Name: toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00
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ローウィー医学研究所の支援を受けています。MacTelプロジェクトを支援してくださったLowyファミリーに感謝します。Mari Gantner、Mike Dorrell、Lea Scheppkeの知的インプットと原稿の準備支援に感謝します。

1. iPS細胞/ESCの解凍・継代・膨張
注:すべての細胞培養ステップで、ベストプラクティスを使用して滅菌細胞培養を維持します。
<ol><li>6ウェル細胞培養プレートを基底膜マトリックス培地でコーティングします。<ol><li>この培地を1倍調製するには、製品仕様に従うか、75 μLのコールドマトリックス培地を9 mLのDMEM/F12で希釈します。1ウェルあたり1.5 mLの新しく調製した1x培...

<ol>
	<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development.">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li><li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down,+mice+are+not+just+small+humans.">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 39-44 (2005).</li><li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina.">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study.">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li><li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study.">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Muller's+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2.">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li><li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy.">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li><li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2.">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li><li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway.">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li><li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients:+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy.">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li><li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields.">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).</li></ol>

差別化プロトコルのバリエーション 笹井芳樹のグループ20による自己形成光学カップの発明以来、多くの研究室は、ほぼすべてのステップで変化する可能性のある網膜オルガノイドを生成するためのプロトコルを開発してきました5、18、19、21。プロトコルの完全?...

細胞培養および動物モデルにおけるヒト疾患のモデリングは、薬理学的治療法の発見、改変、および検証のための非常に貴重なツールを提供し、候補薬から承認された治療法に進むことを可能にしました。in vitroモデルと非ヒトin vivoモデルの組み合わせは、長い間医薬品開発パイプラインの重要な要素でしたが、新薬候補の臨床性能を予測できないことがよくあります1。単純なヒト細胞単培養と臨床試験の間のギャップを埋める技術の開発が明らかに必要です。自己組織化された3次元組織培養であるオルガノイドの最近の技術的進歩により、モデル化する組織への忠実度が向上し、前臨床医薬品開発パイプライン2の有望なツールとなっています。
非ヒトin vivoモデルに対するヒト細胞培養の主な利点は、ヒトとマウスなどの高次脊椎動物の間でもかなり異なる可能性のあるヒト代謝の特定の複雑さを再現できることです3。ただし、この特異性は、組織の複雑さが失われると影が薄くなる可能性があります。これは、複数の細胞型が複雑に織り交ぜられ、単一培養では複製できない細胞サブタイプ間の独特の共生代謝相互作用を有する網膜組織の場合です4。ヒトオルガノイドは、複雑なヒト組織の複製に細胞培養のアクセシビリティとスケーラビリティを提供し、これらの疾患モデリングプラットフォームの欠陥を克服する可能性を秘めています。
幹細胞由来の網膜オルガノイドは、ヒト神経網膜の複雑な組織のモデリングに特に忠実であることが証明されています5。これにより、網膜オルガノイドモデルは網膜疾患の研究と治療のための有望な技術になりました6,7。これまで、網膜オルガノイドの疾患モデリングの多くは、網膜オルガノイドが疾患の原因となる遺伝的変異を持つiPS細胞株に由来する単一遺伝子網膜疾患に焦点を当ててきました7。これらは一般に、発生表現型として現れる浸透性の高い突然変異です。遺伝子変異や環境ストレッサーが正常に発達した組織に影響を与える老化疾患については、あまり効果的に行われていません。老化の神経変性疾患は、複雑な遺伝的遺伝と、短期間の細胞培養を使用してモデル化することが本質的に困難な環境ストレッサーからの寄与を持つ可能性があります。しかし、多くの場合、これらの複雑な疾患は、完全に発達したヒト組織でテストすると、老化の神経変性疾患に関する強力な洞察を提供することができる一般的な細胞性または代謝性ストレッサーに合体する可能性があります8。
遅発性黄斑変性疾患である黄斑毛細血管拡張症II型(MacTel)は、一般的な代謝異常で合体する遺伝的に複雑な神経変性疾患の好例です。MacTelは、黄斑部の光受容体とミュラーグリアの喪失をもたらし、中心視力の進行性の喪失をもたらす、老化の珍しい網膜変性疾患です9,10,11,12,13。MacTelでは、未決定の、おそらく多因子の遺伝的遺伝が患者の循環セリンの一般的な減少を引き起こし、その結果、デスフィンゴ糖脂質(deoxySL)と呼ばれる神経毒性脂質種が増加します14,15。deoxySLの蓄積が網膜に毒性があることを証明し、潜在的な医薬品治療法を検証するために、ヒト網膜オルガノイドの光受容体毒性をアッセイするためのこのプロトコルを開発しました14。
ここでは、ヒト網膜オルガノイドを鑑別し、オルガノイドを使用した毒性およびレスキューアッセイを確立し、結果を定量化するための特定のプロトコルの概要を説明します。疾患原因が疑われるデオキシSLの組織特異的毒性を特定し、デオキシSL誘発網膜毒性の潜在的な治療のための安全なジェネリック医薬品であるフェノフィブラートの使用を検証する成功例を提供します。以前の研究では、フェノフィブラートが患者のデオキシSLの分解を増加させ、循環デオキシSLを低下させる可能性があることが示されていますが、デオキシSL誘発網膜毒性の低減におけるその有効性はテストされていません16,17。具体的な例を紹介しますが、このプロトコルは、網膜組織に対する任意の数の代謝/環境ストレッサーおよび潜在的な治療薬の効果を評価するために利用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125mL Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-deoxysphinganine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver 6900 Mini-Blade</td>
			<td>Beaver-Visitec</td>
			<td>BEAVER6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>A32794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, Heat Inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45001-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenofibrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Recoverin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Plus- O.C.T. compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>62534-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield-mounting medium</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wax pen-ImmEdge</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery

オルガノイドは、細胞培養の汎用性とスループットを備えたヒト組織の状況下で、疾患メカニズムと治療法を直接研究するための有望なプラットフォームを提供します。成熟ヒト網膜オルガノイドは、加齢性網膜変性疾患黄斑毛細血管拡張症2型(MacTel)の潜在的な薬物治療法をスクリーニングするために利用されています。
我々は最近、MacTelが非定型脂質種であるデオキシスフィンゴ脂質(deoxySL)のレベルの上昇によって引き起こされる可能性があることを示しました。これらの脂質は網膜に有毒であり、MacTel患者に発生する視細胞喪失を引き起こす可能性があります。デオキシSL光受容体毒性を予防する薬剤をスクリーニングするために、非MacTel誘導多能性幹細胞(iPSC)株からヒト網膜オルガノイドを作製し、機能的に成熟した光受容体を含む網膜の神経系譜由来細胞をすべて発達させる有糸分裂後年齢まで成熟させました。網膜オルガノイドをデオキシSL代謝物で処理し、免疫組織化学を用いて視細胞層内のアポトーシスを測定した。この毒性モデルを用いて、デオキシSL誘発性光受容体死を予防する薬理学的化合物をスクリーニングした。標的候補アプローチを使用して、高コレステロールおよびトリグリセリドの治療に一般的に処方される薬であるフェノフィブラートも、網膜の細胞におけるデオキシSL毒性を予防できると判断しました。
毒性スクリーニングは、視受容体死を防ぐことができるFDA承認薬を特定することに成功しました。これは、テストされた疾患関連性の高いモデルにより、直接実用的な発見です。このプラットフォームは、網膜疾患における将来の治療法発見のために、任意の数の代謝ストレッサーおよび潜在的な薬理学的介入をテストするために簡単に変更できます。

網膜オルガノイドは、非MacTelコントロールiPS細胞株から作製した。オルガノイドが培養26週に達した後、それらを選択して実験グループに分けました。オルガノイドを様々な濃度のデオキシSAで処理して、デオキシSAが光受容体に対して毒性であるかどうかを決定しました。0〜1μMの4つの濃度のデオキシSAをテストし(図2)、オルガノイドを8日間処理し、1日おきに培地を交...

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Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

ここでは、成熟ヒト網膜オルガノイドを生成し、それらを光受容体毒性アッセイに利用して、加齢性網膜変性疾患黄斑毛細血管拡張症2型(MacTel)の医薬品候補を特定するための段階的なプロトコルを紹介します。

