Name: toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00
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Con el apoyo del Instituto de Investigación Médica Lowy. Nos gustaría agradecer a la familia Lowy por su apoyo al proyecto MacTel. Nos gustaría agradecer a Mari Gantner, Mike Dorrell y Lea Scheppke por su aporte intelectual y asistencia en la preparación del manuscrito.

1. Descongelación, paso y expansión de iPSCs/ESCs
NOTA: Para todos los pasos de cultivo celular, utilice las mejores prácticas para mantener un cultivo celular estéril.
<ol><li>Cubra una placa de cultivo celular de 6 pocillos con medio de matriz de membrana basal.<ol><li>Para preparar 1x de este medio, siga las especificaciones del producto o diluya el medio de matriz fría de 75 μL con 9 ml de DMEM/F12. Agregue 1.5 ml de 1x medio recién preparado por pocillo en un plato de 6 pocillos....

<ol>
	<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies.">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li><li>Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+tissues+and+strategies+to+overcome+challenges+in+drug+development.">Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development.</a> Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).</li><li>Demetrius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men.+When+it+comes+to+studying+ageing+and+the+means+to+slow+it+down,+mice+are+not+just+small+humans.">Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans.</a> EMBO Reports. , 39-44 (2005).</li><li>Lindsay, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+kinase+and+aspartate-glutamate+carrier+distributions+reveal+key+metabolic+links+between+neurons+and+glia+in+retina.">Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).</li><li>Cowan, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+juxtafoveolar+retinal+telangiectasis.+Update+of+classification+and+follow-up+study.">Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study.</a> Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).</li><li>Klein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+macular+telangiectasia+type+2+in+the+Beaver+Dam+eye+study.">The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study.</a> American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Muller's+cells+and+photoreceptors+in+macular+telangiectasia+type+2.">Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2.</a> Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).</li><li>Gantner, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+and+lipid+metabolism+in+macular+disease+and+peripheral+neuropathy.">Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy.</a> New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).</li><li>Scerri, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analyses+identify+common+variants+associated+with+macular+telangiectasia+type+2.">Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2.</a> Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).</li><li>Alecu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+1-deoxysphingolipids+are+metabolized+by+a+cytochrome+P450-dependent+pathway.">Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway.</a> Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).</li><li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients:+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy.">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li><li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs.">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047 (2014).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells.">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766 (2017).</li><li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines.">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation.">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li><li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields.">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).</li></ol>

Variaciones del protocolo de diferenciación Desde la invención de las copas ópticas autoformadas por el grupo20 de Yoshiki Sasai, muchos laboratorios han desarrollado protocolos para generar organoides retinianos que pueden variar en casi todos los pasos 5,18,19,21. Una lista exhaustiva de protocolos se puede encontrar en Capowski et <sup class="xr...

