Name: toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

Støttet av Lowy Medical Research Institute. Vi vil gjerne takke Lowy-familien for deres støtte til MacTel-prosjektet. Vi takker Mari Gantner, Mike Dorrell og Lea Scheppke for intellektuelle innspill og hjelp til å forberede manuskriptet.

1. Tine, passere og utvide iPSC-er/ESC-er
MERK: For alle celledyrkingstrinn, bruk beste praksis for å opprettholde en steril cellekultur.
<ol><li>Belegg en 6-brønns cellekulturplate med kjellermembranmatrisemedium.<ol><li>For å forberede 1x av dette mediet, følg produktspesifikasjonene eller fortynn 75 μL kaldmatriksmedium med 9 ml DMEM / F12. Tilsett 1,5 ml nylaget 1x medium per brønn i en 6-brønns plate. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter.</li>
		<li>Aspirer av matriksmediet i kjeller...

<ol>
	<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development.">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li><li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down,+mice+are+not+just+small+humans.">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 39-44 (2005).</li><li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina.">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+retinal+development+and+disease+with+human+pluripotent+stem+cells.">Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).</li><li>Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+pathways+in+neurodegeneration,+from+genetics+to+mechanisms.">Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).</li><li>Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+estimates+of+macular+telangiectasia+type+2:+the+Melbourne+collaborative+cohort+study.">The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study.</a> Retina. 30 (3), 473-478 (2010).</li><li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+retinal+neurodegeneration+in+patients+with+macular+telangiectasia+type+2:+A+randomized+clinical+trial.">Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial.</a> Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).</li><li>Gass, J. D., Blodi, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study.">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li><li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study.">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Muller's+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2.">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li><li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy.">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li><li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2.">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li><li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway.">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li><li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients:+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy.">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li><li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields.">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).</li></ol>

Variasjoner i differensieringsprotokoll Siden oppfinnelsen av selvformende optiske kopper av Yoshiki Sasais gruppe20, har mange laboratorier utviklet protokoller for å generere retinale organoider som kan variere i nesten hvert trinn 5,18,19,21. En uttømmende liste over protokoller finnes i Capowski et al.22. Differensierings...

