Name: toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

При поддержке Медицинского научно-исследовательского института Лоуи. Мы хотели бы поблагодарить семью Лоуи за поддержку проекта MacTel. Мы хотели бы поблагодарить Мари Гантнер, Майка Доррелла и Леа Шеппке за их интеллектуальный вклад и помощь в подготовке рукописи.

1. Размораживание, пропускание и расширение ИПСК/ЭСК
ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех этапов культивирования клеток используйте лучшие практики для поддержания стерильной клеточной культуры.
<ol><li>Покройте 6-луночную клеточную культуральную пластину матричной средой базальной мем...

<ol>
	<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development.">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li><li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down,+mice+are+not+just+small+humans.">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 39-44 (2005).</li><li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina.">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution.">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Kruczek, K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids+for+disease+modeling+and+development+of+therapies.">Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies.</a> Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).</li><li>Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+retinal+development+and+disease+with+human+pluripotent+stem+cells.">Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).</li><li>Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+pathways+in+neurodegeneration,+from+genetics+to+mechanisms.">Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).</li><li>Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+estimates+of+macular+telangiectasia+type+2:+the+Melbourne+collaborative+cohort+study.">The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study.</a> Retina. 30 (3), 473-478 (2010).</li><li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ciliary+neurotrophic+factor+on+retinal+neurodegeneration+in+patients+with+macular+telangiectasia+type+2:+A+randomized+clinical+trial.">Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial.</a> Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).</li><li>Gass, J. D., Blodi, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study.">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li><li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study.">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Muller's+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2.">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li><li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy.">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li><li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2.">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li><li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway.">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li><li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients:+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy.">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li><li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields.">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).</li></ol>

Вариации протокола дифференциации С момента изобретения самоформирующихся оптических чашек группой20 Йошики Сасаи многие лаборатории разработали протоколы для генерации органоидов сетчатки, которые могут изменяться почти на каждом этапе 5,18,19,21.<su...