El modelado de enfermedades humanas en cultivos celulares y modelos animales ha proporcionado herramientas invaluables para el descubrimiento, modificación y validación de terapias farmacológicas, lo que les permite avanzar del fármaco candidato a la terapia aprobada. Aunque una combinación de modelos in vitro y no humanos in vivo ha sido durante mucho tiempo un componente crítico de la línea de desarrollo de fármacos, con frecuencia no logran predecir el rendimiento clínico de los nuevos candidatos a fármacos1. Existe una clara necesidad de desarrollar tecnologías que cierren la brecha entre los monocultivos celulares humanos simplistas y los ensayos clínicos. Los recientes avances tecnológicos en cultivos de tejidos tridimensionales autoorganizados, los organoides, han mejorado su fidelidad a los tejidos que modelan, convirtiéndolos en herramientas prometedoras en la línea de desarrollo preclínicode fármacos 2.
Una ventaja importante del cultivo de células humanas sobre los modelos in vivo no humanos es la capacidad de replicar las complejidades específicas del metabolismo humano que pueden variar considerablemente incluso entre vertebrados de orden superior como humanos y ratones3. Sin embargo, esta especificidad puede verse eclipsada por una pérdida en la complejidad del tejido; Tal es el caso del tejido retiniano, donde múltiples tipos de células están intrincadamente entrelazadas y tienen una interacción metabólica simbiótica única entre subtipos celulares que no pueden replicarse en un monocultivo4. Los organoides humanos, que proporcionan un facsímil de tejidos humanos complejos con la accesibilidad y escalabilidad del cultivo celular, tienen el potencial de superar las deficiencias de estas plataformas de modelado de enfermedades.
Los organoides retinianos derivados de células madre han demostrado ser particularmente fieles en el modelado del complejo tejido de la retina neural humana5. Esto ha hecho del modelo organoide retiniano una tecnología prometedora para el estudio y tratamiento de la enfermedad retiniana 6,7. Hasta la fecha, gran parte del modelado de la enfermedad en organoides retinianos se ha centrado en enfermedades retinianas monogénicas donde los organoides retinianos se derivan de líneas iPSC con variantes genéticas causantes de enfermedades7. Estas son generalmente mutaciones altamente penetrantes que se manifiestan como fenotipos de desarrollo. Se ha realizado menos trabajo de manera efectiva en enfermedades del envejecimiento donde las mutaciones genéticas y los factores estresantes ambientales afectan el tejido que se ha desarrollado normalmente. Las enfermedades neurodegenerativas del envejecimiento pueden tener una herencia genética compleja y contribuciones de factores estresantes ambientales que son inherentemente difíciles de modelar utilizando cultivos celulares a corto plazo. Sin embargo, en muchos casos, estas enfermedades complejas pueden unirse en factores estresantes celulares o metabólicos comunes que, cuando se prueban en un tejido humano completamente desarrollado, pueden proporcionar información poderosa sobre las enfermedades neurodegenerativas del envejecimiento8.
La enfermedad degenerativa macular de inicio tardío, la telangiectasia macular tipo II (MacTel), es un gran ejemplo de una enfermedad neurodegenerativa genéticamente compleja que se fusiona en un defecto metabólico común. MacTel es una enfermedad degenerativa retiniana poco común del envejecimiento que resulta en la pérdida de fotorreceptores y glía de Müller en la mácula, lo que lleva a una pérdida progresiva en la visión central 9,10,11,12,13. En MacTel, una herencia genética indeterminada, posiblemente multifactorial, impulsa una reducción común de la serina circulante en los pacientes, lo que resulta en un aumento de una especie lipídica neurotóxica llamada desoxiesfingolípidos (deoxySL)14,15. Para probar que la acumulación de deoxySL es tóxica para la retina y validar posibles terapias farmacéuticas, desarrollamos este protocolo para evaluar la toxicidad de los fotorreceptores en organoides retinianos humanos14.
Aquí esbozamos un protocolo específico para diferenciar los organoides retinianos humanos, establecer un ensayo de toxicidad y rescate utilizando organoides y cuantificar los resultados. Proporcionamos un ejemplo exitoso en el que determinamos la toxicidad específica del tejido de un agente sospechoso de causar enfermedades, deoxySL, y validamos el uso de un medicamento genérico seguro, fenofibrato, para el tratamiento potencial de la toxicidad retiniana inducida por deoxySL. Trabajos previos han demostrado que el fenofibrato puede aumentar la degradación de deoxySL y disminuir el deoxySL circulante en pacientes, sin embargo, su eficacia en la reducción de la toxicidad retiniana inducida por deoxySL no ha sido probada16,17. Aunque presentamos un ejemplo específico, este protocolo se puede utilizar para evaluar el efecto de cualquier número de factores estresantes metabólicos / ambientales y posibles fármacos terapéuticos en el tejido de la retina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125mL Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89095-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-deoxysphinganine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>860493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver 6900 Mini-Blade</td>
			<td>Beaver-Visitec</td>
			<td>BEAVER6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>A32794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, Heat Inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45001-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenofibrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 16% Formaldehyde</td>
			<td>Thermo-fisher</td>
			<td>28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Recoverin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SE1M179M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Plus- O.C.T. compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>62534-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>29443-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration System</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield-mounting medium</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wax pen-ImmEdge</td>
			<td>vector Labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity screens in human retinal organoids for pharmaceutical discovery

