Name: toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

Lowy Medical Research Institute에서 지원합니다. MacTel 프로젝트를 지원해 주신 Lowy 가족에게 감사드립니다. 원고 준비에 도움을 주신 Mari Gantner, Mike Dorrell, Lea Scheppke에게 감사드립니다.

1. iPSC/ESC의 해동, 패시징 및 확장
참고: 모든 세포 배양 단계에서 모범 사례를 사용하여 멸균 세포 배양을 유지하십시오.
<ol><li>6웰 세포 배양 플레이트를 기저막 매트릭스 배지로 코팅합니다.<ol><li>이 배지의 1x를 준비하려면 제품 사양을 따르거나 75μL 저온 매트릭스 배지를 9mL의 DMEM/F12로 희석하십시오. 6웰 플레이트에 웰당 1.5mL의 새로 준비한 1x 배지를 추가합니다. 37°C에서...

<ol>
	<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development.">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li><li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down,+mice+are+not+just+small+humans.">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 39-44 (2005).</li><li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina.">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+retinal+development+and+disease+with+human+pluripotent+stem+cells.">Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).</li><li>Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+pathways+in+neurodegeneration,+from+genetics+to+mechanisms.">Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).</li><li>Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+estimates+of+macular+telangiectasia+type+2:+the+Melbourne+collaborative+cohort+study.">The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study.</a> Retina. 30 (3), 473-478 (2010).</li><li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+retinal+neurodegeneration+in+patients+with+macular+telangiectasia+type+2:+A+randomized+clinical+trial.">Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial.</a> Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).</li><li>Gass, J. D., Blodi, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study.">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li><li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study.">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Muller's+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2.">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li><li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy.">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li><li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2.">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li><li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway.">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li><li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients:+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy.">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li><li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields.">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).</li></ol>

차별화 프로토콜 변형 요시키 사사이(Yoshiki Sasai)의 그룹20에 의한 자가 형성 광학 컵의 발명 이후, 많은 실험실들은 거의 모든 단계 5,18,19,21에서 변할 수 있는 망막 오가노이드를 생성하기 위한 프로토콜을 개발했다. 프로토콜의 전체 목록은 Capowski et al.22...

