Name: toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00
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Apoiado pelo Lowy Medical Research Institute. Gostaríamos de agradecer à família Lowy por seu apoio ao projeto MacTel. Gostaríamos de agradecer a Mari Gantner, Mike Dorrell e Lea Scheppke por sua contribuição intelectual e assistência na preparação do manuscrito.

1. Descongelamento, passagem e expansão de iPSCs/ESCs
NOTA: Para todas as etapas de cultivo de células, use as práticas recomendadas para manter uma cultura de células estéril.
<ol><li>Revestir uma placa de cultura celular de 6 poços com meio de matriz de membrana basal.<ol><li>Para preparar 1x deste meio, siga as especificações do produto ou dilua 75 μL de meio de matriz fria com 9 mL de DMEM/F12. Adicionar 1,5 mL de 1x meio recém-preparado por poço em uma placa de 6 poços. Incu...

<ol>
	<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development.">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li><li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down,+mice+are+not+just+small+humans.">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 39-44 (2005).</li><li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina.">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li><li>Cowan, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study.">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li><li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study.">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Muller's+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2.">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li><li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy.">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li><li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2.">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li><li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway.">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li><li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients:+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy.">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li><li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields.">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).</li></ol>

Variações do protocolo de diferenciação Desde a invenção das taças ópticas autoformadoras pelo grupo de YoshikiSasai20, muitos laboratórios desenvolveram protocolos para gerar organoides da retina que podem variar em quase todas as etapas5,18,19,21. Uma lista exaustiva de protocolos pode ser encontrada em Capowski et al.22</...