Los organoides proporcionan una plataforma prometedora para estudiar el mecanismo y los tratamientos de la enfermedad, directamente en el contexto del tejido humano con la versatilidad y el rendimiento del cultivo celular. Los organoides retinianos humanos maduros se utilizan para detectar posibles tratamientos farmacéuticos para la enfermedad degenerativa de la retina relacionada con la edad telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).
Recientemente hemos demostrado que MacTel puede ser causado por niveles elevados de una especie lipídica atípica, los desoxiesfingolípidos (deoxySLs). Estos lípidos son tóxicos para la retina y pueden conducir a la pérdida de fotorreceptores que se produce en pacientes con MacTel. Para detectar la capacidad de los fármacos para prevenir la toxicidad de los fotorreceptores deoxySL, generamos organoides retinianos humanos a partir de una línea de células madre pluripotentes (iPSC) no inducida por MacTel y los maduramos hasta una edad postmitótica en la que desarrollan todas las células derivadas del linaje neuronal de la retina, incluidos los fotorreceptores funcionalmente maduros. Los organoides retinianos se trataron con un metabolito deoxySL y la apoptosis se midió dentro de la capa fotorreceptora mediante inmunohistoquímica. Utilizando este modelo de toxicidad, se examinaron compuestos farmacológicos que previenen la muerte de los fotorreceptores inducida por desoxiSL. Utilizando un enfoque de candidato dirigido, determinamos que el fenofibrato, un fármaco comúnmente prescrito para el tratamiento del colesterol alto y los triglicéridos, también puede prevenir la toxicidad del desoxiSL en las células de la retina.
La prueba de toxicidad identificó con éxito un medicamento aprobado por la FDA que puede prevenir la muerte de los fotorreceptores. Este es un hallazgo directamente procesable debido al modelo altamente relevante para la enfermedad probado. Esta plataforma se puede modificar fácilmente para probar cualquier número de factores estresantes metabólicos y posibles intervenciones farmacológicas para el futuro descubrimiento de tratamientos en enfermedades de la retina.

Los organoides retinianos se generaron a partir de una línea iPSC de control no MacTel. Después de que los organoides alcanzaron las 26 semanas en cultivo, fueron seleccionados y divididos en grupos experimentales. Los organoides fueron tratados con concentraciones variables de deoxySA para determinar si deoxySA es tóxico para los fotorreceptores. Se probaron cuatro concentraciones de deoxySA, de 0 a 1 μM (Figura 2) y se trataron organoides durante 8 días, con cambios en los medios cada...

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Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Aquí presentamos un protocolo paso a paso para generar organoides retinianos humanos maduros y utilizarlos en un ensayo de toxicidad de fotorreceptores para identificar candidatos farmacéuticos para la enfermedad degenerativa de la retina relacionada con la edad telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).

Pruebas de toxicidad en organoides retinianos humanos para el descubrimiento farmacéutico