Modellering av menneskelig sykdom i cellekultur og dyremodeller har gitt uvurderlige verktøy for oppdagelse, modifikasjon og validering av farmakologiske terapier, slik at de kan gå videre fra kandidatmedisin til godkjent terapi. Selv om en kombinasjon av in vitro og ikke-humane in vivo-modeller lenge har vært en kritisk komponent i legemiddelutviklingsrørledningen, klarer de ofte ikke å forutsi den kliniske ytelsen til nye legemiddelkandidater1. Det er et klart behov for utvikling av teknologier som bygger bro over gapet mellom forenklede humane cellulære monokulturer og kliniske studier. Nylige teknologiske fremskritt i selvorganiserte tredimensjonale vevskulturer, organoider, har forbedret deres troskap til vevene de modellerer, noe som gjør dem lovende verktøy i den prekliniske legemiddelutviklingsrørledningen2.
En stor fordel med menneskelig cellekultur over ikke-menneskelige in vivo-modeller er evnen til å replikere de spesifikke vanskelighetene med menneskelig metabolisme, som kan variere betydelig selv mellom høyere ordens vertebrater som mennesker og mus3. Imidlertid kan denne spesifisiteten overskygges av et tap i vevskompleksitet; Slik er tilfellet for retinalvev der flere celletyper er intrikat sammenvevd og har et unikt symbiotisk metabolsk samspill mellom cellulære subtyper som ikke kan replikeres i en monokultur4. Humane organoider, som gir en faksimile av komplekse menneskelige vev med tilgjengeligheten og skalerbarheten til cellekultur, har potensial til å overvinne manglene i disse sykdomsmodelleringsplattformene.
Retinale organoider avledet fra stamceller har vist seg å være spesielt trofaste i modellering av det komplekse vevet i den menneskelige nevrale netthinnen5. Dette har gjort retinal organoid modellen til en lovende teknologi for studier og behandling av retinal sykdom 6,7. Hittil har mye av sykdomsmodelleringen i retinale organoider fokusert på monogene retinale sykdommer der retinale organoider er avledet fra iPSC-linjer med sykdomsfremkallende genetiske varianter7. Dette er generelt svært penetrante mutasjoner som manifesterer seg som utviklingsfenotyper. Mindre arbeid har blitt effektivt gjort på aldrende sykdommer der genetiske mutasjoner og miljømessige stressorer påvirker vev som har utviklet seg normalt. Neurodegenerative sykdommer i aldring kan ha kompleks genetisk arv og bidrag fra miljøstressorer som iboende er vanskelige å modellere ved hjelp av kortsiktige cellekulturer. Imidlertid kan disse komplekse sykdommene i mange tilfeller samle seg på vanlige cellulære eller metabolske stressorer som, når de testes på et fullt utviklet menneskelig vev, kan gi kraftig innsikt i nevrodegenerative sykdommer i aldring8.
Den makulære degenerative sykdommen med sen oppstart, makulærtelangiektasi type II (MacTel), er et godt eksempel på en genetisk kompleks nevrodegenerativ sykdom som samler seg på en felles metabolsk defekt. MacTel er en uvanlig retinal degenerativ sykdom av aldring som resulterer i fotoreceptor og Müller glia tap i makulaen, noe som fører til et progressivt tap i sentralvisjon 9,10,11,12,13. I MacTel driver en ubestemt, muligens multifaktoriell, genetisk arv en vanlig reduksjon i sirkulerende serin hos pasienter, noe som resulterer i en økning i en nevrotoksisk lipidart kalt deoksysfingolipider (deoksySL)14,15. For å bevise at akkumulering av deoksySL er giftig for netthinnen og for å validere potensielle farmasøytiske terapier, utviklet vi denne protokollen for å analysere fotoreceptortoksisitet i humane retinale organoider14.
Her skisserer vi en spesifikk protokoll for å differensiere humane retinale organoider, etablere en toksisitets- og redningsanalyse ved bruk av organoider og kvantifisere utfall. Vi gir et vellykket eksempel der vi bestemmer vevsspesifikk toksisitet av et mistenkt sykdomsfremkallende middel, deoksySL, og validerer bruken av et trygt generisk legemiddel, fenofibrat, for potensiell behandling av deoksySL-indusert retinal toksisitet. Tidligere arbeid har vist at fenofibrat kan øke nedbrytningen av deoksySL og lavere sirkulerende deoksySL hos pasienter, men effekten i å redusere deoksySL-indusert retinal toksisitet er ikke testet16,17. Selv om vi presenterer et spesifikt eksempel, kan denne protokollen brukes til å evaluere effekten av et hvilket som helst antall metabolske / miljømessige stressorer og potensielle terapeutiske legemidler på retinalvev.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125mL Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-deoxysphinganine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver 6900 Mini-Blade</td>
			<td>Beaver-Visitec</td>
			<td>BEAVER6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>A32794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, Heat Inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45001-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenofibrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Recoverin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Plus- O.C.T. compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>62534-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield-mounting medium</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wax pen-ImmEdge</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery

Organoider gir en lovende plattform for å studere sykdomsmekanisme og behandlinger, direkte i sammenheng med menneskelig vev med allsidighet og gjennomstrømning av cellekultur. Eldre humane retinale organoider brukes til å skjerme potensielle farmasøytiske behandlinger for den aldersrelaterte retinal degenerative sykdommen makulærtelangiektasi type 2 (MacTel).
Vi har nylig vist at MacTel kan skyldes forhøyede nivåer av en atypisk lipidart, deoksysfingolipider (deoksySLer). Disse lipidene er giftige for netthinnen og kan drive fotoreceptortapet som oppstår hos MacTel-pasienter. For å screene medisiner for deres evne til å forhindre deoksySL-fotoreceptortoksisitet, genererte vi humane retinale organoider fra en ikke-MacTel-indusert pluripotent stamcellelinje (iPSC) og modnet dem til en postmitotisk alder hvor de utvikler alle de neuronale avstamningsavledede cellene i netthinnen, inkludert funksjonelt modne fotoreceptorer. Netthinneorganoidene ble behandlet med en deoksySL-metabolitt og apoptose ble målt i fotoreseptorlaget ved hjelp av immunhistokjemi. Ved hjelp av denne toksisitetsmodellen ble farmakologiske forbindelser som forhindrer deoksySL-indusert fotoreseptordød screenet. Ved hjelp av en målrettet kandidattilnærming bestemte vi oss for at fenofibrat, et legemiddel som vanligvis foreskrives for behandling av høyt kolesterol og triglyserider, også kan forhindre deoksySL-toksisitet i cellene i netthinnen.
Toksisitetsskjermen identifiserte vellykket et FDA-godkjent legemiddel som kan forhindre fotoreceptordød. Dette er et direkte handlingsbart funn på grunn av den svært sykdomsrelevante modellen som er testet. Denne plattformen kan enkelt modifiseres for å teste et hvilket som helst antall metabolske stressorer og potensielle farmakologiske inngrep for fremtidig behandlingsoppdagelse i retinale sykdommer.