創薬のためのヒト網膜オルガノイドの毒性スクリーニング

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

このプロトコルは、ヒト網膜組織内で直接代謝性網膜疾患の薬物治療法を発見および検証するための前臨床アプローチを提供します。この技術は、ヒト組織における代謝の複雑さと、細胞培養の多様性およびスループットを兼ね備えています。このアッセイを使用して、現在臨床安全性試験中の一般的で安全な脂質改変薬であるフェノフィブラートを使用して、網膜変性疾患であるMacTelの治療のための前臨床データを取得しました。このアプローチは、栄養欠乏症、低酸素症、光毒性、その他の有毒脂質など、病気につながる一般的な網膜ストレッサーにいくつでも適用できます。培養24週目に、オルガノイドの外側に初歩的なセグメントが形成されているかどうかオルガノイドを確認します。26週目から28週目までに、外側のセグメントは厚い層を形成しているはずです。厚い疑わしいセグメントが観察されたら、1ミリモルのデオキシSAストック溶液を0.51に希釈します。3ミリリットルの網膜分化培地中の1および2マイクロモル濃度プラス。解剖顕微鏡と滅菌プローブを使用して、ほぼ同じサイズと形状のオルガノイドの4つのグループを選択し、グループごとに最低5つのオルガノイドを選択し、グループを超低アタッチメント6ウェルプレートの個々のウェルに分割します。すべてのオルガノイドを採取したら、各ウェルからできるだけ多くの培地を取り除き、各ウェルに1濃度のdeoxySA溶液を加えます。ビヒクルコントロールをオルガノイドの4番目のグループに追加します。2日間の培養後、培養上清を適切な新鮮なdeoxySAまたは対照希釈液と交換します。4日間の培養後、クライオ切片を埋め込み、標準プロトコルに従ってオルガノイドを染色し、各培養液内の細胞死を評価できるようにします。染色後、5〜10倍の倍率を使用して、スライスされたオルガノイド切片の領域が無傷で整形成されており、オルガノイドの代表的な断面をサンプリングする平面内にある領域を見つけます。切片は、少なくとも数細胞の厚さの光受容体の明確な外顆粒層と、回復および染色を持たない核の別個の別個の別個の層を有するべきである。画像をフレームに収め、倍率を20倍に増やします。次に、スライドを再度フレームに入れて、できるだけ多くの感光体層で画像を埋めます。Z 平面を設定し、Z 範囲の上限下限を設定して、スライスの深さ全体をイメージ化します。次に、Zスタック取得で蛍光色素の3つのチャンネルすべてをイメージングし、ピクセルあたりの面積の比率を維持するファイル形式で画像を保存します。各サンプルの死細胞数を定量化するには、フィジーで画像スタックを開きます。バイオフォーマットのインポートオプションウィンドウで、[別々のウィンドウに分割]セクションの下にあるボックスがチェックされていないことを確認し、[画像]、[スタック]、および[Zプロジェクト]を選択して、定量化用の新しい画像を作成します。回復と染色を示す画像チャンネルを選択し、ポリゴン選択ツールを使用して、画像内の光受容体の連続領域の輪郭を描きます。[計測値の解析と設定] をクリックし、[面積] ボックスを選択します。[分析と測定]をクリックして、光受容体の面積を測定し、死にかけている細胞をカウントします。測定値がポップアップウィンドウに表示されます。選択した視細胞領域のアポトーシス陽性核をカウントするには、ポイントツールを右クリックしてマルチポイントツールを選択し、DAPI陽性核と重なるアポトーシス陽性染色を選択して回復および染色します。チャンネルを切り替えて、正のセルを検証します。次に、アポトーシス陽性細胞の数を面積で除して、オルガノイドあたりの光受容体内の細胞死について正規化された値を取得します。標的細胞死を誘導するdeoxySA濃度を決定した後、滅菌プローブを使用して、ほぼ同じサイズと形状のオルガノイドの3つのグループを選択し、グループごとに最低5つのオルガノイドを選択します。そして、超低アタッチメント6ウェルプレートの個々のウェルにグループを追加します。デオキシSAの標的細胞死濃度、目的の薬剤または対照培地を添加したデオキシSAの標的細胞死濃度を適切なウェルまたはオルガノイドに加える。2日後、各ウェルの上清を適切な濃度の新しい処理培地または対照培地と交換します。4日間の培養後、実証されたように培養物の細胞死を評価します。この代表的な解析では、非黄斑毛細血管拡張症2型対照誘導多能性幹細胞株から作製した網膜オルガノイドを、4つの濃度のdeoxySAで処理した。デオキシSAに応答した細胞死は濃度依存性であり、わずか50ナノモルのデオキシSAで検出可能でした。試験した最高濃度は、網膜オルガノイドの完全性を維持しながら、堅牢な細胞死を誘導しました。20マイクロモルのフェノフィブラートによる治療は、網膜オルガノイドの光受容体におけるデオキシSA誘発毒性を防ぎ、4日間の治療後に細胞死を約80%有意に減少させた。アッセイが網膜細胞で確実に行われていることを確認するために、整形式の健康なオルガノイドを選択することを忘れないでください。オルガノイドは、遺伝子発現を定量化するためにRNA収集用に処理することができ、ストレスシグナルの評価、毒性作用およびレスキューの検証を可能にします。この技術を用いて、オルガノイド中の複数の異なる脂質の下流代謝をアッセイすることができ、ヒト網膜における脂質代謝の研究が開かれました。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

生体内イオン濃度の測定のための蛍光ナノ粒子

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

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The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

上皮成長因子受容体をターゲットとしたゼラチンベースのエンジニアNanovectorsを使用してヒト膵臓癌細胞における遺伝子デリバリーとトランスフェクション

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Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

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Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

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再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

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Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

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Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

ルシファーイエロー - ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける堅牢な細胞透過性マーカー

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...