A modelagem de doenças humanas em cultura de células e modelos animais tem fornecido ferramentas inestimáveis para a descoberta, modificação e validação de terapêuticas farmacológicas, permitindo que elas avancem de uma droga candidata para uma terapia aprovada. Embora uma combinação de modelos in vitro e in vivo não humanos tenha sido um componente crítico do pipeline de desenvolvimento de fármacos, eles frequentemente falham em prever o desempenho clínico de novos candidatos a fármacos1. Há uma clara necessidade de desenvolvimento de tecnologias que preencham a lacuna entre monoculturas celulares humanas simplistas e ensaios clínicos. Avanços tecnológicos recentes em culturas tridimensionais auto-organizadas de tecidos, organoides, têm melhorado sua fidelidade aos tecidos por eles modelados, tornando-os ferramentas promissoras no pipeline de desenvolvimento pré-clínico de fármacos2.
Uma grande vantagem da cultura de células humanas sobre modelos in vivo não humanos é a capacidade de replicar os meandros específicos do metabolismo humano, que podem variar consideravelmente mesmo entre vertebrados de ordem superior, como humanos e camundongos3. No entanto, essa especificidade pode ser ofuscada pela perda de complexidade tecidual; É o caso do tecido da retina, onde vários tipos celulares estão intrinsecamente entrelaçados e têm uma interação metabólica simbiótica única entre subtipos celulares que não podem ser replicados em monocultura4. Os organoides humanos, que fornecem um fac-símile de tecidos humanos complexos com a acessibilidade e escalabilidade da cultura celular, têm o potencial de superar as deficiências dessas plataformas de modelagem de doenças.
Organoides da retina derivados de células-tronco têm se mostrado particularmente fiéis na modelagem do complexo tecido da retina neural humana5. Isso tornou o modelo organoide da retina uma tecnologia promissora para o estudo e tratamento das doençasretinianas6,7. Até o momento, grande parte da modelagem da doença em organoides da retina tem se concentrado em doenças retinianas monogênicas, onde organoides da retina são derivados de linhagens iPSC com variantes genéticas causadoras de doenças7. Estas são geralmente mutações altamente penetrantes que se manifestam como fenótipos de desenvolvimento. Menos trabalho tem sido efetivamente feito em doenças do envelhecimento onde mutações genéticas e estressores ambientais afetam o tecido que se desenvolveu normalmente. As doenças neurodegenerativas do envelhecimento podem ter herança genética complexa e contribuições de estressores ambientais que são inerentemente difíceis de modelar usando culturas de células de curto prazo. No entanto, em muitos casos, essas doenças complexas podem coalescer em estressores celulares ou metabólicos comuns que, quando testados em um tecido humano totalmente desenvolvido, podem fornecer informações poderosas sobre as doenças neurodegenerativas do envelhecimento8.
A doença degenerativa macular de início tardio, telangiectasia macular tipo II (MacTel), é um grande exemplo de uma doença neurodegenerativa geneticamente complexa que coalesce em um defeito metabólico comum. MacTel é uma doença degenerativa retiniana incomum do envelhecimento que resulta em perda de fotorreceptores e glia de Müller na mácula, levando a uma perda progressiva da visão central9,10,11,12,13. No MacTel, uma herança genética indeterminada, possivelmente multifatorial, conduz a uma redução comum da serina circulante nos pacientes, resultando em um aumento de uma espécie lipídica neurotóxica denominada desoxiesfingolipídios (deoxiSL)14,15. Para provar que o acúmulo de desoxisSL é tóxico para a retina e validar potenciais terapêuticas farmacêuticas, desenvolvemos este protocolo para avaliar a toxicidade de fotorreceptores em organoides da retina humana14.
Aqui delineamos um protocolo específico para diferenciar organoides da retina humana, estabelecer um ensaio de toxicidade e resgate usando organoides e quantificar os resultados. Fornecemos um exemplo bem-sucedido onde determinamos a toxicidade tecido-específica de um agente suspeito de causar doença, o deoxySL, e validamos o uso de um medicamento genérico seguro, o fenofibrato, para o tratamento potencial da toxicidade retiniana induzida pelo desoxySL. Trabalhos anteriores mostraram que o fenofibrato pode aumentar a degradação do desoxySL e diminuir o deoxySL circulante em pacientes, no entanto, sua eficácia em reduzir a toxicidade retiniana induzida pelo deoxySL não foi testada16,17. Embora apresentemos um exemplo específico, este protocolo pode ser utilizado para avaliar o efeito de qualquer número de estressores metabólicos/ambientais e potenciais drogas terapêuticas sobre o tecido retiniano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125mL Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-deoxysphinganine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver 6900 Mini-Blade</td>
			<td>Beaver-Visitec</td>
			<td>BEAVER6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>A32794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, Heat Inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45001-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenofibrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Recoverin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Plus- O.C.T. compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>62534-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield-mounting medium</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wax pen-ImmEdge</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery

Os organoides fornecem uma plataforma promissora para estudar o mecanismo e os tratamentos de doenças, diretamente no contexto do tecido humano com a versatilidade e rendimento da cultura celular. Organoides da retina humana madura são utilizados para rastrear potenciais tratamentos farmacêuticos para a doença degenerativa retiniana relacionada à idade telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).
Recentemente, demonstramos que MacTel pode ser causado por níveis elevados de uma espécie lipídica atípica, os desoxiesfingolipídios (deoxySLs). Esses lipídios são tóxicos para a retina e podem conduzir a perda de fotorreceptores que ocorre em pacientes com MacTel. Para rastrear drogas quanto à sua capacidade de prevenir a toxicidade dos fotorreceptores desoxiSL, geramos organoides da retina humana a partir de uma linhagem de células-tronco pluripotentes (iPSC) não induzida por MacTel e os amadurecemos até uma idade pós-mitótica, onde eles desenvolvem todas as células derivadas da linhagem neuronal da retina, incluindo fotorreceptores funcionalmente maduros. Os organoides da retina foram tratados com um metabólito deoxySL e a apoptose foi medida dentro da camada fotorreceptora usando imunohistoquímica. Usando este modelo de toxicidade, compostos farmacológicos que previnem a morte dos fotorreceptores induzidos por desoxiSL foram triados. Usando uma abordagem candidata direcionada, determinamos que o fenofibrato, um medicamento comumente prescrito para o tratamento de colesterol e triglicérides elevados, também pode prevenir a toxicidade do desoxiSL nas células da retina.
A triagem de toxicidade identificou com sucesso uma droga aprovada pela FDA que pode prevenir a morte de fotorreceptores. Este é um achado diretamente acionável devido ao modelo altamente relevante para a doença testado. Esta plataforma pode ser facilmente modificada para testar qualquer número de estressores metabólicos e potenciais intervenções farmacológicas para futuras descobertas de tratamento em doenças da retina.