Retinale organoider ble generert fra en ikke-MacTel kontroll iPSC-linje. Etter at organoider nådde 26 uker i kultur, ble de valgt og delt inn i eksperimentelle grupper. Organoider ble behandlet med varierende konsentrasjoner av deoksySA for å avgjøre om deoksySA er giftig for fotoreseptorer. Fire konsentrasjoner av deoksySA ble testet, fra 0 til 1 μM (figur 2) og organoider ble behandlet i 8 dager, med medieforandringer annenhver dag. Celledød som respons på deoksySA er konsentrasjonsa...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Her presenterer vi en trinnvis protokoll for å generere modne humane retinale organoider og bruke dem i en fotoreceptortoksisitetsanalyse for å identifisere farmasøytiske kandidater for den aldersrelaterte retinale degenerative sykdommen makulærtelangiektasi type 2 (MacTel).

Toksisitetsskjermer i humane retinale organoider for farmasøytisk oppdagelse

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Denne protokollen gir en preklinisk tilnærming til å oppdage og validere farmasøytiske behandlinger for metabolske retinale sykdommer direkte i humant retinalt vev. Denne teknikken kombinerer kompleksiteten av metabolisme i humant vev med allsidigheten og gjennomstrømningen av cellekultur. Vi har brukt denne analysen til å skaffe prekliniske data for behandling av retinal degenerativ sykdom, MacTel, ved bruk av et vanlig og sikkert lipidendrende legemiddel, fenofibrat, som nå er i kliniske sikkerhetsstudier.Denne tilnærmingen kan brukes på et hvilket som helst antall vanlige retinale stressorer som fører til sykdom, inkludert næringsmangel, hypoksi, lystoksisitet og andre giftige lipider. I uke 24 av kulturen, kontroller organoider for dannelse av rudimentære segmenter på utsiden av organoiden. I uke 26 til 28 skal de ytre segmentene ha dannet et tykt lag.Når et fortykket tvilssegment kan observeres, fortynn en millimolar deoksySA-stamløsning til 0,51. En og to mikromolære konsentrasjoner i tre milliliter retinal differensieringsmedium pluss. Ved hjelp av et disseksjonsmikroskop og en steril sonde, velg fire grupper organoider av omtrent samme størrelse og form med minst fem organoider per gruppe, og del gruppene i individuelle brønner med en 6-brønnsplate med ultralavt vedlegg.Når alle organoidene er samlet, fjern så mye medium fra hver brønn som mulig og tilsett en konsentrasjon av deoksySA-løsningen til hver brønn. Legg kjøretøykontrollen til den fjerde gruppen organoider. Etter to dager med kultur, erstatt kultursupernatantene med passende fersk deoksySA eller kontrollfortynning.Etter fire dager med kultur, legg inn kryoseksjonen og flekk organoidene i henhold til standardprotokoller for å tillate vurdering av celledød i hver kultur. Etter farging, bruk en fem til 10x forstørrelse for å finne et område av den skivede organoidseksjonen som er intakt, godt dannet og i et plan som prøver et representativt tverrsnitt av organoiden. Seksjonen skal ha et distinkt ytre kjernefysisk lag av fotoreseptorer som er minst noen få celler tykt, og et separat og distinkt lag av kjerner som ikke har gjenoppretting og farging.Ram inn bildet, og øk forstørrelsen til 20x. Deretter rammer du inn lysbildet igjen for å fylle bildet med så mye av fotoreseptorlaget som mulig. Still inn Z-planet og angi den øvre enden av nedre grenser for Z-området for å vise hele dybden av stykket.Avbilde deretter alle tre fluoroforkanalene i et Z-stack-oppkjøp, og lagre bildet i et filformat som bevarer forholdet mellom areal per piksel. Hvis du vil kvantifisere antall døde celler i hver prøve, åpner du bildestakkene på Fiji. I bioformatets importalternativvindu bekrefter du at ingen bokser under delen