Моделирование заболеваний человека на клеточных культурах и животных моделях предоставило бесценные инструменты для открытия, модификации и проверки фармакологических терапевтических средств, что позволило им перейти от препарата-кандидата к одобренной терапии. Несмотря на то, что комбинация моделей in vitro и нечеловеческих моделей in vivo уже давно является важнейшим компонентом процесса разработки лекарств, они часто не могут предсказать клиническую эффективность новых кандидатов на лекарства1. Существует очевидная потребность в разработке технологий, которые устранят разрыв между упрощенными клеточными монокультурами человека и клиническими испытаниями. Последние технологические достижения в области самоорганизующихся трехмерных тканевых культур, органоидов, улучшили их точность к тканям, которые они моделируют, что делает их многообещающими инструментами в доклинической разработке лекарств2.
Основным преимуществом культуры клеток человека по сравнению с нечеловеческими моделями in vivo является способность воспроизводить специфические тонкости метаболизма человека, которые могут значительно различаться даже между позвоночными более высокого порядка, такими как люди и мыши3. Однако эта специфичность может быть омрачена потерей сложности тканей; Так обстоит дело с тканью сетчатки, где несколько типов клеток причудливо переплетаются и имеют уникальное симбиотическое метаболическое взаимодействие между клеточными подтипами, которое не может быть воспроизведено в монокультуре4. Человеческие органоиды, которые обеспечивают факсимиле сложных тканей человека с доступностью и масштабируемостью клеточной культуры, имеют потенциал для преодоления недостатков этих платформ моделирования заболеваний.
Органоиды сетчатки, полученные из стволовых клеток, оказались особенно точными при моделировании сложной ткани нервной сетчаткичеловека 5. Это сделало органоидную модель сетчатки перспективной технологией для изучения и лечения заболеваний сетчатки 6,7. На сегодняшний день большая часть моделирования заболеваний в органоидах сетчатки сосредоточена на моногенных заболеваниях сетчатки, где органоиды сетчатки происходят из линий iPSC с болезнетворными генетическими вариантами7. Как правило, это высокопроникающие мутации, которые проявляются в виде фенотипов развития. Меньше работы было эффективно сделано для лечения болезней старения, когда генетические мутации и стрессоры окружающей среды влияют на ткани, которые развиваются нормально. Нейродегенеративные заболевания старения могут иметь сложное генетическое наследование и вклад стрессоров окружающей среды, которые по своей природе трудно моделировать с использованием краткосрочных клеточных культур. Однако во многих случаях эти сложные заболевания могут объединяться с общими клеточными или метаболическими стрессорами, которые при тестировании на полностью развитой ткани человека могут дать мощное представление о нейродегенеративных заболеваниях старения8.
Дегенеративное заболевание желтого пятна с поздним началом, макулярная телеангиэктазия типа II (MacTel), является отличным примером генетически сложного нейродегенеративного заболевания, которое объединяется с общим метаболическим дефектом. MacTel - это редкое дегенеративное заболевание сетчатки старения, которое приводит к потере фоторецепторов и глии Мюллера в макуле, что приводит к прогрессирующей потере центрального зрения 9,10,11,12,13. В MacTel неопределенное, возможно, многофакторное генетическое наследование приводит к общему снижению циркулирующего серина у пациентов, что приводит к увеличению нейротоксичных видов липидов, называемых дезоксисфинголипидами (deoxySL)14,15. Чтобы доказать, что накопление deoxySL токсично для сетчатки, и проверить потенциальную фармацевтическую терапию, мы разработали этот протокол для анализа токсичности фоторецепторов в органоидах сетчатки человека14.
Здесь мы описываем конкретный протокол для дифференциации органоидов сетчатки человека, установления токсичности и спасательного анализа с использованием органоидов и количественной оценки результатов. Мы приводим успешный пример, когда мы определяем тканеспецифическую токсичность подозреваемого болезнетворного агента, дезоксиSL, и подтверждаем использование безопасного непатентованного препарата, фенофибрата, для потенциального лечения дезоксиSL-индуцированной токсичности сетчатки. Предыдущая работа показала, что фенофибрат может увеличивать деградацию дезоксиSL и снижать циркулирующий дезоксиSL у пациентов, однако его эффективность в снижении дезоксиSL-индуцированной токсичности сетчатки не проверялась16,17. Хотя мы представляем конкретный пример, этот протокол может быть использован для оценки влияния любого количества метаболических/экологических стрессоров и потенциальных терапевтических препаратов на ткань сетчатки.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125mL Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-deoxysphinganine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver 6900 Mini-Blade</td>
			<td>Beaver-Visitec</td>
			<td>BEAVER6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>A32794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, Heat Inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45001-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenofibrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Recoverin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Plus- O.C.T. compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>62534-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield-mounting medium</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wax pen-ImmEdge</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery

Органоиды обеспечивают многообещающую платформу для изучения механизма заболевания и методов лечения непосредственно в контексте тканей человека с универсальностью и пропускной способностью клеточной культуры. Зрелые органоиды сетчатки человека используются для скрининга потенциальных фармацевтических препаратов для лечения возрастного дегенеративного заболевания сетчатки макулярной телеангиэктазии типа 2 (MacTel).
Недавно мы показали, что МакТел может быть вызван повышенным уровнем атипичных видов липидов, дезоксисфинголипидов (дезоксиSL). Эти липиды токсичны для сетчатки и могут привести к потере фоторецепторов, которая происходит у пациентов MacTel. Чтобы проверить лекарства на их способность предотвращать токсичность фоторецепторов deoxySL, мы сгенерировали органоиды сетчатки человека из линии плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), не индуцированной MacTel, и созрели до постмитотического возраста, когда они развивают все клетки сетчатки, полученные от нейронной линии, включая функционально зрелые фоторецепторы. Органоиды сетчатки обрабатывали метаболитом дезоксиSL, а апоптоз измеряли в слое фоторецепторов с использованием иммуногистохимии. Используя эту модель токсичности, были проверены фармакологические соединения, которые предотвращают гибель фоторецепторов, индуцированную дезоксиSL. Используя целевой подход-кандидат, мы определили, что фенофибрат, препарат, обычно назначаемый для лечения высокого уровня холестерина и триглицеридов, также может предотвращать токсичность дезоксиSL в клетках сетчатки.
Скрининг токсичности успешно идентифицировал одобренный FDA препарат, который может предотвратить гибель фоторецепторов. Это прямой практический вывод благодаря протестированной модели, имеющей отношение к заболеваниям. Эта платформа может быть легко модифицирована для тестирования любого количества метаболических стрессоров и потенциальных фармакологических вмешательств для будущих открытий лечения заболеваний сетчатки.