Os organoides da retina foram gerados a partir de uma linha iPSC não-controle MacTel. Após os organoides atingirem 26 semanas de cultura, eles foram selecionados e divididos em grupos experimentais. Os organoides foram tratados com concentrações variáveis de deoxySA para determinar se a desoxiSA é tóxica para fotorreceptores. Quatro concentrações de deoxySA foram testadas, de 0 a 1 μM (Figura 2) e organoides foram tratados por 8 dias, com trocas de meios a cada dois dias. A morte c...

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Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Aqui apresentamos um protocolo passo-a-passo para gerar organoides humanos maduros da retina e utilizá-los em um ensaio de toxicidade de fotorreceptores para identificar candidatos farmacêuticos para a doença degenerativa retiniana relacionada à idade telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).

Rastreios de toxicidade em organoides da retina humana para descoberta farmacêutica

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Este protocolo fornece uma abordagem pré-clínica para descobrir e validar tratamentos farmacêuticos para as doenças metabólicas da retina diretamente no tecido retiniano humano. Esta técnica combina a complexidade do metabolismo em tecidos humanos com a versatilidade e rendimento da cultura celular. Usamos este ensaio para obter dados pré-clínicos para o tratamento da doença degenerativa da retina, MacTel, usando uma droga comum e segura que altera os lipídios, o fenofibrato, que está agora em ensaios clínicos de segurança.Essa abordagem pode ser aplicada a qualquer número de estressores comuns da retina que levam a doenças, incluindo deficiência de nutrientes, hipóxia, toxicidade por luz e outros lipídios tóxicos. Na semana 24 de cultura, verifique os organoides para a formação de segmentos rudimentares na parte externa do organoide. Na semana 26 a 28, os segmentos externos devem ter formado uma camada espessa.Quando for possível observar um segmento duvidoso espessado, diluir uma solução-estoque milimolar de desoxiSA para 0,51. Concentrações de um e dois micromolares em três mililitros de meio de diferenciação retiniana plus. Usando um microscópio de dissecção e uma sonda estéril, selecione quatro grupos de organoides de aproximadamente o mesmo tamanho e forma, com um mínimo de cinco organoides por grupo, e divida os grupos em poços individuais de uma placa de 6 poços de fixação ultrabaixa.Quando todos os organoides tiverem sido coletados, remova o máximo possível de meio de cada poço e adicione uma concentração da solução de deoxySA a cada poço. Adicione o controle do veículo ao quarto grupo de organoides. Após dois dias de cultivo, substituir os sobrenadantes da cultura pelo desoxiSA fresco apropriado ou diluição controle.Após quatro dias de cultura, incorporar criosecção e corar os organoides de acordo com protocolos padronizados para permitir a avaliação da morte celular dentro de cada cultura. Após a coloração, use um aumento de cinco a 10x para localizar uma região do corte organoide fatiada que esteja intacta, bem formada e em um plano que apareça uma seção transversal representativa do organoide. A seção deve ter uma camada nuclear externa distinta de fotorreceptores que tenha pelo menos algumas células de espessura, e uma camada separada e distinta de núcleos que não tenham recuperação e coloração.Enquadre a imagem e aumente a ampliação para 20x. Em seguida, enquadre o slide novamente para preencher a imagem com o máximo possível da camada fotorreceptora. Defina o plano Z e defina os limites inferiores superiores do intervalo Z para obter uma imagem de toda a profundidade da fatia.Em seguida, crie imagens de todos os três canais de fluoróforo em uma aquisição de pilha Z e salve a imagem em um formato de arquivo que preserve a proporção de área por pixel. Para quantificar o número de células mortas em cada amostra, abra as pilhas