delt inn i separate vinduer er merket av, og velger Bilde, Stabler og Z-prosjekt for å lage et nytt bilde for kvantifisering.Velg bildekanalen som viser gjenoppretting og farging, og bruk mangekantmarkeringsverktøyet til å skissere et kontinuerlig område av fotoreseptorer i bildet. Klikk Analyser og angi mål, og merk av for Areal. Klikk Analyser og mål, for å måle arealet av fotoreceptorene, for å telle de døende cellene.Målingen vises i et popup-vindu. For å telle apoptosepositive kjerner i den valgte fotoreceptorregionen, høyreklikk på punktverktøyet for å velge flerpunktsverktøyet og velg apoptosepositiv farging som overlapper med en DAPI positive kjerner og gjenopprette og farging. Veksle mellom kanalene for å validere de positive cellene.Del deretter antall apoptosepositive celler med området for å oppnå en normalisert verdi for celledød i fotoreceptorene per organoid. Etter å ha bestemt deoksySA-konsentrasjonen som induserer målcelledød, bruk en steril sonde for å velge tre grupper organoider av omtrent samme størrelse og form med minst fem organoider per gruppe. Og legg gruppene til individuelle brønner med en 6-brønnsplate med ultralavt vedlegg.Legg til målcelledødskonsentrasjonen av deoksySA, målcelledødskonsentrasjonen av deoksySA supplert med det aktuelle stoffet av interesse eller kontrollmediet til riktig brønn eller organoider. Etter to dager erstattes supernatanten i hver brønn med riktig konsentrasjon av nytt behandlings- eller kontrollmedium. Etter fire dager med kultur, vurder kulturene for celledød som demonstrert.I denne representative analysen ble retinale organoider generert fra en ikke-makulær-telangiektasi type 2-kontrollindusert pluripotent stamcellelinje behandlet med fire konsentrasjoner av deoksySA. Celledød som respons på deoksySA var konsentrasjonsavhengig og påviselig i så lite som 50 nanomolar deoxySA. Den høyeste konsentrasjonen som ble testet, induserte en robust celledød samtidig som retinalorganoidens integritet ble opprettholdt.Behandling med 20 mikromolær fenofibrat forhindret deoksySA-indusert toksisitet i fotoreseptorene til retinale organoider, noe som signifikant reduserte celledød med ca. 80% etter fire dagers behandling. Husk å velge velformede og sunne organoider for å sikre at analysen utføres i retinale celler. Organoidene kan behandles for RNA-innsamling for å kvantifisere genuttrykk, slik at evaluering av stresssignaler og validering av toksiske effekter og redninger.Ved hjelp av denne teknikken har vi vært i stand til å analysere nedstrøms metabolisme av flere forskjellige lipider i organoider, og åpnet studien av lipidmetabolisme i humane netthinner.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: en Automated Plattform for Biomasse enzym Discovery og Cocktail Optimization

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Gene Levering og Transfeksjon i Human kreft i bukspyttkjertelen celler ved hjelp av epidermal vekstfaktorreseptor målrettede Gelatin-Based Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Lavmolekylært Protein berikelse på mesoporous silika Thin Films for biomarkører

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolering av primære murin retinale Ganglion-celler (RGCer) ved Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic Bioprinting for utvikling Stangeriaceae vev og Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Repressing Gene transkripsjon av omadresserer cellulære maskiner med kjemiske Epigenetic modifikatorer

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer Yellow-en robust paracellular permeabilitet markør i en celle modell av Human Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...