세포 배양 및 동물 모델에서 인간 질병을 모델링하는 것은 약리학적 치료제의 발견, 변형 및 검증을 위한 귀중한 도구를 제공하여 후보 약물에서 승인된 치료법으로 발전할 수 있도록 합니다. in vitro 및 non-human in vivo 모델의 조합은 오랫동안 약물 개발 파이프라인의 중요한 구성 요소였지만 신약 후보의 임상 성능을 예측하지 못하는 경우가 많습니다1. 단순한 인간 세포 단일 배양과 임상 시험 사이의 격차를 해소하는 기술 개발이 분명히 필요합니다. 자가 조직화된 3차원 조직 배양인 오가노이드의 최근 기술 발전으로 모델링한 조직에 대한 충실도가 향상되어 전임상 약물 개발 파이프라인에서 유망한 도구가 되었습니다2.
비인간 생체 모델에 비해 인간 세포 배양의 주요 이점은 인간 대사의 특정 복잡성을 복제할 수 있다는 것인데, 이는 인간과 생쥐와 같은 고차원 척추동물 사이에서도 상당히 다를 수 있다3. 그러나 이러한 특이성은 조직 복잡성의 손실로 인해 가려질 수 있습니다. 망막 조직의 경우 여러 세포 유형이 복잡하게 얽혀 있고 단일 배양에서 복제할 수 없는 세포 아형 간에 독특한 공생 대사 상호작용이 있습니다4. 세포 배양의 접근성과 확장성을 갖춘 복잡한 인간 조직의 복제물을 제공하는 인간 오가노이드는 이러한 질병 모델링 플랫폼의 결함을 극복할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
줄기세포에서 유래한 망막 오가노이드는 인간 신경 망막의 복잡한 조직을 모델링하는 데 특히 충실한 것으로 입증되었다5. 이로 인해 망막 오가노이드 모델은 망막 질환의 연구 및 치료를 위한 유망한 기술이 되었습니다 6,7. 지금까지 망막 오가노이드의 질병 모델링의 대부분은 망막 오가노이드가 질병을 유발하는 유전적 변이를 가진 iPSC 계통에서 파생되는 단일 유전자 망막 질환에 초점을 맞추었습니다7. 이들은 일반적으로 발달 표현형으로 나타나는 침투성이 높은 돌연변이입니다. 유전적 돌연변이와 환경적 스트레스 요인이 정상적으로 발달한 조직에 영향을 미치는 노화 질환에 대한 효과적인 연구는 거의 이루어지지 않았습니다. 노화의 신경퇴행성 질환은 복잡한 유전적 유전과 단기 세포 배양을 사용하여 모델링하기 본질적으로 어려운 환경적 스트레스 요인의 기여를 가질 수 있습니다. 그러나 많은 경우 이러한 복잡한 질병이 일반적인 세포 또는 대사 스트레스 요인에 영향을 미칠 수 있으며, 완전히 발달된 인체 조직에서 검사할 경우 노화로 인한 신경퇴행성 질환에 대한 강력한 통찰력을 제공할 수 있다8.
후기 발병 황반 퇴행성 질환인 황반 모세혈관확장증 II형(MacTel)은 일반적인 대사 결함에 합쳐지는 유전적으로 복잡한 신경퇴행성 질환의 좋은 예입니다. MacTel은 황반의 광수용체 및 뮐러 신경교 손실을 초래하여 중심 시력의 점진적인 상실을 초래하는 흔하지 않은 노화의 망막 퇴행성 질환입니다 9,10,11,12,13. MacTel에서 미확인, 아마도 다인성 유전은 환자의 순환 세린의 일반적인 감소를 유도하여 deoxysphingolipids(deoxySL)14,15라고 하는 신경독성 지질 종의 증가를 초래합니다. deoxySL의 축적이 망막에 독성이 있음을 증명하고 잠재적인 제약 치료제를 검증하기 위해, 본 발명자들은 인간 망막 오가노이드의 광수용체 독성을 분석하기 위해 이 프로토콜을 개발했다14.
여기에서는 인간 망막 오가노이드를 구별하고, 오가노이드를 사용하여 독성 및 구조 분석을 설정하고, 결과를 정량화하기 위한 특정 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 우리는 의심되는 질병 유발 물질인 deoxySL의 조직 특이적 독성을 결정하고 deoxySL 유발 망막 독성의 잠재적 치료를 위해 안전한 제네릭 약물인 페노피브레이트의 사용을 검증하는 성공적인 예를 제공합니다. 이전 연구에서는 페노피브레이트가 환자에서 deoxySL의 분해를 증가시키고 순환 deoxySL을 낮출 수 있음을 보여주었지만, deoxySL 유도 망막 독성을 감소시키는 효능은 테스트되지 않았습니다16,17. 구체적인 예를 제시하지만 이 프로토콜은 망막 조직에 대한 여러 대사/환경 스트레스 요인 및 잠재적인 치료 약물의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125mL Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-deoxysphinganine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver 6900 Mini-Blade</td>
			<td>Beaver-Visitec</td>
			<td>BEAVER6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>A32794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, Heat Inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45001-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenofibrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Recoverin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Plus- O.C.T. compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>62534-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield-mounting medium</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wax pen-ImmEdge</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery

오가노이드는 세포 배양의 다양성과 처리량을 통해 인간 조직의 맥락에서 직접 질병 메커니즘 및 치료법을 연구할 수 있는 유망한 플랫폼을 제공합니다. 성숙한 인간 망막 오가노이드는 노화 관련 망막 퇴행성 질환 황반 모세혈관확장증 2형(MacTel)에 대한 잠재적인 약물 치료법을 스크리닝하는 데 사용됩니다.
우리는 최근에 MacTel이 비정형 지질 종인 deoxysphingolipids (deoxySLs)의 상승 된 수준으로 인해 발생할 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 지질은 망막에 독성이 있으며 MacTel 환자에서 발생하는 광수용체 손실을 유발할 수 있습니다. deoxySL 광수용체 독성을 예방하는 능력에 대해 약물을 스크리닝하기 위해 비-MacTel 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 계통에서 인간 망막 오가노이드를 생성하고 기능적으로 성숙한 광수용체를 포함하여 망막의 모든 신경 계통 유래 세포를 발달시키는 유사분열 후 연령으로 성숙시켰습니다. 망막 오가노이드를 deoxySL 대사산물로 처리하고 면역조직화학을 사용하여 광수용체층 내에서 세포자멸사를 측정했습니다. 이 독성 모델을 사용하여 deoxySL 유도 광수용체 사멸을 방지하는 약리학적 화합물을 스크리닝했습니다. 표적 후보 접근법을 사용하여 고콜레스테롤 및 중성지방 치료를 위해 일반적으로 처방되는 약물인 페노피브레이트가 망막 세포에서 deoxySL 독성을 예방할 수 있음을 확인했습니다.
독성 스크리닝은 광수용체 사멸을 예방할 수 있는 FDA 승인 약물을 성공적으로 식별했습니다. 이것은 테스트된 질병 관련성이 높은 모델로 인해 직접 실행 가능한 결과입니다. 이 플랫폼은 망막 질환의 향후 치료 발견을 위해 여러 대사 스트레스 요인과 잠재적인 약리학적 개입을 테스트하도록 쉽게 수정할 수 있습니다.