Органоиды сетчатки были получены из контрольной линии iPSC, не относящейся к MacTel. После того, как органоиды достигли 26 недель в культуре, они были отобраны и разделены на экспериментальные группы. Органоиды обрабатывали различными концентрациями дезоксиСА, чтобы определить, токситен ли ?...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery at JoVE.com

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Здесь мы представляем пошаговый протокол для создания зрелых органоидов сетчатки человека и использования их в анализе токсичности фоторецепторов для выявления фармацевтических кандидатов для возрастного дегенеративного заболевания сетчатки макулярной телеангиэктазии типа 2 (MacTel).

Скрининг токсичности органоидов сетчатки человека для фармацевтических открытий

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Этот протокол обеспечивает доклинический подход к обнаружению и валидации фармацевтических методов лечения метаболических заболеваний сетчатки непосредственно в тканях сетчатки человека. Этот метод сочетает в себе сложность метаболизма в тканях человека с универсальностью и пропускной способностью клеточной культуры. Мы использовали этот анализ для получения доклинических данных для лечения дегенеративного заболевания сетчатки, MacTel, с использованием распространенного и безопасного препарата, изменяющего липиды, фенофибрата, который в настоящее время находится в клинических испытаниях безопасности.Этот подход может быть применен к любому количеству распространенных стрессоров сетчатки, которые приводят к заболеванию, включая дефицит питательных веществ, гипоксию, световую токсичность и другие токсичные липиды. На 24-й неделе культуры проверьте органоиды на предмет образования рудиментарных сегментов на внешней стороне органоида. К 26-28 неделе внешние сегменты должны образовать толстый слой.Когда можно наблюдать утолщенный сегмент сомневающегося, разбавьте один миллимолярный исходный раствор дезоксиСА до 0,51. Одна и две микромолярные концентрации в трех миллилитрах среды дифференцировки сетчатки плюс. Используя диссекционный микроскоп и стерильный зонд, выберите четыре группы органоидов примерно одинакового размера и формы с минимум пятью органоидами в каждой группе и разделите группы на отдельные лунки со сверхнизкой прикрепленностью 6-луночной пластины.Когда все органоиды будут собраны, удалите как можно больше среды из каждой лунки и добавьте одну концентрацию раствора дезоксиСА в каждую лунку. Добавьте управление транспортным средством к четвертой группе органоидов. После двух дней культивирования замените надосадочные жидкости на соответствующий свежий дезоксиСА или контрольное разведение.После четырех дней культивирования встройте криосекцию и окрасьте органоиды в соответствии со стандартными протоколами, чтобы можно было оценить гибель клеток в каждой культуре. После окрашивания используйте пяти-10-кратное увеличение, чтобы найти область нарезанного среза органоида, которая не повреждена, хорошо сформирована и находится в плоскости, которая отбирает репрезентативное поперечное сечение органоида. Срез должен иметь отчетливый внешний ядерный слой фоторецепторов, толщиной не менее нескольких клеток, и отдельный и отчетливый слой ядер, которые не имеют восстановления и окрашивания.Кадрируйте изображение и увеличьте увеличение до 20x. Затем снова поместите слайд в рамку, чтобы заполнить изображение как можно большей частью фоторецепторного слоя. Установите плоскость Z и установите нижние границы нижнего предела Z-диапазона, чтобы получить изображение всей глубины среза.Затем сфотографируйте все три канала флуорофора в Z-стеке и сохраните изображение в формате файла, который сохраняет соотношение площади на пиксель. Чтобы количественно оценить количество мертвых клеток в каждом образце, откройте стеки изображений на Фиджи. В окне параметров импорта формата bio убедитесь, что в разделе «Разделение на отдельные окна» не установлены флажки, и выберите «Изображение», «Стеки» и «Проект Z», чтобы создать новое изображение для количественной оценки.