते हैं। ये आम तौर पर अत्यधिक पेनेट्रेंट उत्परिवर्तन होते हैं जो विकासात्मक फेनोटाइप के रूप में प्रकट होते हैं। उम्र बढ़ने की बीमारियों पर कम काम प्रभावी ढंग से किया गया है जहां आनुवंशिक उत्परिवर्तन और पर्यावरणीय तनाव सामान्य रूप से विकसित ऊतक को प्रभावित करते हैं। उम्र बढ़ने के न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में जटिल आनुवंशिक विरासत और पर्यावरणीय तनावों से योगदान हो सकता है जो अल्पकालिक सेल संस्कृतियों का उपयोग करके मॉडल करना स्वाभाविक रूप से मुश्किल है। हालांकि, कई मामलों में ये जटिल रोग सामान्य सेलुलर या चयापचय तनावों पर एकजुट हो सकते हैं, जो पूरी तरह से विकसित मानव ऊतक पर परीक्षण किए जाने पर, उम्र बढ़ने के न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में शक्तिशाली अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकतेहैं।
देर से शुरू होने वाली मैकुलर डीजेनेरेटिव बीमारी, मैकुलर टेलेंजीक्टेसिया टाइप II (मैकटेल), आनुवंशिक रूप से जटिल न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी का एक बड़ा उदाहरण है जो एक सामान्य चयापचय दोष पर निर्भर करता है। मैकटेल उम्र बढ़ने की एक असामान्य रेटिना अपक्षयी बीमारी है जिसके परिणामस्वरूप मैक्युला में फोटोरिसेप्टर और मुलर ग्लिया हानि होती है, जिससे केंद्रीय दृष्टि 9,10,11,12,13 में प्रगतिशील नुकसान होता है। मैकटेल में, एक अनिर्धारित, संभवतः बहुक्रियात्मक, आनुवंशिक विरासत रोगियों में परिसंचारी सेरीन में एक आम कमी लाती है, जिसके परिणामस्वरूप एक न्यूरोटॉक्सिक लिपिड प्रजातियों में वृद्धि होती है जिसे डीऑक्सीस्फिंगोलिपिड्स (डीऑक्सीएसएल) 14,15 कहा जाता है। यह साबित करने के लिए कि डीऑक्सीएसएल का संचय रेटिना के लिए विषाक्त है और संभावित दवा चिकित्सीय को मान्य करने के लिए, हमने मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स14 में फोटोरिसेप्टर विषाक्तता की परख के लिए इस प्रोटोकॉल को विकसित किया है।
यहां हम मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स को अलग करने, ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके विषाक्तता और बचाव परख स्थापित करने और परिणामों को निर्धारित करने के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं। हम एक सफल उदाहरण प्रदान करते हैं जहां हम एक संदिग्ध बीमारी पैदा करने वाले एजेंट, डीऑक्सीएसएल की ऊतक-विशिष्ट विषाक्तता का निर्धारण करते हैं, और डीऑक्सीएसएल-प्रेरित रेटिना विषाक्तता के संभावित उपचार के लिए एक सुरक्षित जेनेरिक दवा, फेनोफिब्रेट के उपयोग को मान्य करते हैं। पिछले काम से पता चला है कि फेनोफिब्रेट डीऑक्सीएसएल के क्षरण को बढ़ा सकता है और रोगियों में डीऑक्सीएसएल को कम कर सकता है, हालांकि, डीऑक्सीएसएल-प्रेरित रेटिना विषाक्तता को कम करने में इसकी प्रभावकारिताका परीक्षण नहीं किया गया है। यद्यपि हम एक विशिष्ट उदाहरण प्रस्तुत करते हैं, इस प्रोटोकॉल का उपयोग रेटिना ऊतक पर किसी भी चयापचय / पर्यावरणीय तनाव और संभावित चिकित्सीय दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125mL Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-deoxysphinganine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver 6900 Mini-Blade</td>
			<td>Beaver-Visitec</td>
			<td>BEAVER6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>A32794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, Heat Inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45001-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenofibrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Recoverin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Plus- O.C.T. compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>62534-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield-mounting medium</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wax pen-ImmEdge</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery

ऑर्गेनोइड्स रोग तंत्र और उपचार का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक मंच प्रदान करते हैं, सीधे सेल संस्कृति की बहुमुखी प्रतिभा और थ्रूपुट के साथ मानव ऊतक के संदर्भ में। परिपक्व मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स का उपयोग उम्र से संबंधित रेटिना अपक्षयी रोग मैकुलर टेलेंजिक्टेसिया टाइप 2 (मैकटेल) के लिए संभावित दवा उपचार को स्क्रीन करने के लिए किया जाता है।
हमने हाल ही में दिखाया है कि मैकटेल एक एटिपिकल लिपिड प्रजातियों, डीऑक्सीस्फिंगोलिपिड्स (डीऑक्सीएसएल) के ऊंचे स्तर के कारण हो सकता है। ये लिपिड रेटिना के लिए विषाक्त हैं और मैकटेल रोगियों में होने वाले फोटोरिसेप्टर हानि को चला सकते हैं। डीऑक्सीएसएल फोटोरिसेप्टर विषाक्तता को रोकने की उनकी क्षमता के लिए दवाओं की जांच करने के लिए, हमने एक गैर-मैकटेल प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) लाइन से मानव रेटिना ऑर्गेनोइड उत्पन्न किए और उन्हें पोस्ट-माइटोटिक उम्र में परिपक्व किया, जहां वे कार्यात्मक रूप से परिपक्व फोटोरिसेप्टर सहित रेटिना के सभी न्यूरोनल वंश-व्युत्पन्न कोशिकाओं को विकसित करते हैं। रेटिना ऑर्गेनोइड्स को एक डीऑक्सीएसएल मेटाबोलाइट के साथ इलाज किया गया था और एपोप्टोसिस को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके फोटोरिसेप्टर परत के भीतर मापा गया था। इस विषाक्तता मॉडल का उपयोग करते हुए, औषधीय यौगिक जो डीऑक्सीएसएल-प्रेरित फोटोरिसेप्टर मृत्यु को रोकते हैं, की जांच की गई थी। एक लक्षित उम्मीदवार दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने निर्धारित किया कि फेनोफाइब्रेट, आमतौर पर उच्च कोलेस्ट्रॉल और ट्राइग्लिसराइड्स के उपचार के लिए निर्धारित दवा, रेटिना की कोशिकाओं में डीऑक्सीएसएल विषाक्तता को भी रोक सकती है।
विषाक्तता स्क्रीन ने सफलतापूर्वक एफडीए-अनुमोदित दवा की पहचान की जो फोटोरिसेप्टर मृत्यु को रोक सकती है। यह परीक्षण किए गए अत्यधिक रोग-प्रासंगिक मॉडल के कारण एक प्रत्यक्ष कार्रवाई योग्य खोज है। रेटिना रोगों में भविष्य के उपचार की खोज के लिए किसी भी संख्या में चयापचय तनाव और संभावित औषधीय हस्तक्षेप का परीक्षण करने के लिए इस मंच को आसानी से संशोधित किया जा सकता है।

रेटिना ऑर्गेनोइड्स एक गैर-मैकटेल नियंत्रण आईपीएससी लाइन से उत्पन्न हुए थे। ऑर्गेनोइड्स संस्कृति में 26 सप्ताह तक पहुंचने के बाद उन्हें चुना गया और प्रयोगात्मक समूहों में विभाजित किया गया। ऑर्गेनोइड?...

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Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

यहां हम परिपक्व मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और उम्र से संबंधित रेटिना अपक्षयी रोग मैकुलर टेलेंजिक्टेसिया टाइप 2 (मैकटेल) के लिए दवा उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए फोटोरिसेप्टर विषाक्तता परख में उनका उपयोग करते हैं।

फार्मास्युटिकल डिस्कवरी के लिए मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स में विषाक्तता स्क्रीन