de imagens em Fiji. Na janela de opções de importação do formato bio, confirme se nenhuma caixa na seção dividir em janelas separadas está marcada e selecione Imagem, Pilhas e Projeto Z para criar uma nova imagem para quantificação.Selecione o canal de imagem que mostra a recuperação e coloração e use a ferramenta de seleção de polígonos para delinear uma região contínua de fotorreceptores na imagem. Clique em Analisar e definir medidas e selecione a caixa Área. Clique em Analisar e Medir, para medir a área dos fotorreceptores, para contar as células moribundas.A medida aparecerá em uma janela pop-up. Para contar os núcleos positivos para apoptose na região fotorreceptora selecionada, clique com o botão direito do mouse na ferramenta de ponto para selecionar a ferramenta multiponto e selecione a coloração positiva de apoptose que se sobrepõe a um núcleo positivo para DAPI e se recupera e colore. Alterne entre os canais para validar as células positivas.Em seguida, divida o número de células positivas para apoptose pela área para obter um valor normalizado para a morte celular dentro dos fotorreceptores por organoide. Depois de determinar a concentração de desoxiSA que induz a morte celular alvo, use uma sonda estéril para selecionar três grupos de organoides de aproximadamente o mesmo tamanho e forma, com um mínimo de cinco organoides por grupo. E adicione os grupos a poços individuais de uma placa de 6 poços de fixação ultrabaixa.Adicione a concentração de morte celular alvo de deoxySA, a concentração de morte celular alvo de deoxySA suplementada com a droga de interesse ou o meio de controle ao poço ou organoides apropriados. Após dois dias, substituir o sobrenadante em cada poço pela concentração adequada de tratamento a fresco ou meio controle. Após quatro dias de cultura, avaliar as culturas quanto à morte celular demonstrada.Nesta análise representativa, organoides da retina gerados a partir de uma linhagem de células-tronco pluripotentes induzidas por telangiectasias não maculares tipo 2 foram tratados com quatro concentrações de deoxySA. A morte celular em resposta à desoxiSA foi dependente da concentração e detectável em até 50 nanomolares de desoxiSA. A maior concentração testada induziu uma morte celular robusta, mantendo a integridade do organoide da retina.O tratamento com fenofibrato 20 micromolares preveniu a toxicidade induzida pelo desoxiSA nos fotorreceptores dos organoides da retina, reduzindo significativamente a morte celular em aproximadamente 80% após quatro dias de tratamento. Lembre-se de selecionar organoides bem formados e saudáveis para garantir que o ensaio esteja sendo realizado nas células da retina. Os organoides podem ser processados para coleta de RNA para quantificar a expressão gênica, permitindo a avaliação de sinais de estresse e a validação de efeitos tóxicos e resgates.Usando esta técnica, pudemos testar o metabolismo a jusante de múltiplos lipídios diferentes em organoides, abrindo o estudo do metabolismo lipídico em retinas humanas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Nanopartículas fluorescentes para a medição da concentração de íons em Sistemas Biológicos

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Bioengenharia

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: uma plataforma automatizada para Discovery Biomassa Enzima e Otimização Cocktail

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Entrega de genes e Transfection em células pancreáticas humanas Cancer usando Fator de Crescimento Epidérmico Receptor-alvo à base de gelatina Nanovectors Engineered

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Enriquecimento protéico de baixo peso molecular em filmes finos de sílica mesoporosa para a descoberta de biomarcadores

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

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Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...