망막 오가노이드는 비-MacTel 대조군 iPSC 라인으로부터 생성되었다. 오가노이드가 배양 26주에 도달한 후 선별되어 실험군으로 나뉩니다. 오가노이드는 다양한 농도의 deoxySA로 처리하여 deoxySA가 광수용체에 독성이 있는지 확인했습니다. 0에서 1 μM까지 4가지 농도의 deoxySA를 테스트하고(그림 2) 오가노이드를 8일 동안 처리했으며 격일로 배지를 교체했습니다. deoxySA에 대한 반응...

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Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

여기에서 우리는 성숙한 인간 망막 오가노이드를 생성하고 이를 광수용체 독성 분석에 활용하여 연령 관련 망막 퇴행성 질환 황반 모세혈관확장증 2형(MacTel)에 대한 제약 후보를 식별하는 단계별 프로토콜을 제시합니다.

제약 발견을 위한 인간 망막 오가노이드의 독성 스크리닝

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

이 프로토콜은 인간 망막 조직 내에서 직접 대사성 망막 질환에 대한 약물 치료법을 발견하고 검증하기 위한 전임상 접근 방식을 제공합니다. 이 기술은 인간 조직의 신진대사의 복잡성과 세포 배양의 다양성 및 처리량을 결합합니다. 우리는 이 분석을 사용하여 현재 임상 안전성 시험 중인 일반적이고 안전한 지질 변경 약물인 페노피브레이트를 사용하여 망막 퇴행성 질환인 MacTel의 치료를 위한 전임상 데이터를 수집했습니다.이 접근법은 영양 결핍, 저산소증, 빛 독성 및 기타 독성 지질을 포함하여 질병을 유발하는 여러 가지 일반적인 망막 스트레스 요인에 적용할 수 있습니다. 배양 24주차에 오가노이드 외부에 기초 분절이 형성되는지 확인합니다. 26 주에서 28 주까지, 바깥 쪽 세그먼트는 두꺼운 층을 형성해야합니다.두꺼워진 의심자 세그먼트가 관찰될 수 있을 때, 1밀리몰 데옥시SA 원액을 0.51로 희석한다. 3 밀리리터의 망막 분화 배지 플러스에서 1 및 2 마이크로 몰 농도. 해부 현미경과 멸균 프로브를 사용하여 그룹당 최소 5개의 오가노이드로 크기와 모양이 거의 동일한 4개의 오가노이드 그룹을 선택하고 그룹을 초저 부착 6웰 플레이트의 개별 웰로 분할합니다.모든 오가노이드가 수집되면 각 웰에서 가능한 한 많은 배지를 제거하고 각 웰에 한 농도의 deoxySA 용액을 추가합니다. 비히클 대조군을 오가노이드의 네 번째 그룹에 추가합니다. 2일간의 배양 후, 배양 상청액을 적절한 신선한 deoxySA 또는 대조 희석액으로 교체합니다.4일간의 배양 후 각 배양 내 세포 사멸을 평가할 수 있도록 표준 프로토콜에 따라 저온 절편을 삽입하고 오가노이드를 염색합니다. 염색 후, 5 - 10x 배율을 사용하여 손상되지 않고 잘 형성된 슬라이스된 오가노이드 섹션의 영역을 오가노이드의 대표 단면을 샘플링하는 평면에서 찾습니다. 이 절편에는 적어도 몇 개의 세포 두께의 광수용체의 뚜렷한 외부 핵층과 회복 및 염색이 없는 분리되고 뚜렷한 핵층이 있어야 합니다.이미지의 구도를 잡고 배율을 20배로 늘립니다. 그런 다음 슬라이드의 구도를 다시 잡아 이미지를 가능한 한 많은 광수용체 층으로 채웁니다. Z 평면을 설정하고 Z 범위의 상한 하한을 설정하여 슬라이스의 전체 깊이를 이미지화합니다.그런 다음 Z 스택 획득에서 형광단의 3개 채널을 모두 이미징하고 픽셀당 면적 비율을 유지하는 파일 형식으로 이미지를 저장합니다. 각 샘플에서 죽은 세포의 수를 정량화하려면 피지에서 이미지 스택을 엽니다. 바이오 형식의 가져오기 옵션 창에서 별도의 창으로 분할 섹션 아래의 상자가 선택되어 있지 않은지 확인하고 이미지, 스택 및 Z 프로젝트를 선택하여 정량화를 위한 새 이미지를 만듭니다.