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Este protocolo proporciona un enfoque preclínico para descubrir y validar tratamientos farmacéuticos para las enfermedades metabólicas de la retina directamente dentro del tejido retiniano humano. Esta técnica combina la complejidad del metabolismo en los tejidos humanos con la versatilidad y el rendimiento del cultivo celular. Hemos utilizado este ensayo para adquirir datos preclínicos para el tratamiento de la enfermedad degenerativa de la retina, MacTel, utilizando un fármaco alterador de lípidos común y seguro, fenofibrato, que ahora se encuentra en ensayos clínicos de seguridad.Este enfoque se puede aplicar a cualquier número de factores estresantes retinianos comunes que conducen a enfermedades, incluida la deficiencia de nutrientes, hipoxia, toxicidad lumínica y otros lípidos tóxicos. En la semana 24 de cultivo, revise los organoides para detectar la formación de segmentos rudimentarios en el exterior del organoide. Para la semana 26 a 28, los segmentos externos deberían haber formado una capa gruesa.Cuando se pueda observar un segmento escéptico engrosado, diluir una solución madre de desoxiSA milimolar a 0,51. Una y dos concentraciones micromolares en tres mililitros de medio de diferenciación retiniana más. Usando un microscopio de disección y una sonda estéril, seleccione cuatro grupos de organoides de aproximadamente el mismo tamaño y forma con un mínimo de cinco organoides por grupo, y divida los grupos en pocillos individuales de una placa de 6 pocillos de unión ultrabaja.Cuando se hayan recolectado todos los organoides, retire la mayor cantidad posible de medio de cada pocillo y agregue una concentración de la solución de desoxiSA a cada pocillo. Agregue el control del vehículo al cuarto grupo de organoides. Después de dos días de cultivo, reemplace los sobrenadantes de cultivo con el desoxiSA fresco apropiado o la dilución de control.Después de cuatro días de cultivo, incrustar la criosección y teñir los organoides de acuerdo con los protocolos estándar para permitir la evaluación de la muerte celular dentro de cada cultivo. Después de la tinción, use un aumento de cinco a 10x para localizar una región de la sección organoide cortada que esté intacta, bien formada y en un plano que muestree una sección transversal representativa del organoide. La sección debe tener una capa nuclear externa distinta de fotorreceptores que tenga al menos unas pocas células de espesor, y una capa separada y distinta de núcleos que no tengan recuperación y tinción.Encuadre la imagen y aumente la ampliación a 20x. A continuación, encuadre la diapositiva de nuevo para rellenar la imagen con la mayor cantidad posible de la capa fotorreceptora. Defina el plano Z y establezca los límites inferiores del extremo superior del rango Z para obtener imágenes de toda la profundidad del sector.A continuación, cree una imagen de los tres canales de fluoróforo en una adquisición de pila Z y guarde la imagen en un formato de archivo que conserve la proporción de área por píxel. Para cuantificar el número de células muertas en cada muestra, abra las pilas de imágenes en Fiji. En la ventana de opciones de importación del formato de bio, confirme que no hay casillas marcadas en la sección de división en ventanas separadas y seleccione Imagen, Pilas y Proyecto Z para crear una nueva imagen para la cuantificación.Seleccione el canal de imagen que muestra la recuperación y tinción y utilice la herramienta de selección de polígonos para delinear una región continua de fotorreceptores en la imagen. Haga clic en Analizar y establecer medidas y seleccione el cuadro Área. Haga clic en Analizar y medir, para medir el área de los fotorreceptores, para contar las células moribundas.La medición aparecerá en una ventana emergente. Para contar los núcleos positivos de apoptosis en la región fotorreceptora seleccionada, haga clic derecho en la herramienta de punto para seleccionar la herramienta multipunto y seleccione la tinción positiva de apoptosis que se superpone con un núcleo DAPI positivo y recuperar y teñir. Alterna entre los canales para validar las células positivas.Luego divida el número de células positivas para la apoptosis por el área para obtener un valor normalizado para la muerte celular dentro de los fotorreceptores por organoide. Después de determinar la concentración de deoxySA que induce la muerte de la célula diana, utilice una sonda estéril para seleccionar tres grupos de organoides de aproximadamente el mismo tamaño y forma con un mínimo de cinco organoides por grupo. Y agregue los grupos a pocillos individuales de una placa de 6 pocillos de fijación ultra baja.Añadir la concentración de muerte celular diana de deoxySA, la concentración de muerte celular diana de deoxySA suplementada con el fármaco de interés o el medio de control al pocillo u organoides apropiados. Después de dos días, reemplace el sobrenadante en cada pocillo con la concentración adecuada de tratamiento fresco o medio de control. Después de cuatro días de cultivo, evaluar los cultivos para la muerte celular como se demostró.En este análisis representativo, los organoides retinianos generados a partir de una línea de células madre pluripotentes inducida por control de telangiectasia no macular tipo 2 se trataron con cuatro concentraciones de deoxySA. La muerte celular en respuesta a deoxySA fue dependiente de la concentración y detectable en tan solo 50 nanomolares de desoxySA. La concentración más alta probada indujo una muerte celular robusta mientras se mantiene la integridad del organoide retiniano.El tratamiento con fenofibrato 20 micromolares evitó la toxicidad inducida por deoxySA en los fotorreceptores de los organoides retinianos, reduciendo significativamente la muerte celular en aproximadamente un 80% después de cuatro días de tratamiento. Recuerde seleccionar organoides bien formados y sanos para asegurarse de que el ensayo se realiza en células de la retina. Los organoides pueden ser procesados para la recolección de ARN para cuantificar la expresión génica, permitiendo la evaluación de señales de estrés y la validación de efectos tóxicos y rescates.Usando esta técnica, hemos podido evaluar el metabolismo posterior de múltiples lípidos diferentes en organoides, abriendo el estudio del metabolismo de los lípidos en las retinas humanas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Las nanopartículas fluorescentes para la Medición de la concentración de iones en sistemas biológicos

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Investigación

Bioingeniería

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

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The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

Entrega y transfección de genes en células humanas de cáncer de páncreas con factor de crecimiento epidérmico receptor dirigidos a base de gelatina Nanovectors Ingeniería

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

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Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

De bajo peso molecular de proteínas en el enriquecimiento de las películas delgadas de silicio mesoporosos para el descubrimiento de biomarcadores

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To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

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