Выберите канал изображения, который показывает восстановление и окрашивание, и используйте инструмент выделения многоугольника, чтобы очертить непрерывную область фоторецепторов на изображении. Нажмите кнопку «Анализ и установка измерений» и установите флажок «Площадь». Нажмите «Анализ и измерение», чтобы измерить площадь фоторецепторов, чтобы подсчитать умирающие клетки.Измерение появится во всплывающем окне. Чтобы подсчитать положительные ядра апоптоза в выбранной области фоторецепторов, щелкните правой кнопкой мыши инструмент «Точка», чтобы выбрать многоточечный инструмент и выбрать положительное окрашивание апоптоза, которое перекрывается с положительными ядрами DAPI, и восстановление и окрашивание. Переключайтесь между каналами для проверки положительных клеток.Затем разделите количество клеток, положительных для апоптоза, на площадь, чтобы получить нормализованное значение гибели клеток в фоторецепторах на органоид. После определения концентрации дезоксиСА, которая индуцирует гибель клетки-мишени, используйте стерильный зонд, чтобы выбрать три группы органоидов примерно одинакового размера и формы с минимум пятью органоидами в группе. И добавляем группы к отдельным лункам сверхнизкой присадки 6-луночной пластины.Добавьте целевую концентрацию гибели клеток deoxySA, целевую концентрацию гибели клеток deoxySA, дополненную интересующим лекарственным средством или контрольной средой, в соответствующую лунку или органоиды. Через двое суток замените надосадочную жидкость в каждой лунке соответствующей концентрацией свежей обработочной или контрольной среды. После четырех дней культивирования оцените культуры на гибель клеток, как показано.В этом репрезентативном анализе органоиды сетчатки, полученные из немакулярной телеангиэктазии типа 2, индуцированной индуцированной плюрипотентной линией стволовых клеток, обрабатывали четырьмя концентрациями дезоксиСА. Гибель клеток в ответ на дезоксиСА зависела от концентрации и обнаруживалась всего в 50 наномолярных дезоксиСА. Самая высокая протестированная концентрация вызывала устойчивую гибель клеток, сохраняя при этом целостность органоида сетчатки.Лечение 20-микромолярным фенофибратом предотвращало индуцированную дезоксиСА токсичность в фоторецепторах органоидов сетчатки, значительно снижая гибель клеток примерно на 80% после четырех дней лечения. Не забудьте выбрать хорошо сформированные и здоровые органоиды, чтобы убедиться, что анализ проводится в клетках сетчатки. Органоиды могут быть обработаны для сбора РНК для количественной оценки экспрессии генов, что позволяет оценивать сигналы стресса и проверять токсические эффекты и спасения.Используя этот метод, мы смогли проанализировать последующий метаболизм нескольких различных липидов в органоидах, открыв изучение липидного обмена в сетчатке человека.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Флуоресцентные наночастицы для измерения концентрации ионов в биологических системах

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: Автоматизированная платформа для биомассы Открытие ферментов и коктейль-оптимизации

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Доставка генов и Трансфекция в человеческий рак поджелудочной железы клетки, используя эпидермального фактора роста рецепторов ориентированных Желатин основе Engineered Nanovectors

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Полимерные Microarrays высоких Discovery Пропускная биоматериалов

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Низкая молекулярная масса белка Обогащение на мезопористых тонких пленок кремния для биомаркеров Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Выделение первичных клеток сетчатки сетчатки (RGCs) проточной цитометрией

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic подложке для инженерных васкуляризированной ткани и Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Репрессии транскрипции гена, перенаправив клеточными с химической эпигеномные модификаторы

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Люцифер желтый - Надежный параклеточной проницаемости маркер а в клеточной модели человеческого кровяного мозга барьер

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...