복구 및 염색을 보여주는 이미지 채널을 선택하고 다각형 선택 도구를 사용하여 이미지에서 광수용체의 연속 영역을 윤곽을 그립니다. 측정 분석 및 설정을 클릭하고 영역 상자를 선택합니다. Analyze and Measure(분석 및 측정)를 클릭하여 광수용체의 면적을 측정하고 죽어가는 세포의 수를 계산합니다.측정값이 팝업 창에 나타납니다. 선택한 광수용체 영역에서 세포자멸사 양성 핵을 계산하려면 점 도구를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 다점 도구를 선택하고 DAPI 양성 핵과 겹치는 세포자멸사 양성 염색을 선택하고 복구 및 염색합니다. 채널 사이를 전환하여 양성 셀의 유효성을 검사합니다.그 후 세포사멸 양성 세포의 수를 면적별로 나누어 오가노이드 당 광수용체 내 세포 사멸에 대한 정규화된 값을 구한다. 표적 세포 사멸을 유도하는 deoxySA 농도를 결정한 후 멸균 프로브를 사용하여 그룹당 최소 5개의 오가노이드로 거의 동일한 크기와 모양의 오가노이드 3개 그룹을 선택합니다. 그리고 그룹을 초저 부착 6-웰 플레이트의 개별 웰에 추가합니다.관심 약물 또는 대조 배지로 보충된 deoxySA의 표적 세포사 농도, 표적 세포사 농도인 deoxySA를 적절한 웰 또는 오가노이드에 추가합니다. 2일 후, 각 웰 내의 상청액을 적절한 농도의 새로운 처리 또는 대조 배지로 교체한다. 4일간의 배양 후, 입증된 바와 같이 세포 사멸에 대한 배양물을 평가합니다.이러한 대표적인 분석에서, 비황반 모세혈관확장증 제2형 대조군 유도만능줄기세포주로부터 생성된 망막 오가노이드를 4가지 농도의 deoxySA로 처리하였다. deoxySA에 대한 반응으로 세포 사멸은 농도 의존적이었고 50나노몰 deoxySA에서 검출할 수 있었습니다. 테스트된 최고 농도는 망막 오가노이드의 무결성을 유지하면서 강력한 세포 사멸을 유도했습니다.20마이크로몰 페노피브레이트로 처리하면 망막 오가노이드의 광수용체에서 deoxySA 유도 독성이 방지되어 치료 4일 후 세포 사멸이 약 80% 감소했습니다. 망막 세포에서 분석이 수행되고 있는지 확인하기 위해 잘 형성되고 건강한 오가노이드를 선택하는 것을 잊지 마십시오. 오가노이드는 RNA 수집을 위해 처리되어 유전자 발현을 정량화할 수 있으므로 스트레스 신호를 평가하고 독성 효과 및 구조를 검증할 수 있습니다.이 기술을 사용하여 우리는 오가노이드에서 여러 다른 지질의 다운스트림 대사를 분석할 수 있었고, 인간 망막의 지질 대사에 대한 연구를 시작할 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

생물 학적 시스템에서 이온 농도의 측정을위한 형광 Nanoparticles

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

연구

생체공학

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT : 바이오 매스의 효소 발견과 칵테일 최적화를위한 자동 플랫폼

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

표피 성장 인자를 사용하여 인간의 췌장 암 세포의 유전자 전달 및 Transfection은 다행 기반 엔지니어링된 Nanovectors를 수용체 타겟

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

루시퍼 옐로우 - 인간 혈액-뇌 장벽의 세포 모델에서 강력한 파라셀룰러 투과성 마커

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...