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

यह प्रोटोकॉल मानव रेटिना ऊतक के भीतर सीधे चयापचय रेटिना रोगों के लिए दवा उपचार की खोज और सत्यापन के लिए एक प्रीक्लिनिकल दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह तकनीक सेल संस्कृति की बहुमुखी प्रतिभा और थ्रूपुट के साथ मानव ऊतकों में चयापचय की जटिलता को जोड़ती है। हमने इस परख का उपयोग रेटिना अपक्षयी रोग, मैकटेल के उपचार के लिए प्रीक्लिनिकल डेटा प्राप्त करने के लिए किया है, एक सामान्य और सुरक्षित लिपिड बदलने वाली दवा, फेनोफाइब्रेट का उपयोग करके, जो अब नैदानिक सुरक्षा परीक्षणों में है।इस दृष्टिकोण को किसी भी संख्या में सामान्य रेटिना तनावों पर लागू किया जा सकता है जो पोषक तत्वों की कमी, हाइपोक्सिया, प्रकाश विषाक्तता और अन्य विषाक्त लिपिड सहित बीमारी का कारण बनते हैं। संस्कृति के सप्ताह 24 में, ऑर्गेनोइड के बाहर अल्पविकसित खंडों के गठन के लिए ऑर्गेनोइड्स की जांच करें। सप्ताह 26 से 28 तक, बाहरी खंडों को एक मोटी परत बनानी चाहिए थी।जब एक मोटा संदेह खंड देखा जा सकता है, तो एक मिलीमोलर डीऑक्सीएसए स्टॉक समाधान को 0.51 तक पतला करें। रेटिना भेदभाव माध्यम प्लस के तीन मिलीलीटर में एक और दो माइक्रोमोलर सांद्रता। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप और एक बाँझ जांच का उपयोग करके, प्रति समूह कम से कम पांच ऑर्गेनोइड्स के साथ लगभग समान आकार और आकार के ऑर्गेनोइड्स के चार समूहों का चयन करें, और समूहों को अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 6-वेल प्लेट के अलग-अलग कुओं में विभाजित करें।जब सभी ऑर्गेनोइड एकत्र हो जाते हैं, तो प्रत्येक कुएं से जितना संभव हो उतना माध्यम निकालें और प्रत्येक कुएं में डीऑक्सीएसए समाधान की एक एकाग्रता जोड़ें। ऑर्गेनोइड्स के चौथे समूह में वाहन नियंत्रण जोड़ें। संस्कृति के दो दिनों के बाद, संस्कृति सुपरनैटेंट को उपयुक्त ताजा डीऑक्सीएसए या नियंत्रण कमजोर पड़ने के साथ बदलें।संस्कृति के चार दिनों के बाद, क्रायो सेक्शन एम्बेड करें और प्रत्येक संस्कृति के भीतर कोशिका मृत्यु के आकलन की अनुमति देने के लिए मानक प्रोटोकॉल के अनुसार ऑर्गेनोइड्स को दाग दें। धुंधला होने के बाद, कटा हुआ ऑर्गेनॉइड सेक्शन के एक क्षेत्र का पता लगाने के लिए पांच से 10x आवर्धन का उपयोग करें जो बरकरार है, अच्छी तरह से गठित है, और एक विमान में जो ऑर्गेनोइड के प्रतिनिधि क्रॉस सेक्शन का नमूना लेता है। अनुभाग में फोटोरिसेप्टर की एक अलग बाहरी परमाणु परत होनी चाहिए जो कम से कम कुछ कोशिकाएं मोटी हों, और नाभिक की एक अलग और विशिष्ट परत जिसमें वसूली और धुंधलापन न हो।छवि को फ्रेम करें और आवर्धन को 20x तक बढ़ाएं। फिर, छवि को यथासंभव फोटोरिसेप्टर परत से भरने के लिए स्लाइड को फिर से फ्रेम करें। जेड-प्लेन सेट करें और स्लाइस की पूरी गहराई को चित्रित करने के लिए जेड-रेंज की ऊपरी छोर निचली सीमा निर्धारित करें।फिर जेड-स्टैक अधिग्रहण में फ्लोरोफोरे के सभी तीन चैनलों को चित्रित करें, और छवि को एक फ़ाइल प्रारूप में सहेजें जो प्रति पिक्सेल क्षेत्र के अनुपात को संरक्षित करता है। प्रत्येक नमूने में मृत कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, फिजी में छवि ढेर खोलें। बायो प्रारूप की आयात विकल्प विंडो में, पुष्टि करें कि अलग-अलग विंडोज सेक्शन में विभाजित कोई बॉक्स चेक नहीं किया गया है और परिमाणीकरण के लिए एक नई छवि बनाने के लिए छवि, स्टैक्स और जेड प्रोजेक्ट का चयन करें।उस छवि चैनल का चयन करें जो पुनर्प्राप्ति और धुंधला दिखाता है और छवि में फोटोरिसेप्टर के निरंतर क्षेत्र को रेखांकित करने के लिए बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करें। विश्लेषण करें और माप सेट करें क्लिक करें और क्षेत्र बॉक्स का चयन करें. मरने वाली कोशिकाओं की गणना करने के लिए, फोटोरिसेप्टर के क्षेत्र को मापने के लिए विश्लेषण और माप पर क्लिक करें।माप एक पॉप-अप विंडो में दिखाई देगा। चयनित फोटोरिसेप्टर क्षेत्र में एपोप्टोसिस पॉजिटिव नाभिक की गणना करने के लिए, मल्टीपॉइंट टूल का चयन करने के लिए पॉइंट टूल पर राइट क्लिक करें और एपोप्टोसिस पॉजिटिव स्टेनिंग का चयन करें जो डीएपीआई पॉजिटिव नाभिक के साथ ओवरलैप होता है और ठीक और धुंधला हो जाता है। सकारात्मक कोशिकाओं को मान्य करने के लिए चैनलों के बीच टॉगल करें।फिर प्रति ऑर्गेनोइड फोटोरिसेप्टर के भीतर कोशिका मृत्यु के लिए एक सामान्यीकृत मूल्य प्राप्त करने के लिए क्षेत्र द्वारा एपोप्टोसिस सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करें। लक्ष्य कोशिका मृत्यु को प्रेरित करने वाले डीऑक्सीएसए एकाग्रता का निर्धारण करने के बाद, प्रति समूह न्यूनतम पांच ऑर्गेनोइड्स के साथ लगभग समान आकार और आकार के ऑर्गेनोइड्स के तीन समूहों का चयन करने के लिए एक बाँझ जांच का उपयोग करें। और समूहों को अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 6-वेल प्लेट के अलग-अलग कुओं में जोड़ें।डीऑक्सीएसए की लक्ष्य कोशिका मृत्यु एकाग्रता जोड़ें, डीऑक्सीएसए की लक्ष्य कोशिका मृत्यु एकाग्रता को रुचि की दवा या नियंत्रण माध्यम के साथ उचित कुएं या ऑर्गेनोइड्स के साथ पूरक किया जाता है। दो दिनों के बाद, प्रत्येक कुएं में सतह पर तैरने वाले को ताजा उपचार या नियंत्रण माध्यम की उचित एकाग्रता के साथ बदलें। संस्कृति के चार दिनों के बाद, प्रदर्शित कोशिका मृत्यु के लिए संस्कृतियों का आकलन करें।इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, एक गैर मैकुलर टेलेंजिक्टसिया टाइप 2 नियंत्रण प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल लाइन से उत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड्स को डीऑक्सीएसए की चार सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। डीऑक्सीएसए के जवाब में कोशिका मृत्यु एकाग्रता पर निर्भर थी और 50 नैनोमोलर डीऑक्सीएसए में पता लगाने योग्य थी। परीक्षण की गई उच्चतम एकाग्रता ने रेटिना ऑर्गेनॉइड की अखंडता को बनाए रखते हुए एक मजबूत कोशिका मृत्यु को प्रेरित किया।20 माइक्रोमोलर फेनोफाइब्रेट के साथ उपचार ने रेटिना ऑर्गेनोइड्स के फोटो रिसेप्टर्स में डीऑक्सीएसए प्रेरित विषाक्तता को रोका, चार दिनों के उपचार के बाद कोशिका मृत्यु को लगभग 80% तक कम कर दिया। यह सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से गठित और स्वस्थ ऑर्गेनोइड्स का चयन करना याद रखें कि परख रेटिना कोशिकाओं में की जा रही है। जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए आरएनए संग्रह के लिए ऑर्गेनोइड्स को संसाधित किया जा सकता है, जिससे तनाव संकेतों का मूल्यांकन और विषाक्त प्रभाव और बचाव का सत्यापन हो सकता है।इस तकनीक का उपयोग करके, हम ऑर्गेनोइड्स में कई अलग-अलग लिपिड के डाउनस्ट्रीम चयापचय को परखने में सक्षम हैं, जिससे मानव रेटिना में लिपिड चयापचय का अध्ययन खुल गया है।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

बायोलॉजिकल सिस्टम में आयन एकाग्रता के मापन के लिए प्रतिदीप्त नैनोकणों

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

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बायोमास एनजाइम डिस्कवरी और कॉकटेल अनुकूलन के लिए एक स्वचालित प्लेटफार्म: GENPLAT

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

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जीन और मानव अग्नाशय के कैंसर epidermal वृद्धि कारक का उपयोग कक्ष में डिलिवरी अभिकर्मक जिलेटिन आधारित इंजीनियर Nanovectors रिसेप्टर - लक्षित

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

बायोमैटिरियल्स उच्च Throughput डिस्कवरी के लिए पॉलिमर माइक्रोएरे

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

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Mesoporous सिलिका Biomarker डिस्कवरी के लिए पतली फिल्मों पर कम आण्विक वजन प्रोटीन संवर्धन

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

खंगाला मानव कॉर्निया की तरह उपकला (RHCE) ऊतक मॉडल का उपयोग नेत्र परेशान रसायन का खतरा पहचान के लिए आंखों में जलन टेस्ट (ईआईटी)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा प्राथमिक मुरीन रेटिनल गंगलायन कोशिकाओं (आरजीसी) का अलगाव

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

ऊतकों और Organoids इंजीनियरिंग के लिए Microfluidic Bioprinting Vascularized

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

रासायनिक Epigenetic संशोधक के साथ सेलुलर मशीनरी को पुनः निर्देशित करके जीन प्रतिलेखन का दमन

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer पीला - मानव रक्त मस्तिष्क बैरियर के एक सेल मॉडल में एक मजबूत Paracellular स्थायित्व मार्कर

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...